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Resumo

O artigo descreve a metodologia detalhada para diferenciar de forma eficiente as células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos de modular selectivamente a via Wnt, seguido por análise de citometria de fluxo de marcadores de referência para avaliar a homogeneidade e a identidade da população.

Resumo

Há uma necessidade urgente de desenvolver abordagens para reparar o coração danificado, descobrir novas drogas terapêuticas que não têm efeitos tóxicos no coração, e melhorar as estratégias de modelar com precisão a doença cardíaca. O potencial de exploração da tecnologia humana célula-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) para gerar músculo cardíaco "em um prato" para estas aplicações continua a gerar grande entusiasmo. Nos últimos anos, a capacidade de gerar de forma eficiente as células cardiomiogênica a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem melhorado muito, nos oferecendo novas oportunidades para modelar estágios muito iniciais de desenvolvimento cardíaco humano não acessíveis de outra forma. Em contraste com muitos métodos anteriores, o protocolo de diferenciação de cardiomiócitos aqui descrito não requer a agregação de células, ou a adição de Activina A ou BMP4 e robustamente gera culturas de células que são altamente positivo para a troponina I cardíaca e T (TNNI3, TNNT2), iroquois- proteína classe homeodomínioIRX-4 (IRX4), miosina regulatória de cadeia leve 2, isoforma muscular ventricular / cardíaco (MLC2v) e miosina regulatória de cadeia leve 2, isoforma atrial (MLC2a) por 10 dias em todas células estaminais embrionárias humanas (hESC) e linhas hiPSC testado para data. As células podem ser passadas e mantida por mais de 90 dias em cultura. A estratégia é tecnicamente simples de implementar e de baixo custo. Caracterização de cardiomiócitos derivados de células pluripotentes inclui muitas vezes a análise de marcadores de referência, tanto ao nível do mRNA e de proteínas. Para a análise de proteínas, a citometria de fluxo é uma poderosa ferramenta analítica para avaliar a qualidade das células na cultura e a determinação subpopulação homogeneidade. No entanto, a variação técnica na preparação da amostra pode afetar significativamente a qualidade de citometria de fluxo de dados. Assim, a padronização de protocolos de coloração deve facilitar as comparações entre as várias estratégias de diferenciação. Deste modo, optimizado para protocolos de coloração para a análise de IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, e TNNT2 por citometria de fluxo encontram-se descritos.

Introdução

A geração de cardiomiócitos de hPSCs, incluindo células estaminais embrionárias humanas e hiPSC, pode funcionar como um modelo in vitro de processos de desenvolvimento cardíacos humanos muito antigos, fornecendo informações sobre as fases de outra forma não acessíveis para estudos mecanicistas. Este modelo de sistema fornece uma oportunidade única para estudar as vias moleculares que controlam o compromisso linhagem cardíaca e especificação destino celular. Nos últimos anos, a capacidade de gerar de forma eficiente as células cardiomiogênica de hPSCs tem melhorado muito 1-15. No entanto, entre os protocolos há uma variação de linha de células no que respeita à eficiência na geração de células cardiomiogênica e tempo em que as células expressam marcadores específicos de câmara (por exemplo, átrios e ventrículo). Idealmente, para aplicações futuras deste sistema modelo, as populações mais homogêneas de células funcionalmente definidos são desejados. Em contraste com os métodos anteriores, a diferenciação de cardiomiócitos protocolo aqui descrito não necessita cell agregação ou a adição de Activin A ou proteína morfogenética óssea 4 (BMP4) e robusta gera culturas altamente positivo para TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v e MLC2a por dia 10 células em todas as linhas hESC e hiPSC testadas até o momento. A estratégia é tecnicamente simples de implementar, especialmente em comparação com culturas tridimensionais, cultura de massa, ou estratégias baseadas corpo embrióide 4-9, e recentemente foi definido em um estudo que descreve uma pequena molécula com toxicidade seletiva para hPSCs (Boheler et al. ) 65. Características deste protocolo incluem a diferenciação hPSCs em cultura em monocamada, utilizando uma única camada de uma matriz qualificado hESC (Matrigel), meios totalmente definidos, utilizando pequenas moléculas para modular a sinalização Wnt (similar, mas distinto do 1,2,7,13), e fluxo optimizado citometria de métodos de coloração para avaliação da eficiência da diferenciação e da identidade da célula. Em resumo, as vantagens deste protocolo em relação a relatórios anteriores incluem o seu custo-effectiveness, reprodutibilidade e sua alta eficiência para a geração de cardiomiócitos entre várias linhas HPSC, incluindo células estaminais embrionárias humanas e hiPSC linhas.

