Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

Resumo

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Resumo

Ensaios de placa continuam sendo um dos métodos mais precisos para a quantificação direta de virons infecciosas e substâncias antivirais através da contagem de placas discretas (unidades infecciosas e zonas mortas celulares) em cultura de células. Aqui demonstramos como realizar um ensaio básico placa, e como sobreposições e técnicas diferentes podem afetar a formação de placas e de produção. Tipicamente substratos sólidos ou semi-sólidos de sobreposição, tais como agarose ou carboximetil celulose, têm sido utilizados para restringir propagação viral, prevenindo a infecção indiscriminada através do meio de crescimento líquido. Sobreposições imobilizadas restringir a infecção celular para a monocamada imediatamente circundante, permitindo a formação de focos contáveis ​​discreta e subsequente formação de placa. Para superar as dificuldades inerentes ao uso de sobreposições tradicionais, uma sobreposição de líquido romance utilizando celulose microcristalina e carboximetilcelulose de sódio tem sido cada vez mais utilizado como um substituto no padrãoensaio de placas. Ensaios de placas de sobreposição líquidos podem ser prontamente realizada em qualquer padrão 6 ou 12 formatos de placas, bem como por técnicas tradicionais e não requerem equipamento especial. Devido ao seu estado líquido e subsequente facilidade de aplicação e remoção, formatos de placas de microcultura podem, alternativamente, ser utilizado como uma alternativa de transferência rápida, precisa e de alta para titulações virais maior escala. O uso de um polímero líquido viscoso aquecido não oferece a oportunidade de agilizar o trabalho, conserva reagentes, espaço incubadora, e aumenta a segurança operacional quando usado em laboratórios de contenção tradicionais ou altos como nenhum aquecimento do reagente ou das suas obras são necessárias. Sobreposições de líquidos podem também revelar-se mais sensível do que as sobreposições tradicionais para determinados calor vírus lábil.

Introdução

O isolamento precisas e quantificação das amostras virais viáveis ​​tem sido consistentemente um objetivo a investigação em curso em virologia. Não era até o advento do ensaio de placa em 1952 que um meio para calcular quantitativamente e qualitativamente os títulos virais animais foi desenvolvido pela primeira vez ^1,2. Esta técnica foi adaptada e modificada a partir de ensaios de fagos, os quais foram anteriormente utilizados para calcular os títulos de banco de bacteriófagos em planta biologia ^1,2 primeiro. Enquanto meios alternativos para quantificação viral desde então têm sido desenvolvidos e adaptados, como imunoensaios, fluorescência e microscopia eletrônica de transmissão, ajustável de detecção de pulso resistiva (TRPS), citometria de fluxo, sistemas de repórter recombinantes, e reversa quantitativa reação em cadeia da polimerase com transcrição (qRT-PCR) , esses métodos não conseguem identificar e quantificar replicação virons competentes ^1,3. Embora os avanços nas tecnologias e técnicas de continuar a aperfeiçoar e alterar a paisagem; PLAQUE os ensaios continuam a representar o padrão ouro na determinação das concentrações virais para virons líticas infecciosas ^1,4.

Durante um ensaio de placa, uma monocamada confluente de células hospedeiras está infectado com um vírus lítico de uma concentração desconhecida que foi diluída em série para uma gama contáveis, tipicamente entre 5-100 viriões. As monocamadas infectadas são então coberto com um meio de cobertura de imobilização para impedir a infecção viral a partir de indiscriminadamente, quer através de difusão do fluxo de convecção mecânica ou do meio líquido durante a propagação viral. Apesar da sobreposição sólidas ou semi-sólidas, tais como agarose, metilcelulose ou carboximetilcelulose (CMC) têm sido tradicionalmente utilizados, sobreposições de líquidos tornaram-se cada vez mais uma alternativa atraente, com o desenvolvimento de novas folhas de prova de líquidos, tais como Avicel ^{5- 7.} Ensaios de placa utilizando líquido contra sobreposições tradicionais têm várias vantagens como a sobreposição pode ser applied à temperatura ambiente, e a aplicação e remoção é significativamente mais fácil. Como sobreposições líquidos não requerem aquecimento, vírus lábil delicados e de calor também pode revelar-se mais fácil de placa.

