Экс Vivo Препараты неповрежденной вомероназального органа и аксессуаров обонятельная луковица

Резюме

Мышь аксессуар обонятельная луковица (АОВ) было трудно изучать в контексте сенсорной кодирования. Здесь мы демонстрируем рассечение, который производит Экс Vivo препарат, в котором AOB нейроны остаются функционально связан с их периферийных входов, содействия научным исследованиям в обработке информации феромонов мыши и kairomones.

Аннотация

Мышь аксессуар обонятельная система (АОС) является специализированным сенсорная тропа для обнаружения энергонезависимые социальные запахи, феромоны и kairomones. Первый нейронной цепи в пути AOS, называется аксессуар обонятельная луковица (АОВ), играет важную роль в установлении секс-типичный поведения, такие как территориальной агрессии и спаривания. Этот небольшой (<1 мм ³⁾ схема обладает способностью различать уникальные поведенческие состояния, такие как секс, процедить, и стресс от хемосенсорных киев в выделениями и экскрементами из сородичей. В то время как компактный организация этой системы представляет уникальные возможности для записи с большими участками цепи одновременно, исследование сенсорной обработки в АОБ остается сложной, во многом благодаря его экспериментально невыгодное расположение в мозгу. Здесь мы демонстрируем многоступенчатую рассечение, которое удаляет нетронутыми AOB в пределах одного полушария переднего черепа мыши, оставляя подключенияионы в обеих периферической вомероназальных сенсорных нейронов (VSNs) и местного нейронной цепи нетронутыми. Процедура предоставляет поверхность AOB направить визуальный осмотр, облегчая электрофизиологических и оптические записи из элементов АОБ цепи в отсутствие анестетиков. После вставки тонкий канюли в вомероназального органа (ВНО), в котором находится VSNs, можно непосредственно подвергать периферию к социальным запахов и феромонов время записи вниз по течению активность в АОБ. Эта процедура позволяет контролируемых расследований AOS обработки информации, которые могут пролить свет на механизмы, связывающие феромона рисков в случае изменения поведения.

Введение

Сенсорная обработка в мозге млекопитающих обычно занимает несколько взаимно соединенных-нейрональные цепи, каждая из которых извлекает особенности от сенсорного ввода. В сенсорных путей, рано обработки информации является жизненно важным для нормального восприятия и поведения. В принадлежностей обонятельной системы (AOS), аксессуар обонятельная луковица (АОВ) является основным нейронной цепи увязки сенсорную периферию для последующих структур, которые диктуют гормональный баланс ^1,2, агрессию ³ и возбуждение ^4. Таким образом, обработка информации в рамках этой схемы, тесно связана с изменениями в поведении животных.

Аксессуар обонятельная луковица находится у мышей и крыс в спинной / хвостовой / задней поверхности основного обонятельной луковице (MOB) под плотным, васкуляризации носовой пазухи. АОВ получает афферентный иннервации от аксонов периферических вомероназальных сенсорных нейронов (VSNs), которые находятся в вомероназального органа (ВНО), маленькийл слепой состава трубки в передней морды чуть выше мягкого неба. Эти аксоны пересекают тонкий лист перегородки ткани на медиальной границе носовые проходы. Несколько исследований исследовали AOB нервные реакции к источникам AOS запахов (например, мыши мочи) в естественных условиях с использованием анестезированных мышей ^5-7 или свободно-исследуя животных ^8. Героическая наркозом в естественных условиях исследования, участвующих (а) tracheotomies для обеспечения глубокого наркоза и предотвращения аспирации жидкости стимулов ^5-7, (б) стимуляции симпатической шейного ганглия ⁶ или прямой катетеризации вомероназального органа ^5,7 ввести энергонезависимые запахи и (с) краниотомии с или без лобных абляции лепестков, чтобы электрода продвижение в АОБ ^6. Пробудитесь / себя исследования ^8-10 участвующие хирургической имплантации микродисков. В целом, эти экспериментальные парадигмы являются мощным, но крайне сложно и часто требует анестезии.

