JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В статье описывается подробная методика эффективно дифференцировать человека плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты, выборочно модуляции путь Wnt, а затем с помощью проточной цитометрии анализ опорных маркеров для оценки однородности и идентичности населения.

Аннотация

Существует настоятельная необходимость в разработке подходов к ремонту поврежденного сердца, открывая новые терапевтические препараты, которые не имеют токсическое воздействие на сердце, и совершенствования стратегий для точного моделирования болезни сердца. Потенциал использования индуцированного технологию человека плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) для генерации сердечную мышцу "в блюдо" для этих приложений продолжает генерировать высокий энтузиазм. В последние годы, способность эффективно генерировать cardiomyogenic клетки от человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) значительно улучшилась, предлагая нам новые возможности для моделирования очень ранние стадии развития сердца человеческого не иначе доступны. В отличие от многих предыдущих методов, протокол дифференциация кардиомиоцитов описано здесь не требует агрегации клеток или добавление активин А или BMP4 и энергично формирует культуру клеток, которые очень положительно для сердечного тропонина I и Т (TNNI3, TNNT2), iroquois- класс гомеодоменовый белокIRX-4 (IRX4), регуляторной легкой цепи миозина 2, желудочка / сердечной мышцы изоформы (MLC2v) и регуляторной легкой цепи миозина 2, мерцательной изоформы (MLC2a) на 10 день по всей человеческой эмбриональной стволовой клетки (чЭСК) и hiPSC линий испытания, чтобы Дата. Клетки могут быть пассировать и выдерживают в течение более чем 90 дней в культуре. Стратегия технически прост в реализации и экономически эффективным. Характеристика кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных клеток часто включает в себя анализ опорных маркеров, как на уровне мРНК и белка. Для анализа белков, проточной цитометрии является мощным аналитическим инструментом для оценки качества клеток в культуре и определения субпопуляционного однородности. Тем не менее, техническая изменение пробоподготовки может значительно повлиять на качество проточной цитометрии данных. Таким образом, стандартизация протоколов окрашивания должны облегчить сравнение между различными стратегиями дифференциации. Соответственно, оптимизированы протоколы окрашивания для анализа IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 и TNNТ2 с помощью проточной цитометрии описаны.

Введение

Генерирование кардиомиоцитов из hPSCs, в том числе и чЭСК hiPSC, может функционировать в качестве модели в пробирке из самых ранних человеческих сердечных процессы развития, обеспечивая представление этапов не иначе, доступных для механистических исследований. Эта модель системы предоставляет уникальные возможности для изучения молекулярных путей, которые контролируют приверженность сердечной Lineage и клеточных судеб спецификацию. В последние годы, способность эффективно генерировать cardiomyogenic клетки от hPSCs значительно улучшилась 1-15. Тем не менее, среди протоколов есть изменение клеточной линии по отношению к эффективности генерации cardiomyogenic клеток и времени, при котором клетки экспрессируют камеры-специфических маркеров (например, желудочка и предсердий). В идеале, для будущих применений этой модельной системе, более однородные популяции клеток функционально заданных желательны. В отличие от предыдущих способов, протокол дифференциации кардиомиоцитов, описанный здесь, не требует CELL агрегации или добавление активин или костного морфогенетического белка 4 (BMP4) и энергично формирует культуры высоко положительным для TNNI3, TNNT2, IRX4, MLC2v и MLC2a днем ​​10 клеток во всех чЭСК и hiPSC линий протестированных на сегодняшний день. Стратегия технически прост в реализации, особенно по сравнению с трехмерных культур, массовой культуры, или эмбриоид тела на основе стратегий 4-9, а в последнее время был определен в исследовании, которое описывает малую молекулу с селективной токсичностью к hPSCs (Boheler соавт. ) 65. Особенности этого протокола включают дифференциацию hPSCs в монослоя культуры с использованием одного слоя из ЭСК квалифицированным матрицы (Matrigel), полностью определенные СМИ, использующие небольшие молекулы для модулирования Wnt сигнализации (похоже, еще отличие от 1,2,7,13), и оптимизирована проточной цитометрии методов окрашивания для оценки эффективности дифференцировки и идентичности клеток. Таким образом, преимущества этого протокола по сравнению с предыдущим отчеты включают его экономическую effectiveness, воспроизводимость и его высокая эффективность генерации кардиомиоцитов между несколькими линиями HPSC, в том числе чЭСК и hiPSC линий.