Após a infecção inicial e aplicação da sobreposição imobilizante, placas individuais, ou zonas de morte celular, irá começar a desenvolver infecção como a replicação viral e são constrangidas para a monocamada circundante. As células infectadas irão continuar o ciclo de replicação de lise-infecção, mais de propagação da infecção, resultando em placas cada vez mais distintos e separados. Dependendo da cinética de crescimento viral e célula hospedeira utilizada, uma placa visível forma, normalmente, dentro de 2-14 dias. As monocamadas celulares podem então ser contadas com um microscópio de campo brilhante padrão, ou mais tipicamente fixo e contrastadas pelo vermelho ou cristal violenta neutro, a fim de identificar prontamente placas a olho nu. Há uma grande variedade de contra placa manchas disponíveis, cada oferta their vantagens e desvantagens específicas. O violeta de cristal é tipicamente adicionado na altura da recolha e após a fixação / remoção da cobertura, proporcionando um contador de mancha rápida e distinta, que permite a identificação de placas muito pequenas quando morfologia mista está presente. Vermelho neutro tem a vantagem de aplicação antecipada e constante contato com a sobreposição, permitindo o monitoramento ao vivo de desenvolver a formação de placas, o que é particularmente útil quando se trabalha com um desconhecido cinética de vírus ou de replicação. Nós descobrimos que a coloração no entanto não é geralmente tão distinta quando utilizando vermelho neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT) oferece diversas vantagens, como as manchas de cor amarelo vivo corantes células placas azuis escuras e virais podem ser contados, sem remoção da sobreposição quanto com vermelho neutro. O alto contraste entre as células vivas e mortas oferecidas pela MTT também permite a detecção de pequenas placas em uma hora mais cedo a infecção ponto pós, Apesar de armazenamento ainda exigiria a remoção da cobertura ^8. Como violeta de cristal pode ser feita simplesmente em uma solução de água e álcool, e proporciona um elevado grau de sensibilidade para a morfologia da placa mista, optámos-lo como um contador de manchas preferido e simplificado para o protocolo como demonstrado que estamos utilizando várias famílias de bem vírus caracterizados.

Após fixação e coloração da monocamada celular infectada, as placas são contadas no fim titule banco de amostras virais em termos de unidades formadoras de placas (pfu) por mililitro. Uma gota de registo deve ser observado entre diluições em série e, dependendo do tamanho da placa, entre as placas foram contadas 5-100, com um controlo negativo utilizado como uma referência. Amostras estatisticamente irá variar em 10% para cada 100 placas contados quando se compara amostra replica ^3. A vantagem de usar ensaios de placas para determinar os títulos virais reside na sua capacidade para quantificar o número real de partículas virais infecciosas within a amostra. Como múltiplos viriões poderia potencialmente infectar uma célula única, a terminologia de unidades contra virons é utilizado durante as titulações em placa ^1,2.

Morfologia da placa pode variar drasticamente sob diferentes condições de crescimento e entre espécies virais. Tamanho da placa, a clareza, a definição das fronteiras, e distribuição devem todos ser notado como eles podem fornecer informações valiosas sobre o crescimento e fatores de virulência de vírus em questão.

Os princípios básicos da placa de ensaio também pode ser adaptado e modificado num número de maneiras diferentes, tais como no uso de ensaios de formação de foco (FFAs). FFAs não dependem de lise celular e de contraste para detectar a formação de placa, mas sim empregar técnicas para detectar diretamente as proteínas virais intracelulares através de anticorpos marcados imunomarcação. O aumento da sensibilidade, diminuição dos tempos de incubação após a infecção, e mais importante a capacidade para quantificar os vírus não-líticos são todos distintosvantagens quando se emprega FFAs. Embora amplamente utilizados, os factores críticos que limitam FFAs em comparação com um ensaio de placa tradicional reside na necessidade de anticorpos apropriados e a capacidade de somente sonda para subunidades de proteínas virais contra viriões infecciosos ^{4 reais.}

Para o propósito deste estudo, vamos limitar nossa discussão para ensaios de placa clássicos e descrever o uso de sobreposições de sólidos e semi-sólidos tradicionais (agarose e CMC), juntamente com novas sobreposições de celulose líquido microcristalinas.