Интересно, несколько исследований пытался сохранить сенсорные структуры и вниз по течению нейронных цепей живых вне тела (экс естественных условиях) с некоторым успехом ^11-15. Поскольку связи между ВНО и АОБ остаются на той же стороне, и потому, что по средней линии перегородки ткань может подвергаться воздействию кислородом superfusate в одном полушарии, мы стремились разработать такую ​​одного полушария Экс Vivo подход, чтобы изолировать эти структуры при сохранении их функциональную связь. Недавно мы преуспели в достижении этой цели ^16. Этот препарат сохраняет обе VNO и АОВ в живых и функционально соединен, по крайней мере 4 - 6 ч, так как оба аксоны (вдоль средней линии мягкой ткани перегородки АОВ) и сравнительно мелкой <600 мкм особенности, которые доступны для орошали кислородом искусственную спинномозговую жидкость ( ACSF). Это ВНО-АОВ экс естественных подготовка позволяет введение контролируемой стимулы в ВНО через тонкий катетер, ипрямого визуального доступа к небольшой АОБ для целенаправленной размещения электродов и / или живой флуоресцентной микроскопии. Этот способ является предпочтительным, если кто-то желает изучать эти схемы в отсутствие анестезии. Поскольку такой подход разрывает центробежные связи, он не очень хорошо подходит для расследований центробежной модуляции функции АОБ. ВНО-АОВ экс естественных подготовка трудно учиться, но как только достигнут производит надежную платформу, на которой по расследованию организации цепи, обработки информации и нейронной пластичности в этой мощной сенсорной цепи.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Юго-Западного институционального комитета UT уходу и использованию животных на, и были выбраны таким образом, чтобы свести к минимуму стресс, дискомфорт и боли, испытываемой экспериментальных животных.

1. Вскрытие палата

Пользовательский рассечение камера и небольшой, тонкий пластик доска необходимы для достижения наилучших результатов (рис. 1). Построить или получить такую ​​камеру заранее пытается этот протокол.

2. Препарирование Решения

1. Подготовка 1 л стандартной искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) для использования в шагах 3.22-5.4. Добавить NaCl 125 мм, KCl 2,5 мм, CaCl ₂ 2 мм, MgCl ₂ 1 мм, NaHCO ₃ 25 мм, NaH ₂ PO ₄ 1,25 мм, мио-инозитол 3 мм, пируват натрия 2 мм, аскорбат натрия 0,4 мм, и глюкозы 25 мМ до 1 л пирогенов воды.
2. Подготовка начальное рассечение ACSF (200 мл) в течениеиспользовать в шагах 3.3-3.22. Возьмите 200 мл Standard ACSF и повысить концентрацию MgCl ₂ по 9 мм, добавив 0,366 г MgCl ₂ гексагидратом.
3. Приготовьте раствор стандартного Рингера нести стимулы к ВНО через канюли для использования на этапах 4.11-5.4 содержащей NaCl 115 мм, KCl, 5 мм, CaCl _2, 2 мм, MgCl _2, 2 мм, NaHCO ₃ 25 мм, HEPES 10 мм, глюкоза 10 мм.
4. Пузырь 0.8 л стандартной ACSF и 0,5 л Рингера с 95% О _2, 5% СО ₂ газа в бане 37 ° С на водяной течение как минимум 15 мин до использования.
5. Пузырь в 200 мл исходной рассечение ACSF с 95% O _2, 5% СО ₂ газ на льду в течение 15-20 мин, пока не достигнет 4 ° С.