A citometria de fluxo é uma poderosa ferramenta analítica para avaliar a qualidade das células em cultura e determinação subpopulação homogeneidade e com design experimental adequada, pode fornecer medições quantitativas. Tal como acontece com todas as estratégias baseadas em anticorpos, a interpretação precisa dos resultados experimentais exige que os elementos do desenho do ensaio, incluindo concentração de anticorpos e fixação e condições de permeabilização (quando segmentação antígenos intracelulares) são cuidadosamente testados para cada anticorpo como condições sub-ótimas afetar significativamente a eficiência de anticorpo ligação, e portanto, a interpretação dos resultados. É importante notar que se a quantificação é necessária, os anticorpos monoclonais são essenciais, tal como anticorpos policlonais podem reconhecer epitopos múltiplos e são propensos a variação de lote para lote. Actualmente, uma variedade de anticorpos (poprotocolos lyclonal e monoclonais) e de coloração têm sido descritos para a avaliação da diferenciação in vitro, o que torna difícil comparar a eficiência de cardiomyogenesis entre protocolos 1,2,9,11. Por essa razão, os anticorpos monoclonais são utilizados quando disponíveis para todas as análises de citometria de fluxo. Para o futuro, espera-se que a padronização destes protocolos de coloração, especialmente com relação à quantificação, deve permitir uma melhor comparação entre estratégias de diferenciação.

A escolha dos marcadores, e os seus anticorpos correspondentes, utilizados para avaliar a pureza de cardiomyogenesis in vitro varia entre os relatórios. TNNT2 tem sido considerado um indicador das células comprometidas com o destino cardiomiogênica e é rotineiramente utilizado para avaliar a eficiência de protocolos de diferenciação cardíacos. No entanto, também é TNNT2 expresso no músculo esquelético durante o início de pinto de rato e o desenvolvimento 16,17 e está presente no músculo liso humano 18 . Assim, TNNT2 não é, necessariamente, um marcador específico de cardiomyogenesis humana in vitro. MLC2v e MLC2a são rotineiramente utilizados como marcadores substitutos de subtipos ventriculares e atriais, respectivamente. No entanto, os desafios com contando com MLC2v e MLC2a para determinar o subtipo de cardiomiócitos no contexto de diferenciação in vitro surgem do fato de que estes produtos de genes não pode ser restrito a uma câmara específica ao longo do desenvolvimento cardíaco, tubo de coração através de um adulto. No roedor loop coração, MLC2a mRNA é predominante na zona do átrio / entrada trato e MLC2v mRNA é predominante nas regiões do trato ventricular / descarga. No coração loop, co-expressão de MLC2a e MLC2v mRNAs são observados na via de entrada, canal atrioventricular, e via de saída 19,20. Aos 3 dias após o nascimento, MLC2v mRNA é restrito para o ventrículo e, aos 10 dias após o nascimento, MLC2a é restrita às aurículas do coração de rato neonatal 19. Portanto, a interpretaçãode dados sobre a eficiência cardiomyogenesis e subtipo identidade não só deve considerar a presença ea quantidade de níveis de marcadores de referência, mas deve considerar o estágio (s) de desenvolvimento a que os instantes de diferenciação que são analisados ​​correspondem. Isto é especialmente importante considerando-se que a fase de maturação das células cardiomiogênica gerados pela diferenciação in vitro de hPSCs mais se assemelha aqueles do desenvolvimento embrionário / fetal 21-25. Assim, com base na expressão espacial de um marcador no coração pós-natal pode não ser apropriado para a avaliação de células HPSC derivados, pelo menos em alguns casos.