Protocolo

1. Preparação de Células e Reagentes

1. No dia antes do ensaio, placa de células hospedeiras apropriadas para o vírus em questão (Tabela 1 e 2) em 90 - 100% de confluência.
2. Preparar a solução de fixação de 10% de formaldeído em dH ₂ O. No exemplo, misturar 5,56 ml de estoque 36% de formaldeído, com 14,44 mL de H ₂ O destilada _(dH2O).
   NOTA: Use as práticas de manuseio seguro adequado e ventilação quando se utiliza formaldeído.
3. Prepare a mancha violeta de cristal: 1% de cristal violeta (CV) em etanol a 20% e dH ₂ O.
4. Prepare a mídia de placa 2x (tipo de célula dependente na concentração 2x; ver Tabela 2). Filtrar através de um filtro de 0,2 um, se quaisquer reagentes não são estéreis.
5. Preparação de sobreposições de imobilização (Tabela 3)
   1. Para sobreposições de líquidos, fazer uma solução estéril de 2,4% de Avicel em dH ₂ O. Para evitar aglomeração, adicionar o pó a um balão contendo água tha mistura é rapidamente com uma barra de agitação, verter em Avicel lentamente e agita-se rapidamente à temperatura ambiente (RT). Quando a solução for muito viscoso para uma barra de agitação para homogeneizar, mudar para um shaker frasco para> 30 min com agitação pesado para garantir uma homogeneização.
      NOTA: As soluções de reserva pode ser feita em concentrações mais baixas, mas as soluções podem separar-se e terá de ser remisturado para assegurar a homogeneização. As soluções de trabalho de Avicel pode ser utilizado variando 0,6-3%.
   2. Após homogeneização, a solução autoclave selado e armazenar à temperatura ambiente.
   3. Para agarose e carboximetilcelulose (CMC) sobreposições, preparar uma solução de reserva em _dH2O de 2% de CMC ou 0,6% de agarose. Misture com uma barra de agitação e autoclave ou forno de microondas para trazer a solução.

2. As diluições e Infecções

1. No dia após o plaqueamento, verificar visualmente a confluência e viabilidade das células antes de se iniciar o ensaio. Certifique-se de um padrão celular morfologiand uma monocamada confluente ~ 90% está presente.
2. Realizar uma diluição em série de dez vezes das amostras infecciosas. Usar o meio de crescimento celular para a propagação viral como diluente (Tabela 2). Variar o número de diluições necessárias com base na titulação esperada do vírus em causa, e sempre usar uma amostra de controlo não infectado, independentemente, para assegurar a viabilidade celular e ajuda na identificação de placas.
3. A partir das diluições em série, infectar as células durante 45 min a 1 h (Tabela 1). Utilizar um volume suficiente de inoculo para cobrir as células, mantendo o volume tão baixo quanto possível para maximizar o contacto com a monocamada viral (Tabela 4). Placas rochosas suavemente a cada 20 min para garantir uma cobertura uniforme e evitar a monocamada celular de secagem.
4. Após a infecção, sobrepor um volume apropriado de meio de imobilizar directamente para os inóculos no poço (Tabela 2) usando uma mistura 1: 1 de 2 x media de placa e o immobilizing sobreposição de escolha (CMC, agarose ou Avicel). Agite suavemente para misturar.
   1. Para sobreposições de líquidos, misture 1: 1 com aquecido mídia chapa 2x e 1,2-2,4% da RT Avicel para obter uma solução de trabalho de 0,6-1,2% Avicel meio de cobertura.
   2. Para obter uma camada de agarose, utilizar uma mistura 1: 1 de meios de placa 2x aquecido e uma solução de estoque de 0,6% de agarose aquecido, em lugar de um C num banho de água a 56 ° durante 30 minutos para equilibrar a temperatura a obtenção de uma concentração final de agarose / sobreposição de 0,3 %.
   3. Para CMC, preparar uma solução stock de 2% e tratar como descrito para a sobrecamada de agarose.
   4. Ao aplicar-se uma camada superior ao monocamada, sempre equilibrar agarose quente ou CMC numa água de 56 ° C para evitar danos na monocamada. Certifique-se de que a solução é quente, mas não quente ao toque para evitar a morte celular e reduzidos os títulos virais. A maioria das camadas de agarose vai começar a solidificar abaixo de 42 ° C, trabalhar rapidamente e / ou preparar pequenos lotes para evitar a solidificação durante o manuseio.
5. Após a adição da sobreposição, incubar as placas para produzir chapas que são claramente distintos contáveis. A formação de placa pode demorar de 2-14 dias, dependendo do vírus a ser analisada, Tabela 1.
   NOTA: Uma vez que as placas sobrepostas líquidos são colocados na incubadora, não movê-los. Movimento das sobreposições de líquidos durante o período de incubação resultará em placas borratadas. Agarose e CMC sobreposições são semi-sólidas e podem ser movidos ou verificada periodicamente sob um microscópio de luz para monitorar o desenvolvimento da placa.