Проточной цитометрии является мощным аналитическим инструментом для оценки качества клеток в культуре и определения субпопуляционного однородность, и при правильном эксперимента, может обеспечить количественные измерения. Как и во всех стратегий на основе антител, точной интерпретации результатов эксперимента требует, чтобы элементы конструкции анализа концентрации антител в том числе и фиксации и условий проницаемости (при ориентации внутриклеточные антигены) тщательно проверены для каждого антитела, как суб-оптимальных условий существенно повлиять на эффективность антитела связывания, и поэтому, интерпретацию результатов. Важно отметить, что, если требуется количественное, моноклональные антитела имеют важное значение, так как поликлональные антитела могут распознавать множественные эпитопы и склонны к партии к партии вариации. В настоящее время множество антител (POlyclonal и моноклональные) и окрашивания протоколы были описаны для оценки дифференциации в пробирке, что делает его трудно сравнивать эффективность кардиомиогенеза среди протоколов 1,2,9,11. По этой причине, моноклональные антитела, которые используются, когда доступны для всех проточной цитометрии анализа. Забегая вперед, ожидается, что стандартизация этих протоколов окрашивания, особенно в отношении количественного, должны лучше разрешить сравнение между стратегиями дифференциации.

Выбор маркеров, и их соответствующие антитела, используется для оценки чистоты в пробирке кардиомиогенеза варьирует среди отчетов. TNNT2 был считать показателем клеток, совершенных в cardiomyogenic судьбы и обычно используется для оценки эффективности протоколов сердечных дифференцировки. Тем не менее, TNNT2 также экспрессируется в скелетной мышце в начале кур и крыс развития 16,17 и он присутствует в человеческой гладких мышц 18 . Таким образом, TNNT2 не обязательно является специфическим маркером человеческого кардиомиогенеза в пробирке. MLC2v и MLC2a обычно используются в качестве суррогатных маркеров желудочковых и предсердных подтипов, соответственно. Тем не менее, проблемы с опираясь на MLC2v и MLC2a определить кардиомиоцитов подтип в контексте дифференциации в пробирке связаны с тем, что эти генные продукты не могут быть ограничены на определенный камере на протяжении развития сердца, от сердечной трубки через взрослого. В грызун петлей сердце, MLC2a мРНК является преобладающим в области путей мерцательной / притока и MLC2v мРНК преобладает в регионах желудочка / выносящего тракта. В зацикленной сердце, ко-экспрессия MLC2a и MLC2v мРНК наблюдаются в приток тракта, атриовентрикулярного канала и тракта оттока 19,20. По 3 дней после рождения, MLC2v мРНК ограничивается желудочка и 10 дней после родов, MLC2a ограничивается предсердий в сердца новорожденной крысы 19. Поэтому интерпретацияиз данных о эффективности кардиомиогенеза и подтип идентичность должна учитывать не только наличие и количество уровней опорного маркера, но необходимо учитывать стадию (ы) с развитием в которых временные точки дифференциации, которые анализируются соответствовать. Это особенно важно, учитывая, что стадия созревания cardiomyogenic клеток, полученных путем экстракорпорального дифференциации в части hPSCs больше всего напоминает те из эмбриональной / фетальной развития 21-25. Таким образом, опираясь на пространственной экспрессии маркера в послеродовом сердце может не подходить для оценки HPSC-клеток, полученных, по крайней мере, в некоторых случаях.

В стремлении содействовать развитию более конкретных критериев для определения кардиомиоцитов идентичность в пробирке, TNNI3 считается ценным маркером для оценки кардиомиогенеза в пробирке, как она ограничена сердечной мышцы в течение эмбриогенеза у кур и рыбок данио 15,20и отсутствует в человеческой эмбриональной скелетных мышц 26. В то время как TNNI1 присутствует в сердце плода человека, TNNI3 является единственным TNNI изоформы присутствует в нормальной взрослой сердце 27,28. Что касается кардиомиоцитов подтипа идентичности, IRX4 29-31 является информативным маркером клеток с судьбой желудочка. На белковом уровне, IRX4 недавно было показано, чтобы быть ограничен желудочка с линейной сердечной трубки через неонатальных стадии у мышей 32. Соответственно, оптимизированные протоколы окрашивания для анализа TNNI3 и IRX4 цитометрическим описаны. Насколько нам известно, это первое описание способа для эффективного окрашивания на основе антител и анализа уровней IRX4 в человеческих кардиомиоцитов с помощью проточной цитометрии.