Em um esforço para facilitar o desenvolvimento de critérios mais específicos para a definição da identidade de cardiomiócitos in vitro, TNNI3 é considerada um marcador importante na avaliação de cardiomyogenesis in vitro, uma vez que é restrito no músculo cardíaco durante toda a embriogênese em garota e peixe-zebra 15,20e está ausente no músculo esquelético humano fetal 26. Enquanto TNNI1 está presente no coração fetal humano, TNNI3 é a única isoforma presente TNNI no coração adulto normal 27,28. Quanto cardiomiócitos subtipo identidade, IRX4 29-31 é um marcador informativo de células com um destino ventricular. Ao nível da proteína, IRX4 foi recentemente mostrado para ser restringida ao ventrículo do coração do tubo linear através de estágios neonatais do rato 32. Por conseguinte, os protocolos de coloração optimizados para a análise de TNNI3 IRX4 e por citometria de fluxo encontram-se descritos. Para nosso conhecimento, esta é a primeira descrição de um método para a coloração com anticorpos e análise eficiente dos níveis IRX4 em cardiomiócitos humanos, por citometria de fluxo.

Protocolo

1. Solution e preparação da mídia

  1. hESC Matrix Qualificado revestimento da Solução
    1. Lentamente descongelar hESC matriz qualificado (5 ml) em gelo, a 4 ° C durante a noite. Dispense alíquotas em microtubos pré-refrigerados, 1,5 ml estéril e armazenar imediatamente a -20 ° C.
      NOTA: O volume da alíquota vai variar com base no lote e varia tipicamente 270-350 ul. Fabricante fornece detalhes sobre o volume de alíquota necessária para alcançar uma concentração 1x por diluição em 25 ml, tal como descrito na etapa 2.1.
  2. HPSC Mídia Banco de Soluções
    1. Utilizar água ultrapura como um diluente, a menos que indicado de outra forma. Esterilizar todos os componentes através de um filtro de 0,22 um. Guarde o seguinte como soluções a granel a 4 ° C: bicarbonato de sódio (75 mg / ml); ácido cítrico (10 mM, pH = 3).
    2. Esterilizar todos os componentes utilizando 0,2 m filtro de seringa e guarde cada um como alíquotas a -20 ° C: Rho-quinase (ROCK) inibidor Y-27632 (10mM em DPBS, alíquota de 100 ul); O ácido L-ascórbico 2-fosfato (64 mg / ml, 500 ul ali quota); selenito de sódio (70 ug / ml, 100 ul ali quota); transferrina (50 mg / ml, 107 ul ali quota); factor de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2, 200 ng / mL em DPBS, 250 ul ali quota); factor de transformação de crescimento beta 1 (TGF-p1, com 100 ng / mL em água fria de ácido cítrico a 10 mM, 10 ul aliquota).
  3. Composição HPSC mídia E8 Solution
    1. Prepare media utilizando alíquotas preparadas no Passo 1.2: DMEM / F12 (com L-glutamina e HEPES; 500 ml), bicarbonato de sódio (3,62 ml; final: 543 ng / ml), ácido L-ascórbico 2-fosfato (500 ul; finais : 64 ug / ml), selenito de sódio (100 ul; final: 140 ng / ml), transferrina (107 ul; final: 10,7 ug / ml), insulina (1 ml; final: 20 ug / ml), FGF2 (250 ul; final: 100 ng / mL), TGF-p1 (10 ul; final: 2 ng / ml).
    2. Combine todos os componentes, filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C por até 2 semanas.
  4. HPSC mídia E8 com Inibidor ROCHA
    1. Adicionar 15 mL de inibidor de rock para 12 ml de meio E8 preparadas como acima e misture bem. Certifique-se de que a concentração final é de 10 mM, após a adição de células / media no passo 3.7.
  5. Soluções de Stock de Wnt Moduladores
    1. Guarde as seguintes alíquotas a -20 ° C. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 mM em DMSO, 15 mL de alíquota). IWR-1 (4 (1,3,3a, 4,7,7a-hexa-hidro-1,3-dioxo-4,7-metano-2H-isoindol-2-il)-N-8-quinolinil-benzamida; 10 mM em DMSO, 6 mL de alíquota).
  6. Diferenciação de mídia
    1. Prepare mídia diferenciação # 1 com meio RPMI 1640 (com L-glutamina) com 2% de suplemento B27 menos insulina.
    2. Prepare mídia diferenciação # 2 com meio RPMI 1640 (com L-glutamina) com 2% de suplemento B27 mais insulina e 2% de FBS.
  7. Celular solução de lavagem fou cultura celular
    1. Use fosfato salino tamponado de Dulbecco (DPBS), sem cálcio ou magnésio.
  8. Solução de Lavagem celular para Citometria de Fluxo
    1. Utilize tampão fosfato salino (PBS, sem cálcio ou magnésio) com 1% de FBS. Armazenar a 4 ° C.
  9. Solução de Manutenção celular para Citometria de Fluxo
    1. Usar uma solução salina equilibrada de Hank (HBSS; sem cálcio ou magnésio) com 5% de FBS. Armazenar a 4 ° C.
  10. Soluções de Fixação de Citometria de Fluxo
    1. Use tampão Cytofix como solução de fixação de anticorpos TNNI3 e IRX4.
    2. Use paraformaldeído 4% em 1x PBS (fazer doce) como solução de fixação de anticorpos TNNT2 e MLC2a.
    3. Use 70% de metanol / 30% de acetona como solução de fixação de anticorpos MLC2v.
    4. Guarde todas as soluções a 4 ° C.
  11. Soluções para permeabilização Citometria de Fluxo
    1. Use Phosflow Perm Tampão III como solução de permeabilização fou anticorpos TNNI3 e IRX4. Guarde-o em temperatura ambiente (25 ° C).
    2. Use 0,2% de Triton X-100 em 1x PBS como solução de permeabilização de anticorpos TNNT2, MLC2v, e MLC2a. Armazenar a 4 ° C.
  12. Solução de Bloqueio
    1. Use 10% de soro de cabra em 1x PBS. Faça fresco e armazenar a 4 ° C até o uso.