3. Fixação e coloração de células

1. Para fixar as células, deitar fora ou aspirar o Avicel sobreposição, e fixar as células usando a solução de formaldeído a 10% durante 30 minutos a durante a noite (<1 ml por poço para uma placa de 6 poços).
   1. Para agarose ou CMC, adicionar directamente a solução de formaldeído à sobreposição durante 1 hora a durante a noite.
      NOTA: As amostras podem ser mantidas por longos períodos de tempo no fixador desde que faznão evaporar e secar como isto pode falsear a monocamada.
2. Antes da coloração e após a sua fixação, descartar o formaldeído e remover os bujões semi-sólidas para a agarose e CMC quer com água corrente ou manualmente com uma espátula. Lavar as placas Avicel com água para remover o residual de sobreposição / fixador antes da coloração.
3. Para a coloração, cobrir as células com uma quantidade mínima de solução de violeta de cristal durante ~ 15 min. Placas de rocha se necessário para garantir uma cobertura uniforme.
4. Delicadamente, lave a mancha violeta de cristal com água. Uma vez fixados, corados e seco, placas de loja por tempo indeterminado para análise futura.

4. Determinar virais Títulos

1. Contar as placas em cada poço, considerando a média de todas as repetições técnicos da mesma diluição. Para grandes formatos de placas, poços de desconto com menos de 5 ou maior do que 100 placas. Tome nota do tamanho e morfologia de placas. O controle negativo deve ter uma monocamada uniforme epode ser usado como um controlo de referência.
2. Determinar o título viral da amostra stock tendo o número médio de placas para uma diluição e o inverso do factor de diluição total.

NOTA: Como um exemplo, 30 e 32 para as placas foram contadas repetições do 1 x 10 ^-7 diluição [31 (média) / 10 ^-7 (diluição) x 0,4 ml (inoculo)] iria originar um título de 7,75 x 10 ⁸ pfu / ml.

Resultados

A capacidade dos ensaios de placas para avaliar com precisão os títulos virais depende de numerosos factores: selecção da célula hospedeira apropriada, meios apropriados e condições de crescimento para a viabilidade celular e viral, a propagação viral imobilizada, e uma determinação exacta do período de incubação viral para permitir um tempo adequado para distinta e formação de placas contáveis.

Para este estudo, os vírus de três famílias representativas foram escolhidas para demonstrar as diferenças de: seleção de sobreposição, períodos de incubação e morfologia da placa através de diferentes tipos de amostras. Encefalite Equina Venezuelana (VEEV) foi seleccionada como um modelo viral (+) ssRNA, o que pode causar doença significativa em equinos e humanos e representa a família Togaviridae. Influenza B tensão Taiwan, um segmentado (-) vírus ssRNA infectando principalmente os seres humanos, representa a família Orthomyxoviridae. Rift Valley vírus da febre (RVFV), a (-) ssRNA artrópode nascido vírus infectando principalmente artrópodes,ruminantes e humanos, foi escolhido como representante da família Bunyaviridae.