протокол

1 Решение и СМИ Подготовка

  1. чЭСК Квалифицированный Матрица Покрытие со Решение
    1. Медленно таять HESC квалифицированную матрицу (5 мл) на льду при 4 ° С в течение ночи. Разлить аликвоты в предварительно охлажденные, 1,5 мл стерильной микропробирок и сразу хранить при температуре -20 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем аликвоты будет меняться в зависимости от партии и обычно находится в пределах 270-350 мкл. Производитель предоставляет детали относительно объема аликвоты, необходимого для достижения концентрации при разбавлении 1x в 25 мл, как описано в шаге 2.1.
  2. HPSC СМИ Сток Решения
    1. С помощью сверхчистой воды в качестве разбавителя, если не указано иное. Стерилизацию всех компонентов с использованием фильтра 0,22 мкм. Хранить в следующем виде объемных растворах при 4 ° С: бикарбонат натрия (75 мг / мл); лимонной кислоты (10 мМ, рН = 3).
    2. Стерилизовать все компоненты, используя шприц фильтр 0,2 мкм и сохранять каждый в виде аликвот при -20 ° С: киназы (ROCK) ингибитор Rho Y-27632 (10мМ в DPBS, 100 мкл аликвоты); L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата (64 мг / мл, 500 мкл аликвоты); селенит натрия (70 мкг / мл, 100 мкл аликвоты); трансферрина (50 мг / мл, 107 мкл аликвоты); фактор роста фибробластов 2 (FGF2, 200 нг / мкл в DPBS, 250 мкл аликвоты); трансформирующий фактор роста бета 1 (TGF 1, 100 нг / мкл в холодной 10 мМ лимонной кислоты, 10 мл аликвоты).
  3. HPSC Медиа E8 Решение Состав
    1. Подготовьте носитель с использованием аликвоты полученного на стадии 1.2: DMEM / F12 (с L-глутамина и HEPES; 500 мл), раствором бикарбоната натрия (3,62 мл; окончательным: 543 мкг / мл), L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата (500 мкл; окончательные : 64 мкг / мл), селенит натрия (100 мкл; окончательным: 140 нг / мл), трансферрина (107 мкл; окончательным: 10,7 мкг / мл), инсулин (1 мл; окончательным: 20 мкг / мл), FGF2 (250 мкл; окончательным: 100 нг / мл), TGF 1 (10 мкл; окончательным: 2 нг / мл).
    2. Объедините все компоненты, фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С в течение до 2 недель.
  4. HPSC Медиа E8 с ROCK ингибитор
    1. Добавить ROCK ингибитор 15 мкл до 12 мл E8 СМИ приготовленных по описанной выше и хорошо перемешать. Убедитесь, что конечная концентрация составляет 10 мкМ после добавления клеток / СМИ в шаге 3.7.
  5. Исходные растворы Wnt модуляторы
    1. Храните следующие аликвот при -20 ° С. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; 10 мм в ДМСО, 15 мкл аликвоту). IWR 1-(4-(1,3,3а, 4,7,7а-гексагидро-1,3-диоксо-4,7-метано-2Н-изоиндол-2-ил)-N-8-хинолинил-бензамида; 10 мм в ДМСО, 6 мкл аликвоту).
  6. Дифференциация Медиа
    1. Подготовьте дифференциации СМИ # 1 с RPMI 1640 (с L-глутамина) с 2% B27 минус инсулина дополнения.
    2. Подготовьте дифференциации СМИ # 2 с RPMI 1640 (с L-глутамина) с 2% B27 плюс инсулина дополнения и 2% FBS.
  7. Промывки ячеек Решение Fили клеточной культуры
    1. С помощью забуференного фосфатом физиологического раствора Дульбекко (DPBS), без кальция или магния.
  8. Сотовый промывочного раствора для проточной цитометрии
    1. С помощью забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS, без кальция или магния) с 1% FBS. Хранить при температуре 4 ° С.
  9. Обслуживание датчика Решение для проточной цитометрии
    1. Использование сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS; без кальция или магния) с 5% FBS. Хранить при температуре 4 ° С.
  10. Фиксация Решения для проточной цитометрии
    1. Используйте Cytofix буфер как фиксирующем растворе для TNNI3 и IRX4 антител.
    2. Используйте 4% параформальдегида в 1x PBS (сделать свежий) в качестве фиксации решения для TNNT2 и MLC2a антител.
    3. С помощью 70% метанола / 30% ацетона в качестве раствора для фиксации MLC2v антитела.
    4. Храните все решения на 4 ° C.
  11. Пермеабилизирующего Решения для проточной цитометрии
    1. Используйте Phosflow Пермь буфера III как пермеабилизации раствора Fили TNNI3 и IRX4 антитела. Хранить при комнатной температуре (25 ° С).
    2. Используйте 0,2% Тритон Х-100 в 1x PBS как пермеабилизации решение для TNNT2, MLC2v, и MLC2a антител. Хранить при температуре 4 ° С.
  12. Блокирование решения
    1. Используйте 10% козьей сыворотки в 1x PBS. Сделать свежий и хранить при температуре 4 ° С до использования.