2 Placa de Revestimento

  1. Lentamente descongelar uma alíquota de células estaminais embrionárias humanas matriz qualificada a 4 ° C durante 30 min, adicionar a 25 mL de DMEM refrigerada / F12 e misturar bem na cultura de tecidos esterilizadas capuz imediatamente antes revestindo placas de 6 poços.
  2. Adicionar 1 ml por poço de uma placa de 6 poços sob esterilizado capuz de cultura de tecidos (1 alíquota da matriz qualificada células estaminais embrionárias humanas é suficiente para o revestimento de quatro placas de 6 poços).
  3. Permitir matriz qualificada para definir células estaminais embrionárias humanas, durante 30 min à temperatura ambiente, sob o capô. Aspirar o excesso de matriz qualificado hESC e adicionar 2 ml de meio E8 com inibidor de rock para cada poço. Utilização placas imediatamente, ou se desIRED, armazenar a 4 ° C imediatamente após o plaqueamento, por até 1 semana e equilibrar à temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usar.

3. Passaging e Manutenção de indiferenciadas hPSCs em monocamada Cultura

  1. Manter hPSCs em cultura em monocamada em placas de 6 poços e executar todas as etapas em um estéril capa de cultura de tecidos.
  2. Use linhas HPSC que estão bem estabelecidos (> p20) e exibem uma morfologia homogénea sem a presença de células com um neural, morfologia epithelial- ou do tipo fibroblastos. Assegurar que as células proliferam de forma robusta e, em média, a passagem a cada três dias a 75% de confluência, quando semeadas em 0,75 x 10 6 por bem.
  3. HPSCs passagem com dissociação para o nível de uma única célula, pelo menos 5x antes do início da diferenciação para assegurar a máxima eficiência de diferenciação. Para hPSCs passagem, meios aspirado E8 e lavar as células duas vezes com 4 ml de 1x DPBS (pré-aquecida até à temperatura ambiente). Adicionar 1 ml da desanexação celularsolução mento (pré-aquecida até à temperatura ambiente) a cada poço e o poço deixar em repouso durante 3-7 minutos, até os limites da célula começa a round-up.
  4. Usar uma pipeta de vidro ligado-algodão com bolbo para desalojar as células e transferir para um tubo de 15 ml contendo 1 ml de meio DMEM / F12 (para inactivar a solução desprendimento de células).
  5. Retirar 10 mL da solução alíquota de células e misturar com 10 ul de azul de tripano em um tubo de microcentrífuga. Contagem de células (por exemplo, automaticamente ou hemocitómetro Manual) enquanto restante de células são recolhidas por centrifugação a 130 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Usando este protocolo, esperar 70-80% de viabilidade utilizando um hemocitômetro automatizada e vai para a frente, a base de todos os números de celulares na contagem de células totais.
  6. Aspirar mídia e ressuspender o sedimento de células em DMEM / F12 a uma concentração final de 0,75 x 10 6 células por 500 ul.
  7. Adicionar 500 ul da suspensão de células a cada poço de uma placa de 6 poços onde cada poço contains 2 media ml E8 com inibidor de ROCK, preparada no passo 2.3. Deixando placa na bancada, mova suavemente em células para frente e para trás e movimento lado-a-lado para dispersar uniformemente em toda a bem. Voltar células para incubadora com 5% de CO 2, 37 ° C.