Para RVFV (Figura 1), os títulos foram determinados a partir de uma solução de estoque de uma estirpe viva atenuada recombinante MP12 de RVFV em um formato de placa de 12 poços utilizando CMC, de agarose, ou sobreposições Avicel que foram incubadas lado-a-lado para a infecção de 72 h pós (IPH). Uma placa representativa mostrando diluições que variam de 10 ^-4 a 10 ^-7 pode ser visto no Painel A. As placas utilizando a CMC e camadas de agarose mostrou placas pequenas, claras e distintas com uma borda circular bem definido. As placas com uma sobreposição de líquido eram ligeiramente mais abundante e maior em comparação a agarose e as placas de CMC, e proporcionada uma fronteira menos distintas. Os títulos virais foram comparados no Painel B com todas as sobreposições de realização comparavelmente.

A fim de obter uma comparação visual mais clara entre sobreposições para MP12, juntamente com uma amostra maior para determinar reproduçõeslidade, uma placa de 6 poços foi também testadas em triplicado (Figura 2). No formato de placa de 6 poços, a utilização de uma sobreposição de placas CMC apresentaram menores do que quer camadas de agarose ou líquidos, que eram comparáveis ​​em tamanho para o outro. Apesar de os títulos virais foram semelhantes entre todos os três sobreposições (Painel D), placas formadas em camadas de agarose e liquidas mostrou mais fáceis de contar, devido ao seu tamanho aumentado.

Em contraste com RVFV, os títulos de VEEV e morfologia da placa entre as diferentes sobreposições variaram significativamente (Figura 3A). As placas formadas nas sobreposições CMC demonstraram uma morfologia clara e distinta quando se utiliza um formato de placa de 12, à custa do tamanho da placa e sensibilidade (Painel B). Em contraste com a CMC, a utilização de líquidos de agarose e sobreposições resultou em placas significativamente maiores, indicando menor inibição viral e aumento da sensibilidade à replicação VEEV. Isto foi confirmado anteriormente, quando apenas comparando agarose contra CMC em apaper publicado por Juarez et al. ^4. Enquanto agarose e líquidos produzidos sobreposições placas maiores do CMC, as placas tinham fronteiras mal definidas e eram difíceis de contar em um formato bem 12, com sobreposições de líquidos que fornecem a maior difusão fronteira. Quando as placas foram testadas em placas de 6 poços (Figura 4), ​​o maior 6 formato bem negada a emissão de placas abertamente grandes que eram difíceis de diferenciar, no formato de 12 poços, com agarose e sobreposições líquidos provando superior às sobreposições CMC em termos de definição de placa bacteriana e sensibilidade (Figura 4D).

Em comparação com RVFV ou VEEV, influenza oferece vários desafios quando da formação das placas, como a exigência de uma protease externa. A sensibilidade do vírus da gripe de diferentes selecções de sobreposição, também tem sido bem documentada no passado como alterações significativas foram notadas quando as modificações como menores, tal como as marcas de agarose ser diferentes têmen usado ^9.

Curiosamente para a estirpe de gripe B Taiwan, a utilização de CMC como uma sobreposição resultou em placas marcadamente menores que eram difíceis de contar e provou difícil de marcar de forma fiável (Figura 5A). A utilização de uma sobrecamada de agarose que proporcionaram os melhores placas (Painel C), e resultou em uma mancha mais escura do fundo (provavelmente devido ao aumento da viabilidade monocamada), e mostrou placas mais claras e nítidas em comparação directa com a utilização do líquido de sobreposição (Painel B ).