2 плиты покрытия

  1. Медленно растопить 1 аликвоту чЭСК квалифицированным матрицы при 4 ° С в течение 30 мин, добавляют к 25 мл охлажденного DMEM / F12 и хорошо перемешать в стерилизованной капот культуры ткани непосредственно перед нанесением 6-луночных планшетах.
  2. Добавить 1 мл на лунку 6-луночного планшета в соответствии с стерилизованной капот культуры ткани (1 аликвоту квалифицированным матрицы чЭСК достаточно, чтобы покрыть четыре 6-луночных планшетах).
  3. Разрешить чЭСК квалифицированного матрицы для установки в течение 30 мин при комнатной температуре под капотом. Аспирируйте избыток чЭСК квалифицированную матрицу и добавить 2 мл E8 СМИ с ROCK ингибитора в каждую лунку. Используйте пластины немедленно, или, если деIRED, магазин на 4 ° C сразу после посева на срок до 1 недели и уравновешивают до комнатной температуры в течение 30 мин до использования.

3 Пассирование и обслуживание недифференцированных hPSCs в монослоя культуры

  1. Поддержание hPSCs в монослоя культуры в 6-луночные планшеты и выполнять все действия в стерильной капот культуры ткани.
  2. Использование HPSC линии, которые хорошо известны (> P20) и имеют однородную морфологию без присутствия клеток с нейронной epithelial-, или фибробластоподобных морфологии. Убедитесь, клетки размножаются решительно, и в среднем, прохождения каждые три дня на 75% слияния, когда засевали в 0,75 х 10 6 на лунку.
  3. Пассаж hPSCs с диссоциации к одном уровне клетки минимум в 5 раз до начала дифференциации для обеспечения максимальной эффективности дифференциации. Для прохода hPSCs, аспирата E8 СМИ и мыть клетки дважды с 4 мл 1x DPBS (предварительно нагревают до комнатной температуры). Добавьте 1 мл клеточной Весь текстРешение ния (предварительно нагревают до комнатной температуры) в каждую лунку и оставить хорошо в покое на 3-7 мин, пока границы ячеек не начнут облавы.
  4. Используйте ватный-подключен стеклянную пипетку с лампой выбить клетки и передачи в 15 мл коническую пробирку, содержащую 1 мл DMEM / F12 СМИ (для инактивации клеток отряд решение).
  5. Удалить 10 мкл аликвоты раствора клеток и смешать с 10 мкл трипанового синего в микроцентрифужных трубки. Количество клеток (например, автоматическое или ручное гемоцитометра), тогда как остальная часть клетки собирают центрифугированием при 130 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Используя этот протокол, ожидать 70-80% жизнеспособность, используя автоматизированную гемоцитометра и идти вперед, база все числа клеток на общих кровяных клеток.
  6. Аспирируйте массовой информации и ресуспендируют осадок клеток в DMEM / F12 до конечной концентрации 0,75 × 10 6 клеток на 500 мкл.
  7. Добавить 500 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 6-луночного планшета, где каждый также содернс 2 мл E8 носители с ингибитором ROCK, полученного на стадии 2.3. Оставив тарелку на столешнице, осторожно двигаться в передней к задней и движения из стороны в сторону, чтобы равномерно рассеять клеток через хорошо. Вернуться клеток в инкубаторе при 5% CO 2, 37 ºC.
  8. Начиная с 24 часами после пассирования, заменить СМИ ежедневно с использованием 2 мл / лунку E8 без ингибитора ROCK. Оптимизация посева плотность для достижения 100% слияния до начала дифференциации. Семенной 0,75 х 10 6 клеток / лунку за четыре дня до начала дифференциации, но оптимизировать для каждой клеточной линии по мере необходимости.