  8. A partir de 24 horas após passaging, substituir a mídia diariamente usando 2 ml / bem E8 sem inibidor ROCK. Optimizar densidade de sementeira para atingir 100% de confluência antes do início da diferenciação. Semente de 0,75 x 10 6 células / poço quatro dias antes do início da diferenciação, mas optimizar para cada linha celular, conforme necessário.

4 Indução de cardiomiócitos hPSCs por modulação selectiva do Wnt Pathway

  1. Atualizar mídia (2 ml / poço) por dia durante os dias 0-7, e todos os outros dia após dia 8.
  2. No dia 0, iniciar o processo de diferenciação por substituir mídia E8 com media diferenciação # 1. Adicionar 1,2 mL de CHIR (6 uM final) a cada poço. Repita no dia 1.
  3. Nos dias 2-3, substitua por differen frescomídia ciação # 1.
  4. No dia 4, substituir com diferenciação fresco mídia # 1. Adicionar 1 mL IWR-1 (5 uM final) a cada poço. Repita no dia 5.
  5. Nos dias 6-7, troque com a diferenciação fresco mídia # 1.
  6. No dia 8, substituir com diferenciação fresco mídia # 2.
  7. Continue para substituir com a mídia diferenciação # 2 todos os dias durante o tempo desejado de cultura.
  8. Se desejar, cardiomiócitos de passagem utilizando a solução desprendimento de células seguindo os passos descritos em 3,3-3,6, mas substituindo a mídia com media diferenciação # 2. Durante passaging, dissociar cardiomiócitos em pequenos aglomerados de ~ 3-10 células. Semente em ~ 6 x 10 5 células por poço, utilizando células estaminais embrionárias humanas matriz qualificado poços revestidos e diferenciação mídia # 2.

5. coleta de células para citometria de fluxo

  1. Realizar todos os aspectos remanescentes de etapas 5-9 na bancada do laboratório (ou seja, não estéril).
  2. Aspirar o meio de crescimento e lavar as células duas vezes com PBS 1x.Adicionar 1 ml de solução de separação de células (pré-aquecida até à temperatura ambiente) a cada poço e deixar em repouso durante 3-7 minutos, até os limites da célula começa a round-up. Use um conectado-algodão vidro borosilicato descartável 9 "pipeta com o bulbo para desalojar as células e transferir para um tubo de 15 ml no gelo.
  3. Ao longo do restante do protocolo, a manter as células em gelo e realizar centrifugações a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
  4. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado. Suspenda as células em 10 ml de solução de lavagem, utilizando uma célula de 10 ml com uma pipeta serológica trituração repetida para assegurar aglomerados de células são dispersos em células individuais. Contagem de células como na etapa 3.5, enquanto restante de células são recolhidas por centrifugação.
  5. Ressuspender as células em solução de lavagem de células, tendo cuidado para desagregar completamente pellet celular e alíquota de 1 x 10 6 culas por tubo de fundo redondo. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado.