Uma vantagem distinta de polímeros líquidos e sólidos mais de sobreposições semi-sólidas, tais como agarose e CMC, reside na facilidade de remoção e de aplicação. Sobreposições de semi-sólidos requerem aquecimento e solidificação pode revelar-se problemática quando o manuseio e remoção. A fim de aproveitar essas vantagens e para determinar a viabilidade de utilizar Avicel de uma forma de alto rendimento para RVFV, um formato de placa de 96 poços foi julgado em diferentes concentrati sobreposiçãoons (Figura 6). Para RVFV MP-12, diluições foram realizadas em quadruplicado em ambos os 0,6 e 1,2% concentrações finais de Avicel. Recobrimento e remoção provou simples, sem diferenças aparentes entre as repetições ou entre as concentrações observadas, demonstrando um alto grau de reprodutibilidade. Quando conseguir, as placas eram distintos e contáveis ​​a olho nu, o que demonstra a viabilidade de utilização de sobreposições de líquidos de um modo de elevado rendimento para RVFV.

Figura 1:. RVFV comparações de placas de sobreposição utilizando placas de 12 poços Veros foram plaqueadas a 2,5 x 10 ⁵ células em placas de 12 poços e infectadas com 200 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de MP12. Após a infecção de 1,5 ml sobreposições de 0,3% de agarose, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC (c definitivaoncentrations), foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A. As placas foram contadas e titulados no Painel B.

Figura 2:. RVFV comparações de placas de sobreposição utilizando placas de 6 cavidades Veros foram colocadas em placas a 5 x 10 ⁵ células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de MP12. Três ml de sobreposições de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A, B, e C. As experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita para painéis de AC, com as placas foram contadas e titulam-se no Painel D (N = 3).

Figura 3: VEEV placa comparações de sobreposição utilizando placas de 12 poços. Veros foram plaqueadas a 2,5 x 10 ⁵ células em placas de 12 poços e infectadas com 200 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir da estirpe de vacina VEEV TC-83. Após a infecção de 1,5 ml sobreposições de 0,3% de agarose, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstrado no Painel A. As placas foram contadas e titulados no Painel B.

Figura 4:. V EEV comparações de sobreposição de placa, utilizando placas de 6 cavidades Veros foram colocadas em placas a 5 x 10 ⁵ células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul usando a mesma amostra diluída em série a partir de VEEV TC-83. Após a infecção, as sobreposições de 3 ml de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou uma CMC de 1%, foram aplicados a fim de comparar directamente as sobreposições como demonstradoem Painéis A, B e C. experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita para os Painéis A - C, com placas contadas e titulados no Painel D (N = 3).

Figura 5: Influenza comparações de placas de sobreposição células MDCK foram colocadas em placas a 5 x 10 ⁵ células em placas de 6 alvéolos e infectadas com 400 ul de inoculo, utilizando a mesma amostra diluída em série a partir de Influenza B Taiwan.. Nenhum soro fetal bovino (FBS) foi utilizado no meio de crescimento ou sobreposições, como FBS pode inibir a propagação da gripe por meio da inibição de determinadas proteases que são necessários para a fusão viral. TPCK-tripsina foi adicionada a todas as folhas de prova antes da aplicação, a fim de facilitar a fusão e a entrada viral com as células hospedeiras. Após a infecção, as sobreposições de 3 ml de agarose a 0,3%, 0,6% Avicel, ou 1% de CMC foram aplicados a fim de comparar directamenteas sobreposições, tal como demonstrado no Painel A, B e C. As experiências separadas foram realizadas de forma idêntica à descrita no Painéis A - C, com placas contadas e titulados no Painel D (N = 3). Enquanto a média foi levado para placas CMC eles provaram difícil contar confiável como eles demonstraram fronteiras difusas e tamanhos de placas muito pequenas.

Figura 6:. Sobreposições de placas High Throughput Uma placa de 96 poços de Veros colocadas em placas a 3 x 10 ⁴ culas por po, foram infectados com 50 ul de inoculo, utilizando a mesma amostra diluída em série a partir de RVFV MP12 durante 1 hora, em quadruplicado. Para as sobreposições, 0,6 e 1,2% de Avicel concentrações finais foram testadas a fim de determinar a viabilidade de utilização de reprodutibilidade e sobreposições de líquidos de um modo de elevado rendimento, Painéis A e B.

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo de celular	Vero	Vero	MDCK
Período de infecção	1 hr	1 hr	45 min
O tempo de incubação	3 dias	2 dias	3 dias

Tabela 1: Placa condições do ensaio de inoculação e Celulares Tipos

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo celular	Vero	Vero	MDCK
Tipo de Crescimento	DMEM 1	DMEM 1	DMEM 2
Placa de mídia	A 2xEMEM	A 2xEMEM	2xEMEM B

1. Dulbecco Modified Eagle Médium suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / Estreptomicina.
2. Dulbecco Modified Eagle Médium suplementado com 1% de L-glutamina, 1% Penicllin / Estreptomicina, 0,2% Albumina de Soro Bovino, 0,025% de HEPES, DEAE-dextrano com 50 ug / ml.
A. 2x Meios Essencial Mínimo (500 ml) suplementado com FBS a 5% (25 ml), 1% Mínimo essenciais Amino Acids (5 ml), 1% de piruvato de sódio (5 ml), 1% de L-Glutamina (5 ml), 2% de Pen / Strep (10 ml).
B. 2x Meios Essencial Mínimo (500 ml) suplementado com 0,2% de albumina de soro bovino, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), com 50 ug / ml, 0,025% de HEPES, DEAE-Dextrano, Tripsina-TPCK *
* Pouco antes da preparação, adicione 1 ml por cada 25ml de 2 mg / ml de TPCK-tripsina à alíquota que será utilizado para misturar com agarose para placas.

Tabela 2: Placa e Viral / Cellular Crescimento Medias

	RVFV	VEEV	Influenza B
Tipo de celular	Vero	Vero	MDCK
Período de infecção	1 hr	1 hr	45 min
O tempo de incubação	3 dias	2 dias	3 dias

Soluções de sobreposição não irá expirar quando feito desde que a esterilidade seja mantida.

Tabela 3: Sobreposições da

	6 bem	12 bem	96 bem
N ° de células / poço	5 x 10 5	2,5 x 10 5	3 x 10 4
Volume de inóculo (ul)	400	200	50
volume de sobreposição (ml)	3	1,5	0.100

Tabela 4: Formatos de Placa

Discussão

O factor mais crítico para um ensaio de placa de sucesso encontra-se na optimização do protocolo para a cultura viral particular em questão como condições podem variar significativamente. Pontos-chave a ter em conta são: sediar compatibilidade celular com o vírus em questão, as condições de crescimento virais apropriadas, faixas de diluição suficientes, a fim de diferenciar claramente placas e seleção sobreposição correta e coloração para as células e os vírus em questão.

Enquanto VEEV e RVFV tanto crescer sob condições muito semelhantes, utilizando muitos dos mesmos tipos de células hospedeiras, as diferenças na cinética de crescimento e morfologia de placas variar significativamente. Ao usar células Vero para ensaios de placa, que têm sido usados ​​tradicionalmente como uma linha de células de propagação e indicador de vírus da febre hemorrágica e alphaviruses, VEEV tipicamente cresce para títulos mais altos do que RVFV e demonstra um aumento da cinética de replicação, o desenvolvimento de placas uniformes grandes às 48 hpi ^{4, 10-12.} Em contraste com VEEV, RVFV requer 72 hpi e demonstra placas que são tipicamente muito menor e variável em tamanho.

Em oposição a RVFV e VEEV, o vírus da gripe é altamente específico da célula hospedeira e pode ser difícil de propagar através de cultura de tecidos. Para o vírus da gripe, a entrada viral e fusão é normalmente iniciado pela ligação do receptor da superfície celular com a glicoproteína hamagglutinin viral (HA), que medeia a entrada na célula-alvo através da ligação com o receptor da superfície ácido siálico-α da célula hospedeira. HA trimérico é uma glicoproteína que está presente no envelope da membrana de todos os vírus Influenza e requer clivagem para a subunidades HA1 e HA2 por uma protease célula hospedeira específica. Para complicar ainda mais a questão, estes sítios de clivagem muitas vezes pode variar entre ¹³ cepas virais. À medida que a expressão de proteases capazes de clivar HA é restrita a tecidos específicos, proteases ARe frequentemente adicionadas ao meio de cultura de células, a fim de facilitar a fusão viral e a entrada na célula hospedeira seleccionada ^13. TPCK-tripsina é um exemplo de uma protease vulgarmente utilizado que é usado em cultura de células MDCK com ambos e células Vero: facilitar a replicação multi-ciclo (na ausência de qualquer soro de inactivação da tripsina) por meio da activação proteolítica de HA viral ^14,15.

Como demonstrado neste estudo e outros, as diferenças no ciclo de vida viral pode influenciar seleções de sobreposição, formatos de placas, e tempos de coleta, com variações significativas entre as diferentes classes e espécies de vírus. Em nosso estudo, camadas de agarose demonstrou placas claras em títulos mais elevados do que qualquer CMC ou sobreposições de líquidos, tanto para RVFV e vírus Influenza B, reforçando sua utilidade entre uma ampla gama de vírus e tipos de células. Usando uma baixa concentração final de agarose muito auxiliado na remoção dos plugues sólidos e coloração simplificada. CMC global mostrou a poorest eficácia como uma cobertura para todos os três vírus testados e muito pequenas e indistintas placas produzidas para o vírus da Influenza B. Embora CMC global mostrou as características menos desejáveis, a sua utilização em rápido crescimento e extremamente virulentas vírus poderia revelar-se vantajoso, como o fez aparecer para reduzir o tamanho da placa com apenas uma redução mínima na titulação. A sobreposição de líquido provou ser o mais versátil na medida em que era extremamente simples de preparar, maior facilidade de utilização, e a agarose foi comparável em todos os vírus seleccionados. Num formato de placa de maior rendimento de 96 poços, aplicação e remoção não foi inibida devido à solidificação como com sobreposições tradicionais, e proporcionaram resultados precisos e consistentes. A consideração ao usar sobreposições de líquidos reside na coloração opaca e incapacidade de controlar a formação de placas como as placas não podem ser movidos até o ponto de coleta, limitando essa adaptação ao vírus com cinética de replicação anteriormente caracterizados.

Pequenas modificações nas condições de ensaio de placa pode alterar significativamente os resultados, bem como a avaliação e desempenho de qualquer novo sistema ou técnica é sempre garantido. Enquanto um protocolo de ensaio de placa otimizada e padronizada não existe para cada situação, o nosso relatório demonstram a versatilidade e facilidade de uso em tradicional, bem como sobreposições de líquidos para novos ensaios de placa, proporcionando um fundo suficiente para mais modificações do usuário.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well CellStar plate for tissue culture	Greiner Bio-One	658 160
12-well CellStar plate for tissue culture	Greiner Bio-One	665 180
96-well CellStar plate for tissue culture	Greiner Bio-One	655 180
96-2ml deep well plate	USA Scientific	C15046314	For serial dilutions
DMEM	Quality Biologicals	112 013 101	Cell Media/Diluent
2x EMEM for plaques	Quality Biologicals	115 073 101	Warm to 37 °C
MEM 100x	Cellgro	25 025 Cl
Sodium Pyruvate	Cellgro	25 000 Cl
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140 122
L-Glutamine	Gibco	25030 081
HyClone FBS	Thermo Scientific	SH30910.03	Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldritch	A7030-50G
Trypsin TPCK	Sigma Aldritch	T1426-50mg	Make aliquots/Avoid freeze thawing
HEPES	Gibco	15630-080
DEAE-Dextran	Sigma Aldritch	D9885-10G
Crystal Violet	Sigma Aldritch	C3886-25G
Formaldehyde Solution	Sigma Aldritch	F8775-500ml
Ethanol denatured Reagent Grade	Sigma Aldritch	362808-1L
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Shake vigorously when reconsitiuting  for >30 min to homogenize
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity	Sigma Aldrich	C4888