4 кардиомиоцитов Индукция hPSCs селективным Модуляция Wnt Путь

  1. Обновить СМИ (2 мл / лунку) ежедневно в течение дней 0-7, и через день после того, как 8-й день.
  2. В день 0, начинают процесс дифференциации путем замены среды с E8 среде для дифференцировки # 1. Добавить 1,2 мкл CHIR (6 мкм окончательное) в каждую лунку. Повторите на 1 день.
  3. В дни 2-3, заменить свежим differenференцирование СМИ № 1.
  4. На 4-й день, заменить свежей среде для дифференцировки # 1. Добавить 1 мкл IWR 1-(5 мкм окончательным) в каждую лунку. Повторите на 5-й день.
  5. В дни 6-7, замените свежим дифференциации СМИ # 1.
  6. На 8-й день, заменить свежей дифференциации СМИ № 2.
  7. Продолжить заменить среде для дифференцировки # 2 через день в течение желаемого времени культуры.
  8. При желании, прохождение кардиомиоциты с использованием клеток отряд решение следующих шагов, описанных в 3,3-3,6, но заменяя СМИ с дифференциация СМИ № 2. Во время пассирования, отделить кардиомиоцитов в малых кластеров ~ 3-10 клеток. Семя в ~ 6 х 10 5 клеток на лунку с использованием чЭСК квалифицированный матричных покрытых скважин и дифференцировки СМИ # 2.

5 Сборник клеток для проточной цитометрии

  1. Выполните все оставшиеся аспекты шаги 5-9 на лабораторном столе (т.е., не стерильные).
  2. СМИ роста Аспирируйте и мыть клетки дважды 1x PBS.Добавьте 1 мл клеточной отряда решения (предварительно нагревают до комнатной температуры) в каждую лунку и оставить в покое на 3-7 мин, пока границы ячеек не начнут облавы. Используйте хлопок-подключен боросиликатного стекла одноразового 9 "пипетки с лампой выбить клетки и передачи в 15 мл коническую пробирку на льду.
  3. В течение оставшейся части протокола, поддерживать клетки на льду и выполнения центрифугирования при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
  4. Сбор клеток путем центрифугирования и аспирации раствора. Ресуспендируют клеток в растворе для промывки ячеек 10 мл с использованием 10 мл серологической пипеткой с повторным растиранием, чтобы обеспечить скопления клеток диспергируют на отдельные клетки. Количество клеток, как на стадии 3,5, а остальная часть клетки собирают центрифугированием.
  5. Ресуспендируют клеток в растворе для промывки ячеек заботясь, чтобы полностью детализировать осадок клеток и аликвоты 1 х 10 6 клеток на круглым дном трубки. Сбор клеток путем центрифугирования и аспирации раствора.