6. Fixação ePermeabilização de células para intracelular Antigen Coloração

  1. Adicionar solução de fixação 100 ul de sedimento celular. Adicionar solução gota a gota, com vórtice suave contínua e defina em gelo por 15 min.
  2. Adicionar 3 ml de solução de lavagem celular. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado.
  3. Adicionar solução de permeabilização 100 ul de sedimento celular. Adicionar solução gota a gota, com vórtice suave contínua defina em gelo por 30 min. Use condições de fixação e permeabilização como delineado para cada anticorpo no Quadro 1.
  4. Adicionar 3 ml de solução de lavagem celular. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado. Repetir para um total de duas lavagens após permeabilização.
Anticorpo primário (clone) Imunogénio / epítopo reconhecido Controle Istotype Valor de anticorpo primário por 1 x 10 6 células em 100 ul Solução de Fixação Solução permeabilização Anticorpo secundário Quantidade de anticorpo secundário / 1 6 x 10 células em 100 ul
Para medições por cento positivos Para Antigen quantificação
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (humano) IgG2b 1,0 ug 3,0 mg BD Cytofix BD Phosflow perm III De cabra anti-IgG2b de ratinho-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Comprimento total purificada proteína troponina T humana nativa. IgG1 1,0 ug 2,0 mg 4% PFA1% em PBS 0,2% de Triton X-100 em 1% PBS De cabra anti-IgG1 de ratinho - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG IgG2a 2,0 mg 3,0 mg 70% de metanol / 30% de acetona 0,2% de Triton X-100 em 1% PBS De cabra anti-IgG2a de ratinho - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) comprimento total de proteína recombinante humana de MYL7 humana produzida em E. coli IgG1 0,5 ug 3,0 mg 4% de PFA em PBS 1% 0,2% de Triton X-100 em 1% PBS De cabra anti-IgG1 de ratinho - Alexa 488 600 ng
IRX4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		IgG de coelho 0,5 ug 0,5 ug BD Cytofix BD Phosflow perm III Cabra anti-rabbit IgG-PE 600 ng

Tabela 1 Concentrações de anticorpos. Lista são o anticorpo primário, o clone (se monoclonais), concentrações e condições optimizadas de fixação e permeabilização para cada anticorpo primário e secundário utilizados para análises de citometria de fluxo. Como banco de concentrações de anticorpo pode variar entre os fornecedores do mesmo clone, as concentrações finais de cada anticorpo por um x 10 6 células num volume de ensaio fixo, em vez de diluições, são fornecidos. O imunogénio usado para gerar o anticorpo, ou epitopo reconhecido por um anticorpo, como fornecido pelo fabricante, é listado, mas não se verificou experimentalmente aqui.

7 Antibody Coloração

  1. Para cada experiência, inclui um controlo não corado por fixação condição / permeabilização e o controlo de isotipo adequado para cada anticorpo primário utilizada. Incluir tipos de células não-cardiomiócitos como controles negativos (por exemplo, células estaminais pluripotentes ou fibroblastos). Use controlos isotípicos na mesma concentração que o correspondente anticorpo primário (ver Tabela 1).
  2. Ressuspender as células em 100 ul de bloqueio solução usando uma pipeta para desagregar células P200. Definir as amostras em gelo durante 25 min com suave balanço.
  3. Sem retirar solução de bloqueio, adicione o anticorpo primário ou controle isotipo acordo com as diretrizes da Tabela 1. Incubar 45 min no gelo com balanço suave.
  4. Adicionar 3 ml de solução de lavagem celular. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado. Repetir para um total de duas lavagens após marcação com anticorpos primários.
  5. Se um anticorpo primário fluoróforo conjugado é usado, vá para o 8.1. Quando um anticorpo primário não conjugado é utilizado (por exemplo, para todos os marcadores descritos aqui), efectuar marcação com anticorpo secundário que está conjugado com um fluoróforo, como se segue.
  6. Ressuspender as células em 100 ul solução de bloqueio, utilizando uma pipeta de P200 a DISAcélulas ggregate.
  7. Adicionar anticorpo secundário por diretrizes na Tabela 1. Incubar 30 min no gelo com balanço suave.
  8. Adicionar 3 ml de solução de lavagem celular. Coletar as células por centrifugação e solução aspirado. Repetir para um total de duas lavagens após marcação com anticorpos secundário.