3. Первичная Рассечение

1. Подготовьте область рассечение. Поместите три блюда 35 мм Петри, кислородом ACSF, обезглавливающий ножницы, изогнутые рассекает ножницы, прямые рассечения ножницы, Adson щипцы, с # 11 головыэль лезвие и ручка и лезвие на льду.
2. После кислородом ACSF остынет до 4 ° С, глубоко обезболить животное в высыхания камеры, используя 2-5 мл Isothesia (99,9% изофлуораном). Выполните хвост и ноги тесты прижимные для обеспечения животное глубоко под наркозом.
3. После того, как глубоко анестезия подтвердил, обезглавить животное и немедленно поместить голову в чашке Петри, заполненной охлажденной рассечение ACSF. ПРИМЕЧАНИЕ: Погрузите ткань в охлажденной рассечение ACSF чтобы держать его прохладным на протяжении всей процедуры, когда он не используется.
4. Снимите нижнюю аспект (вентральной глотки, нижней челюсти и языка) с изогнутыми ножницами.
5. Использование Adson щипцов deglove (корки) поверхностную кожу и мышечные вложения из черепа. Пил кожу головы от хвостового чтобы ростральнее пока единственный месте прикрепления не закончится передних зубов. Разрежьте ткань в точке крепления с помощью изогнутой ножницы. Удалить глаза, держа его пинцетом и вытащить его от подготовки. Nухо конец скальпирующий процедуры избежать избыточного усилие на деликатной носового хряща с помощью щипцов Adson к свободным вложений мускулатуры из верхних челюстных костей. ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите кожу головы от каудальной части черепа с прямыми ножницами.
6. С прямыми ножницами, сократить среднюю линию черепа из каудальнее ростральнее пока кончики ножницами не несколько миллиметров в лобных костей (только до начала носовой пазухи).
7. Снимите теменной и лобной кости черепа, используя Adson щипцов. ПРИМЕЧАНИЕ: Кусочки лобной кости часто остаются прикрепленными к носовых костей хвостовых к носовой пазухи. Удалить эти куски с осторожностью, принятые не связываться обонятельные луковицы.
8. Используйте скальпель, чтобы сделать корональной разрез через лобной доли 2 мм каудально пазух, а затем удалить хвостового мозга, чтобы разреза. Убедитесь, что кончик скальпеля контактов костлявая контурных вентральной черепа, чтобы полностью разорвать заднюю ткани. ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяетудаление большинства мозга, не подвергая механической нагрузки на боковых обонятельных путей или обонятельных луковиц.
9. Удалить открытые каудальные аспекты брюшной черепа с прямыми ножницами. Оставьте пазух и оставшиеся нервную ткань.
10. Удалить скуловой дуги и мышцы лица на анатомической правой стороне черепа, используя прямые ножницы
11. Поверните морду над (вентральной стороной вверх), чтобы выставить на крышу рта.
12. Отрежьте неба сразу каудальнее резцов. Сделайте это, вставив кончик лезвие скальпеля под неба параллельно крыше рот, а затем перейти лезвие к резцов.
13. Возьмитесь за освобождения (ростральной) край небе с Adson пинцетом и удалить, потянув каудально.
14. На анатомической левой стороне черепа, используйте лезвие скальпеля расширить небные отверстия каудально, начиная от небольших отверстия вблизи коренных зубов. Достижение это, вставив кончик скальпеля бладе в пустоту возле моляров и поворачивать запястье руки. ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте предельно осторожны, чтобы использовать только кончик лезвия - глубокий вырез может повредить перегородки ткани.
15. Использование кончик лезвие скальпеля, вырезанные из небных отверстия через резцов, начиная ростральнее анатомической левой вомероназального органа. Использование нескольких сокращений скоринга. Не повредите перегородки ткани и вомероназальных нервы, вставив лезвие слишком глубоко.
16. Поверните ткань так спинной череп стороной вверх, а затем ориентировать прямой лезвие вертикально (параллельно к средней линии) на хвостовом краю подготовки.
17. В брюшного края ткани, прикоснуться режущую кромку лезвия бритвы сразу слева от средней линии. Осторожно покачайте лезвие и двигаться вдоль левого небных отверстия (вырезать область, введенный в шаге 3.14).
18. В спинном краю ткани, поместить режущую кромку бритвы непосредственно слева от средней линии (менее 1 мм).
19. Хранениелезвие параллельно средней линии, раскачивать лезвие медленно с давлением по направлению к передней части ткани. Обратите внимание, сопротивление на решетчатой ​​пластине. Немедленно прекратите после пробития этого сопротивления. Примечание: В этой точке, правое полушарие ослаблен от левого полушария. Единственный оставшийся связь между полушариями вдоль спинной рыла передней к решетчатой ​​пластине.
20. Отделите полушария, держа их рядом каудальных сторон в перчатках пальцы и осторожно вращая их в стороны и вперед. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является источником экспериментальной изменчивости, особенно у мышей с наклонных или хрупких мордами (например, старые мыши). Кроме того, при попытке повернуть полушария друг от друга, если сильное сопротивление встречается забить спинной морду (переднюю к решетчатой ​​пластине), чтобы ослабить соединительной ткани. Делая это, принять крайнюю осторожность, чтобы не вставить скальпель глубоко, что может привести к повреждению перегородки тиСГУП и вомероназальные нервы.
21. Нанесите небольшое количество (50-100 мкл) ткани клеем к доске и аккуратно разместить боковой край правого полушария на клей с помощью щипцов Adson. Удаление избытка влаги с боковой стороны препарата, используя бумажное полотенце, чтобы предотвратить преждевременное клей полимеризации и свободную адгезию к доске. ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите несколько капель охлажденной рассечение ACSF на образец для ускорения клей полимеризации после ткани помещают на клей. Это гарантирует, что ткань остается плотно, удерживаемые до доски.
22. Поместите небольшое количество (диаметр 3-5 мм, глубокий 2 мм) вакуумной смазки в середине вторичного вскрытия камеры и поместить на сторону доски напротив ткани прочно против смазки. Сразу заполнить рассечение камеру с охлажденной рассечение ACSF, трансфер в тонкой области рассечение и начать перфузии с кислородом стандартной ACSF. Расположите доску таким образом, чтобы обонятельная луковица находится непосредственно впоток недавно окисленной стандартной ACSF.

4. Вторичный Рассечение

1. Удалите все видимые контралатеральный (слева) обонятельной луковицы или ткани коры от подготовки с использованием тонких щипцов. Зажмите вместе тонкий пинцет (образующие полу тупой точку), а затем поместить его в спинной и хвостовой части ткани вблизи средней линии. Аккуратно запустить ущипнул щипцы вдоль средней линии, пилинг ткани от правого полушария медленно в движении передней. Удалите все противоположной ткани, в том числе противоположной обонятельной луковицы ткани. Проявляйте особую осторожность, чтобы не ударить через ткань, которая может привести к повреждению АОБ или вомероназального нерва.
2. Соблюдайте белый твердую мозговую оболочку вдоль спинной / медиальной поверхности обонятельной луковице. Снести этот твердую мозговую оболочку вдоль спинной / хвостового края обонятельной луковице, держа в белоснежной части твердой мозговой оболочки с двумя парами тонких щипцов и тянуть их от этой точки. Твердая мозговая плотнообернутые вокруг обонятельных луковиц, и может легко сам срез ткани во время ее удалить. Избегайте повреждения медиальной поверхности обонятельной луковице и самой АОБ. ПРИМЕЧАНИЕ: Если длительность сопротивляется разрыву легко в этот момент, ввести небольшой разрез с прекрасными подсказка весны рассечение ножницами, чтобы облегчить отделение.
3. Медленно и осторожно удаляйте лобной коры с тонким пинцетом, не повреждая основные обонятельные луковицы. Соблюдайте коллекцию кровеносных сосудов, входящих в полупрозрачной сеткой сразу хвостового к АОБ. Удалить эту сеть с тонким пинцетом для облегчения проникновения электрода в электрофизиологических экспериментах. Возьмитесь за вычетом щипцами, как она отделяется от АОБ во фронтальной коре втягивания и снимите ее, потянув каудально и медиально, стараясь не прикасаться к AOB. После того, как лобная кора была отделена от обонятельных луковиц, удалить его, сокращая щипцами вентральной и задней на АОВ. ПРИМЕЧАНИЕ: Примите эксTreme уход с чистой удаления, потому что если это делается слишком грубо клубочковой слой может быть поврежден.
4. В открытой противоположной носовой полости, удалите оставшуюся контралатеральный перегородки ткани (надуманные желтовато лист, содержащий кровеносные сосуды), используя тонкий пинцет. Возьмитесь за ткань на области хвостовой / спинной (около перегородки кости), а затем потяните / снять ткань к передней стороне. ПРИМЕЧАНИЕ: контралатеральный перегородки ткань может быть случайно удалены во время стадии гемисекции (этап 3.20). В таком случае, наблюдать белый, аваскулярный перегородки хряща и слегка прозрачный, васкуляризованной перегородки кости. Если это так, шаг 4,4 может быть пропущен.
5. Осторожно снимите контралатеральный ВНО, запустив одну точку из тонких щипцов между перегородки хряща и ВНО "крыло" (тонкий кусок костной ткани, который проходит вдоль верхнего края как ВНО.
   1. После крыла отрыва от хряща, переместите кончик пинцетом вентральнов противоположную VNO вблизи средней линии. Повторите этот шаг в нескольких местах вдоль ростральной / хвостового оси противоположной ВНО, чтобы ослабить его, что позволяет ему быть удалены путем захвата пинцетом и подъема далеко.
6. Подготовка к отключению перегородки хряща, сделав разрез в брюшной / хвостового края (где она сужается до белого аваскулярного работающем полосы вдоль брюшного края перегородки кости) с тонким пинцетом.
7. Снимите перегородки хряща, зажимая вместе тонкий пинцет, чтобы сделать полу тупой точку. Определить разрез сделали в шаге 4.6, вставьте ущипнул щипцы позади (боковой) с этой разреза, а затем медленно поднимите хрящ от перегородки ткани и исходя рострально. ПРИМЕЧАНИЕ: Не нарушить основной перегородки ткани. Как хрящ поднимается, наблюдать за основной лист перегородки ткани стрейч из-за сыпучих спаек в хряще. Периодическая, нежный, и стабильный движение ущипнул тонким пинцетом вдоль этого участка потерятьdhesion может значительно облегчить успешное разделение двух структур.
8. Используйте пару # 3 пинцетом с загнутым кончиком, чтобы удалить перегородки кости. Подход перегородки кости под углом почти параллельно плоскости перегородки кости. Вставьте изогнутый зуб между перегородки ткани и перегородки кости. Возьмитесь за кость пинцетом и аккуратно переместить кость назад и вперед, пока она трещин вблизи решетчатой ​​пластине. ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях, перегородки кости будут сопротивляться нарушая рядом с решетчатой ​​пластиной. В этом случае, используйте тонкий пинцет, чтобы аккуратно забить перегородки кости вдоль спинной / вентральной оси просто впереди на решетчатой ​​пластине, а затем повторите шаг 4,8.
9. Удалите белую хрящ просто ростральная к ВНО, зажимая с одной парой тонких щипцов у входа и потянув рострально с другим пинцета.
10. Прикрепите полиимидную канюли для быстрой перфузии устройство и запустите поток раствора Рингера (0,1-0,3 мл / мин) через полиимидной канюли.ПРИМЕЧАНИЕ: Расход Мера с в линию, расходомера малого объема. Использование компьютерным управлением переключающего устройства пневматические стимулом уменьшает изменения расхода во время стимуляции. Сравните нервные реакции, чтобы проверить стимулы с ответами на макет стимула (контролировать раствор Рингера) для обеспечения ответы стимул конкретным.
11. Сориентируйте канюли параллельно входа ВНО. Когда канюля удовлетворительно параллельно к входу VNO, смотреть, как давление на выходе приводит к VNO "надуть", что приводит к эвакуации кровеносного сосуда. Сразу вставить канюлю в VNO, сохраняя угол постоянной канюли таким образом, что она остается параллельно с открытием VNO. ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть полезно провести канюли с одной парой тонких щипцов против пластиковой доски и использовать другую пару тонких щипцов для угла конец канюли немного вверх. Если случайно помещает канюли за ВНО, отток может также вызвать ВНО кровеносного сосудаэвакуировать, что приводит к впечатлению надлежащий катетеризация была выполнена. Правильное расположение может быть подтверждено путем включения краситель в растворе Рингера. Когда канюля установлена ​​правильно, краситель должен только выход через вход VNO. Кроме того, можно утверждать, правильное размещение, гарантируя, что канюля хорошо просматривается через полупрозрачной медиальной части ВНО.
12. Перемещение пластиковую доску медленно, пока АОВ не находится в прямой поток стандартного ACSF, стараясь не выбить канюли от ВНО. Рассечение является полной и оценка физиологической функции может начаться немедленно. Шаг 5 кратко описывает один подход для принятия такой оценки.

5. Оценка

1. Проникают в поверхность АОВ с 2-4 МОм боросиликатного стекла микроэлектрода, прикрепленной к внеклеточной усилителя и осциллографа.
2. Медленно микроэлектрода на глубину 100-200 мкм отповерхность со скоростью 50 мкм / мин. ПРИМЕЧАНИЕ: На этой глубине ткани, один столкнетесь случайные спонтанные действия потенциальных сигналов, примерами которых острыми, краткие (~ 1-2 мс) отклонений в напряжении микроэлектродной.
3. После столкновения потенциал действия сигнала, остановить продвижение микроэлектрод.
4. Заметим, и / или записи потенциальную скорость действий при изменении доставки стимул раствора из контроль Рингера к известному активатора VSN активность (например, раствор Рингера, содержащем 50 мМ KCl). Если рассечение было успешным, изменение стимул-зависимой в потенциальной скорости действий или потенциала локального поля можно наблюдать. Примечание: Не все AOB нейроны будет реагировать на любой раздражитель с увеличением скорости стрельбы (включая раствор Рингера, содержащем 50 мМ KCl). Стимул-зависимой снижение скорости стрельбы также указывает функциональную связь и успешный рассечение. В случае, когда два или больше нейронов, которые встречаютсяне реагируют на ВНО стимуляции, или если нет потенциалы действия не наблюдается после нескольких проникновений электродами, это говорит о том неудачную рассечение. Если это так, то новый рассечение может быть инициирована на шаге 3.

Результаты

Достижение успеха с этим препаратом занимает обширную практику, и имеет несколько этапов, на которой он может потерпеть неудачу. Следует ожидать, требовать много попыток, прежде чем добиться успеха. Обычай рассечение камера необходима для успешного завершения этого протокола, и должн?...

Обсуждение

ВНО-АОВ экс естественных получение описано в данном протоколе является полезной альтернативой наркозом в естественных условиях ^5-7 и острой живой срез ¹⁷ экспериментов функции АОБ. В отличие от острых опытах АОВ срезов, которые также подвергнуть элементы схемы для ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight Scissors	Fine Science Tools	14002-14
Fine Scissors-Straight	Fine Science Tools	14060-10
Fine Scissors-Curved	Fine Science Tools	14061-10
Adson Forceps	Fine Science Tools	11006-12
#3 Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12
#11 Scalpel Blades	Fisher Scientific	3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades	Fisher Scientific	12-640
35 mm Petri Dish	Fisher Scientific	08-772-21
Dissection Chamber	Custom	N/A	See Figure 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm	Custom	N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease	Fisher Scientific	146355D
#5 Forceps, Student	Fine Science Tools	91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip	Fine Science Tools	11295-10
#5 Forceps, Student	Fine Science Tools	91150-20
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08
1/16" Male Luer	Cole-Parmer	EW-45505-00
1/16" Tubing	Fisher Scientific	14-171-129
Two ton epoxy	Grainger	5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit	AutoMate Scientific	09-16
ValveLink digital/manual controller	AutoMate Scientific	01-18
NaCl	Sigma-Aldrich	various
KCl	Sigma-Aldrich	various
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	various
MgCl2 hexahydrate	Sigma-Aldrich	various
NaHCO3	Sigma-Aldrich	various
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	various
myo-inositol	Sigma-Aldrich	various
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	various
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	various
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	various
Glucose	Sigma-Aldrich	various