6 Фиксация иПермеабилизации клеток для внутриклеточного антигена окрашивания

  1. Добавить 100 мкл фиксации решение клеточного осадка. Добавить решения по каплям при непрерывном нежным встряхивания, а затем установить на льду в течение 15 мин.
  2. Добавить решение для промывки ячеек 3 мл. Сбор клеток путем центрифугирования и аспирации раствора.
  3. Добавить 100 мкл пермеабилизирующего решение клеточного осадка. Добавить решения по каплям при непрерывном нежным встряхивания затем установить на льду в течение 30 мин. Используйте фиксации и пермеабилизирующего условия, как описано для каждого антитела в таблице 1.
  4. Добавить решение для промывки ячеек 3 мл. Сбор клеток путем центрифугирования и аспирации раствора. Повторите для в общей сложности двух промывок после проницаемости.
Первичным антителом (клон) Иммуноген / Эпитоп Признанный Istotype управления Количество первичных антител для 1 х 10 6 клеток в 100 мкл Фиксация Решение Пермеабилизации Решение Вторичным антителом Количество вторичного антитела / 1 х 10 6 клеток в 100 мкл
Для процента положительных измерений Для антигена количественного
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (человек) Мышь IgG2b 1,0 мкг 3,0 мкг BD Cytofix BD Phosflow Пермь III Антимышиного IgG2b-Alexa488 600 нг
TNNT2 (1C11) Полная длина очищенной родной человек тропонина Т белок. Мышь IgG1 1,0 мкг 2,0 мкг 4% PFAв 1% PBS 0,2% Тритон Х-100 в PBS 1% Антимышиного IgG1 - Alexa 488 600 нг
MLC2v (330G5) FDPEGKG Мышь IgG2a 2,0 мкг 3,0 мкг 70% метанол / 30% ацетона 0,2% Тритон Х-100 в PBS 1% Антимышиного IgG2a - Alexa 647 600 нг
MLC2a (4E7) полная длина человеческий рекомбинантный белок человеческого MYL7, полученного в E. палочка Мышь IgG1 0,5 мкг 3,0 мкг 4% PFA в 1% PBS 0,2% Тритон Х-100 в PBS 1% Антимышиного IgG1 - Alexa 488 600 нг
IRX4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		IgG кролика 0,5 мкг 0,5 мкг BD Cytofix BD Phosflow Пермь III Коза анти-раBBIT IgG-PE 600 нг

Таблица 1. концентрации антител. Перечислены первичное антитело, клон (если моноклональные), оптимизированные концентрации и фиксации и пермеабилизирующего условия для каждого первичного и вторичного антитела используются для проточной цитометрии анализа. Как концентрации антитела запас может меняться в зависимости от поставщиков одного и того же клона, конечные концентрации каждого антитела на 1 × 10 6 клеток в объеме неподвижной анализа, а не разведения, предусмотрены. Иммуноген используется для генерации антитела, или эпитоп, распознаваемый антителом, как это предусмотрено производителем, приведена, но не был проверен экспериментально здесь.

7 антител Окрашивание

  1. Для каждого эксперимента, включают одну безупречную контроль за фиксации / состояния пермеабилизации и соответствующий контроль изотипный для каждого первичного антитела используются. Включите некардиомиоцитов типы клеток в качестве отрицательного контроля (например, плюрипотентные стволовые клетки или фибробласты). Использование изотипа контроля в той же концентрации, что соответствует первичного антитела (таблица 1).
  2. Ресуспендируют клеток в 100 мкл блокирующего раствора с помощью P200 пипетки разбить клетки. Набор образцов на льду в течение 25 мин при осторожном качания.
  3. Без удаления блокирующего раствора, добавить первичное антитело или контроль изотипный за руководящими принципами в таблице 1. Выдержите 45 минут на льду с нежным покачиванием.
  4. Добавить решение для промывки ячеек 3 мл. Сбор клеток путем центрифугирования и аспирации раствора. Повторите для в общей сложности двух промывок после маркировки первичных антител.
  5. При использовании флуорофор, конъюгированным первичное антитело, перейти к 8,1. При неконъюгированного первичное антитело используется (например, для всех маркеров, описанных здесь), выполнить маркировку с вторичным антителом, которое, конъюгированного с флуорофора следующим образом.
  6. Ресуспендируют клеток в 100 мкл блокирующего раствора с использованием P200 пипетки к DISAggregate клетки.
  7. Добавить вторичного антитела за руководящими принципами в таблице 1. Выдержите 30 минут на льду с нежным покачиванием.
  8. Добавить решение для промывки ячеек 3 мл. Сбор клеток путем центрифугирования и аспирации раствора. Повторите для в общей сложности двух промывок после маркировки вторичными антителами.

8 Получение клеток для проточной цитометрии

  1. Ресуспендируют клеток в 400 мкл раствора обслуживания сотового использованием P1000 пипетки разбить клетки.
  2. Приготовьте ячейки фильтра крышку на круглом нижней трубки предварительного увлажнения с обслуживания решении ячейка 50 мкл. Установите трубку на льду. Используйте сетчатый фильтр колпачок клеток, чтобы предотвратить клеточных агрегатов от засорения поток цитометр.
  3. Трансфер решение клеток в клеточный фильтр крышку и дайте клеточной суспензии для слива самотеком. Нажмите нижнюю часть трубки осторожно рабочей поверхностью по мере необходимости так, чтобы клетки собирали в пробирку и установить обратно на лед как можно быстрее. Промыть фильтр с обслуживания клеток 250 мкл такшение, чтобы обеспечить максимальное восстановление клеток.
  4. Поддержание клеток на льду и защиты от света, пока не анализировали с помощью проточной цитометрии.