8 Preparação de células para citometria de fluxo

  1. Ressuspender as células em 400 mL solução de manutenção de células utilizando uma pipeta P1000 desagregar células.
  2. Prepare uma tampa filtro de células em um tubo de fundo redondo de pré-umedecimento com solução de manutenção de células 50 ul. Definir o tubo em gelo. Utilizar o tampão filtro celular para evitar agregados celulares de entupimento do citómetro de fluxo.
  3. Transferir a solução de célula para célula tampão filtro e permitir a suspensão de células a drenar pela força da gravidade. Toque inferior do tubo suavemente no topo da bancada, como necessário para que as células são recolhidas em tubos e recuada em gelo, tão rapidamente quanto possível. Coador de enxaguamento com a manutenção de células de 250 ul de modolução para garantir a recuperação máxima de células.
  4. Manter as células em gelo, e protegido da luz até serem analisadas por citometria de fluxo.

9 Análise do Fluxo Citometria

Configurações detalhadas aquisição irá variar entre os instrumentos. Parâmetros fundamentais a serem considerados para a coleta de dados ideal são descritos abaixo.

  1. Para a estabilidade de fluxo óptima, assegurar que o tamanho do bocal excede 5-6x o diâmetro da célula a ser analisado.
    NOTA: Isto pode variar entre os instrumentos, mas é uma consideração importante, tanto para os analisadores e selecionando tamanho do bico adequado para separação de células. O diâmetro médio de 10 dias cardiomiócitos é de 11 um (variando 8-14 mm); Assim, um tubo de injecção de 150 um padrão de amostra num analisador funciona bem.
  2. Imediatamente antes da análise de dados, cada um dos tubos de vórtice brevemente para dispersar os agregados celulares.
  3. Otimizar a frente e ajustes de tensão dispersão lateral para cada tipo de célula com base emcontrolo não corado, para cada condição de fixação / permeabilização utilizado na experiência de modo a que as populações de interesse são em escala e centrado (Figura 2A).
    1. Manter essas configurações ao longo de um único experimento e ser consistente de experimento para experimento no mesmo instrumento, como mudanças significativas podem indicar possíveis problemas com o citômetro de fluxo ou de preparação da amostra.
  4. Para cada fluoróforo, analisar o isotipo controle e ajuste de tensão do laser apropriado para determinar a intensidade mínima necessária para obter um histograma de fluorescência que exibe margens tanto esquerda e direita do pico. Manter as configurações de laser para cada isotipo controle na aquisição de dados em amostras marcadas com o anticorpo correspondente.
    NOTA: O sinal deriva muitas vezes ocorre ao longo do tempo no mesmo instrumento. É crítico para ajustar as configurações de laser no início de cada experiência com base no controlo de isotipo adequado.
  5. Recolha um mínimo de10.000 eventos. São preferidos 50.000 eventos.
  6. Para análise estatística, portão da população de células vivas para excluir detritos (Figura 2A). Determinar a percentagem de células positivas na população fechado com base no posicionamento de marcador que permite ≤2% contribuição de controlo de isotipo, como mostrado na Figura 2B, C.

Resultados

No dia 0, as células são 100% confluentes com morfologia compacta e os detritos celulares mínima. Nos dias 1-2, é comum observar-se morte celular significativa (40-50%), mas as células anexadas reterá morfologia compacto (Figura 1A). Durante este tempo, a mídia é laranja e turva. Meios-de-rosa indica morte excessiva de células, e, neste caso, confirmar com azul de tripan e interromper se a morte celular superior a 70%. As células irão recuperar durante 3-4 dias e vai aumentar a densidade. Dur...

Discussão

Crítico para o sucesso do protocolo de diferenciação é a utilização de culturas de elevada qualidade de hPSCs que foram passadas a nível da célula individual durante pelo menos cinco passagens antes do início da diferenciação. Diferenciação eficiências semelhantes são habitualmente observado entre as várias linhas de HPSC se forem 100% confluentes no início da diferenciação, independente da linha de células. Eficácia subóptima é observado se a confluência de células no início de diferenciação...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiado pelo NIH 4R00HL094708-03, Assuntos MCW Pesquisa Comitê Nova Faculdade Award, ea fundação Kern (fundos de inicialização) no Medical College of Wisconsin (RLG); Conselho bolsas de investigação de base-Tema Hong Kong Esquema Research T13-706 / 11 (KRB); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM Dr2a-05394, e AHA Fundada Investigator Award (JCW); AHA pós-doutorado 12POST12050254 (PWB). Agradecemos a esperança Campbell no Citometria de Fluxo Núcleo do Instituto de Wisconsin Research sangue para obter assistência com a coleta de dados e análise criteriosa do manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrixBD Biosciences354277
Accutase cell detachment solutionStem Cell Technologies7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesiumLife Technologies14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)Sigma AldrichD2650
Sodium bicarbonateSigma Aldrich53817
Citric acidSigma AldrichC2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitorR&D Systems1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigma AldrichA8960-5G
Sodium seleniteSigma AldrichS5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human)Invitria777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)R&D Systems4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1)Peprotech100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPESLife Technologies11330-032
InsulinSigma AldrichI9278-5ML
CHIR-99021 HClSellekchemS2924
IWR-1Sigma AldrichI0161
RPMI 1640 with L-GlutamineLife Technologies11875-093
B-27 Supplement Minus InsulinLife TechnologiesA1895601
B-27 Supplement (with Insulin)Life Technologies17504-044
Fetal bovine serumLife Technologies10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x)Quality Biological Inc.119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+Life Technologies14175-095
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Phosflow perm buffer IIIBD Biosciences558050
16% ParaformaldehydeThermo Scientific28906
MethanolSigma Aldrich179957-4L
AcetoneMallenckrodt Chemicals 2440-16
Triton X-100AmrescoM236-10ML
Goat serumLife Technologies16210-064
Trypan blue solution, 0.4%Life Technologies15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap)Corning352008For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap)Corning352235For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbsFischer Scientific03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipetsBioExpressP-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, greenGeneMateC-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, redGeneMateC-3260-R
TC20 automated cell counterBioRad145-0102
Counting slides for TC20BioRad145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plateCorning353046
20 ml SyringesBD Plastipak300613For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfoneVWR28145-501For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low bindingCorning431096For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low bindingCorning431097For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))Abcamab19615Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11)Thermo ScientificMA1-16687Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)Synaptic Systems310111Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)AbcamAB131661Primary antibody
Anti-IRX4  BiossBS-9464RPrimary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 Life TechnologiesA21121Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2aLife TechnologiesA21241Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2bLife TechnologiesA21141Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgGR&D SystemsF0110Secondary antibody
Mouse IgG1BD Biosciences557273Isotype Control
Mouse IgG2aeBiosciences16-4724-81Isotype Control
Rabbit IgG-PER&D SystemsIC105PIsotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTBLife TechnologiesHs01060665
Brachyury TLife TechnologiesHs00610080
CASQ2Life TechnologiesHs00154286
IRX4Life TechnologiesHs01100809
ISL1Life TechnologiesHs00158126
MESP1Life TechnologiesHs01001283
MYH11 (SMMHC)Life TechnologiesHs00224610
MYH6Life TechnologiesHs01101425
MYL2 (MLC2v)Life TechnologiesHs00166405
MYL7 (MLC2a)Life TechnologiesHs01085598
MYOGLife TechnologiesHs01072232
NKX2.5Life TechnologiesHs00231763
NPPALife TechnologiesHs01081097
POU5F1Life TechnologiesHs04260367
SOX17Life TechnologiesHS00751752
TNNI1Life TechnologiesHs00913333
TNNI2Life TechnologiesHs00268536
TNNI3Life TechnologiesHS00165957
TNNT2Life TechnologiesHs00165960

Referências

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