9 проточной цитометрии

Детальная настройка сбора будет зависеть от инструментов. Фундаментальные параметры, которые следует учитывать для оптимального сбора данных описаны ниже.

  1. Для оптимальной стабильности потока, убедитесь, что размер сопла превышает 5-6x диаметр ячейки анализируются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может варьироваться между инструментами, но является важным фактором как для анализаторов и выбрав подходящий размер сопла для сортировки клеток. Средний диаметр день 10 кардиомиоцитов составляет 11 мкм (в диапазоне 8-14 мкм); Таким образом, стандартная 150 мкм инъекции пробирку на анализаторе работает хорошо.
  2. Непосредственно перед анализом данных, вихрь каждая трубка кратко разогнать клеточных агрегатов.
  3. Оптимизация вперед и настройки сторона разброс напряжения для каждого типа клеток на основенеокрашенными управления для каждого условия фиксация / пермеабилизации, используемой в эксперименте такие, что население интерес представляют по шкале и по центру (2А).
    1. Поддержание этих параметров на протяжении одного эксперимента и быть последовательными от эксперимента к эксперименту на том же инструменте, как значительные сдвиги могут указать на возможные проблемы с проточной цитометрии или пробоподготовки.
  4. Для каждого флуорофора, анализировать контроль изотипа и настроить соответствующее лазерный напряжение, чтобы определить минимальную интенсивность, необходимое для получения гистограммы флуоресценции, который отображает для правого и левого края пика. Поддержание лазерные установки для каждого изотипического контроля при приобретении данных на соответствующих образцов антител окрашенных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал дрейфа часто происходит в течение долгого времени на том же инструменте. Очень важно, чтобы настроить параметры лазера в начале каждого эксперимента, основанного на соответствующем контроля изотипа.
  5. Собрать минимум10000 событий. Предпочтительны 50000 событий.
  6. Для статистического анализа, ворота живая клетка население исключить мусор (Рисунок 2A). Определение процента положительных клеток в закрытом популяции на основе размещения маркера, который позволяет ≤2% вклад от контроля изотипа, как показано на фиг.2В, C.

Результаты

В день 0, клетки 100% сливной с компактной морфологии и минимальной клеточного дебриса. В дни 1-2, обычно наблюдать значительное гибель клеток (40-50%), но, прикрепленные клетки сохраняют компактную морфологию (фиг.1А). В течение этого времени, средств массовой информации становится ор...

Обсуждение

Критическое значение для успеха протокола дифференцировки является использование высококачественных культур hPSCs, которые были пассированных на уровне одной клетки, по крайней мере пять проходов до начала дифференциации. Которые обычно наблюдаются подобные эффективность дифференци...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано NIH 4R00HL094708-03, MCW ГУ МВД Комитет новый факультет премии, и основой Керн (запуска средства) в Медицинском колледже штата Висконсин (RLG); Научно-исследовательский совет по грантам Гонконг Тематический Исследование схемы T13-706 / 11 (КРФ); U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, и AHA Основанная Следователь премии (JCW); AHA докторантуру 12POST12050254 (ПРБ). Мы благодарим Надежда Кэмпбелл в проточной цитометрии Ядра Крови исследовательского института Висконсина за помощь в сборе данных и тщательного анализа рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture
BD Matrigel, hESC-qualified matrixBD Biosciences354277
Accutase cell detachment solutionStem Cell Technologies7920
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesiumLife Technologies14190-136
Dimethyl sulfoxide (DMSO, Hybri-Max, sterile-filtered)Sigma AldrichD2650
Sodium bicarbonateSigma Aldrich53817
Citric acidSigma AldrichC2404-100G
Y-27632 dihydrochloride selective p160ROCK inhibitorR&D Systems1254
L-Ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigma AldrichA8960-5G
Sodium seleniteSigma AldrichS5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Defined, Animal-free, Recombinant Human)Invitria777TRF029
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)R&D Systems4144-TC-01M
Transforming growth factor beta 1 (TGFβ1)Peprotech100-21
DMEM/F12 with L-Glutamine and 15 mM HEPESLife Technologies11330-032
InsulinSigma AldrichI9278-5ML
CHIR-99021 HClSellekchemS2924
IWR-1Sigma AldrichI0161
RPMI 1640 with L-GlutamineLife Technologies11875-093
B-27 Supplement Minus InsulinLife TechnologiesA1895601
B-27 Supplement (with Insulin)Life Technologies17504-044
Fetal bovine serumLife Technologies10437
Flow Cytometry Reagents
Phosphate buffered saline (10x)Quality Biological Inc.119-069-151
Hank's balanced salt solution without Ca2+ and Mg2+Life Technologies14175-095
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Phosflow perm buffer IIIBD Biosciences558050
16% ParaformaldehydeThermo Scientific28906
MethanolSigma Aldrich179957-4L
AcetoneMallenckrodt Chemicals 2440-16
Triton X-100AmrescoM236-10ML
Goat serumLife Technologies16210-064
Trypan blue solution, 0.4%Life Technologies15250-061
Materials
5 ml Round bottom polystyrene tube (without cap)Corning352008For preparation of cells for flow cytometry
5 ml Round bottom polystyrene tube (with 35 µM cell strainer snap cap)Corning352235For preparation of cells for flow cytometry
2 ml rubber bulbsFischer Scientific03-448-24
9" borosilicate unplugged glass Pasteur pipetsBioExpressP-2904-2
0.65 ml Microcentrifuge tubes, graduated, greenGeneMateC-3259-G
1.5 ml Microcentrifuge tubes, graduated, redGeneMateC-3260-R
TC20 automated cell counterBioRad145-0102
Counting slides for TC20BioRad145-0011
6-well Flat bottom tissue-culture treated plateCorning353046
20 ml SyringesBD Plastipak300613For filter sterilization of aliquots
Sterile syringe filters, 0.2 µm polyethersulfoneVWR28145-501For filter sterilization of aliquots
250 ml Filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low bindingCorning431096For filter sterilization of bulk media 
500 ml filter system, 0.22 µm polyethersulfone, sterilizing, low bindingCorning431097For filter sterilization of bulk media
Antibodies and Isotype Controls
Anti-TNNI3 (clone: 284 (19C7))Abcamab19615Primary antibody
Anti-TNNT2 (clone: 1C11)Thermo ScientificMA1-16687Primary antibody
Anti-MYL2 (MLC2v, clone: 330G5)Synaptic Systems310111Primary antibody
Anti-MYL7 (MLC2a, clone: 4E7)AbcamAB131661Primary antibody
Anti-IRX4  BiossBS-9464RPrimary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG1 Life TechnologiesA21121Secondary antibody
Alexa Fluor 647 Goat anti-mouse IgG2aLife TechnologiesA21241Secondary antibody
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgG2bLife TechnologiesA21141Secondary antibody
Phycoerythrin(PE) Goat anti-rabbit IgGR&D SystemsF0110Secondary antibody
Mouse IgG1BD Biosciences557273Isotype Control
Mouse IgG2aeBiosciences16-4724-81Isotype Control
Rabbit IgG-PER&D SystemsIC105PIsotype Control
TaqMan Probesets for qRT-PCR
ACTBLife TechnologiesHs01060665
Brachyury TLife TechnologiesHs00610080
CASQ2Life TechnologiesHs00154286
IRX4Life TechnologiesHs01100809
ISL1Life TechnologiesHs00158126
MESP1Life TechnologiesHs01001283
MYH11 (SMMHC)Life TechnologiesHs00224610
MYH6Life TechnologiesHs01101425
MYL2 (MLC2v)Life TechnologiesHs00166405
MYL7 (MLC2a)Life TechnologiesHs01085598
MYOGLife TechnologiesHs01072232
NKX2.5Life TechnologiesHs00231763
NPPALife TechnologiesHs01081097
POU5F1Life TechnologiesHs04260367
SOX17Life TechnologiesHS00751752
TNNI1Life TechnologiesHs00913333
TNNI2Life TechnologiesHs00268536
TNNI3Life TechnologiesHS00165957
TNNT2Life TechnologiesHs00165960

Ссылки

  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657 (2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979 (2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784 (2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474 (2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037 (2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1. HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao, ., Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

91IRX4TNNI3TNNT2MCL2vMLC2a

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены