A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar as interações entre a Whole Humano Sangue e endotélio

Resumo

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Resumo

A maioria de todas as doenças conhecidas são acompanhadas por perturbações do sistema cardiovascular. Os estudos sobre a complexidade das vias que interagem activados durante a patologias cardiovasculares são, no entanto, limitada pela falta de métodos robustos e fisiologicamente relevantes. De forma a modelar eventos patológicos vasculares temos desenvolvido um ensaio in vitro para estudar a interacção entre o endotélio e sangue total. O ensaio consiste em células endoteliais humanas primárias, que são colocados em contacto com o sangue total humano. O método utiliza sangue nativo com muito pouco ou nenhum anticoagulante, permitindo estudo das interacções entre os componentes delicados moleculares e celulares presentes em um vaso sanguíneo.

Foi investigada a funcionalidade do ensaio, comparando a activação da coagulação por diferentes volumes de sangue incubadas com ou sem células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC). Considerando um volume de sangue maior contribuído paraum aumento na formação de trombina antitrombina (TAT) complexos, presença de HUVEC resultou na activação da coagulação reduzida. Além disso, foi aplicada a análise de imagens de fixação de leucócitos para HUVEC estimulado com fator de necrose tumoral (TNF) e encontrou a presença de células CD16 ⁺ para ser significativamente maior em TNFa estimulou as células, em comparação com células não estimuladas após o contato do sangue. Em conclusão, o ensaio pode ser aplicado para estudar as patologias vasculares, em que as interacções entre o endotélio e o compartimento do sangue são perturbados.

Introdução

Métodos de análise de interações vascular de sangue na doença cardiovascular geralmente envolvem experimentos de pesquisa animal. Resultados criados em modelos animais experimentais de pesquisa pode, no entanto, têm pouca ou nenhuma incidência da doença humana ^1,2 Como tal., Existe uma necessidade de uma boa e fiável em modelos in vitro para investigar interacções celulares entre o compartimento do sangue e as células endoteliais vasculares em um sistema semelhante à humana. Temos, portanto, estabeleceu um modelo de câmara de células endoteliais do sangue. Este baseia-se num modelo descrito anteriormente utilizados para investigar interacções entre os biomateriais e sangue humano inteiro. ³ Contrariamente a outras configurações onde in vitro geralmente limitado número de componentes purificados, isto é, trombócitos, leucócitos ou células endoteliais estão disponíveis, o presente modelo incorpora todos os componentes presentes em um vaso sanguíneo.

A configuração do endotelial sangue cmodelo de câmara ell é projetado para permitir o uso de sangue humano recém-colhida com pouco ou nenhum anticoagulante adicionada. Sangue armazenado durante períodos de tempo mais longos adquirir chamada lesões de armazenamento, onde quebra de eritrócitos podem interferir com delicadas interacções entre o sangue e as células endoteliais ^4.

Para evitar a formação de coágulos durante o manuseio de sangue total ex vivo requer ou altas doses de anticoagulante ou que todo o material em contato com o sangue tem que ser não-activação. Como superfícies não-activação são raros no ambiente de laboratório, os materiais podem, alternativamente, ser equipado com uma camada protectora de heparina imobilizada. Uma camada protectora de heparina imobilizada (daqui em diante referida como superfície Corline heparina (CHS)) que pode ser aplicado à maioria dos materiais que criam uma superfície de contacto com o sangue, onde pode ocorrer sem causar uma activação da cascata de coagulação. ⁵ Assim, por fornecer as câmaras com CHS, a ce endotelial sanguell modelo de câmara permite a utilização de concentrações muito baixas de anticoagulante no sangue. Evitando a adição de elevadas concentrações de anticoagulante no modelo de câmara endotelial sangue faz com que seja possível estudar interacções sensíveis no interior de um vaso sanguíneo que de outro modo poderiam ser mascarados ^6.

O modelo de câmara da célula endotelial arterial consiste de duas câmaras formadas anexando cilindros de plástico (altura: 8 mm; Radio: 9 mm) para uma lâmina de microscópio de plástico. Os bordos virados para cima sobre os cilindros estão equipados com ranhuras que são equipados com anéis de vedação de borracha usados ​​para vedar as câmaras de encontro à corrediça de cultura de células. As câmaras são só parcialmente cheios com o sangue como o ar deixado na câmara mantém o sangue em circulação, quando as câmaras são posteriormente rodado na posição vertical (Figura 1).

A fim de avaliar a funcionalidade do modelo, foi realizada experimentos com qualquer uma CHS completamente revestidocâmara ou Umbilical Humano Veia células endoteliais (HUVEC). Dois volumes separados de sangue foram ensaiadas e a formação de trombina antitrombina (TAT), complexos de (um marcador indirecto de coagulação) foi medida com o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Em seguida, avaliaram o efeito de volumes de sangue e fator de necrose tumoral (TNF) estimulou as células endoteliais sobre o recrutamento de leucócitos por análise de imagem.

Figura 1. Configuração do modelo de câmara de células endoteliais do sangue. (A) Vista superior de desenho esquemático da câmara de sangue feitos em PMMA. (B), as células endoteliais humanas primárias são cultivadas em lâminas de câmaras 1 poços. De sangue total humano fresco é adicionado para duas câmaras numa lâmina de microscópio. As câmaras e todos os materiais utilizados para o manuseamento de sangue são tratadas com um revestimento protector HS. Depois de retirar as paredes do cell corrediça cultura, as células são colocadas de frente para o sangue e o sistema é fechado com grampos. câmaras de célula (C) O endotelial sangue são então incubadas em condições de rotação em 37 ° C. Posteriormente, as reacções no compartimento do sangue pode ser analisada por ELISA e as células endoteliais podem ser analisadas por microscopia.

Protocolo

NOTA: O sangue foi coletado de indivíduos saudáveis ​​por punção venosa sistema aberto em aprovação junto do Conselho de Revisão de Ética em Uppsala (Alvará nº 2008/264).

1. Semeadura Células

1. Culturas primárias de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) a 37 ° C em 5% de CO ₂ em frascos T75 revestidos com gelatina a 1% em PBS pH 7,4.
2. Remover o meio de cultura a partir de um frasco T75 contendo HUVEC (ou outro tipo de células endoteliais humanas primárias) e lavar as células com EDTA 2,1 mM em PBS, pH 7,4. Separar as células por adição de 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA e incubando durante 2-3 min em 37 ° C.
3. Recolher as células por lavagem do frasco com 9 ml de 10% de FBS em PBS pH 7,4 e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml. Girar as células a 735 xg durante 5 min.
4. Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento de células em meio de crescimento celular endotelial microvascular (CE GMMV) e contar as células numa câmara de Burker. Semente 21.000 cells / cm ² em 1 poços lâminas de cultura de células e incubar a 37 ° C. As HUVEC confluentes depois vai ser 1-2 dias de cultura. Monitorar a morfologia celular e confluência diariamente sob um microscópio de luz.

2. Preparação de Sangue Total

1. Preparar todas as superfícies artificiais que estarão em contacto com o sangue com uma dupla camada de heparina imobilizada (CHS) de acordo com as instruções do fabricante. CHS materiais revestidos protegidos do pó pode ser armazenado a temperatura ambiente até 6 meses, sem perda de função.
2. Use punção venosa sistema aberto para extrair o sangue de um dador saudável pouco (<30 min) antes de iniciar o experimento câmara endotelial arterial. Pares de uma agulha hipodérmica (18 G x 50 mm) com a HSC tubo flexível de silicone revestido (diâmetro interno: 2 mm), antes de recolher o sangue cuidadosamente num tubo de 50 ml revestido a CHS. Suplemento de sangue com heparina não fraccionada para alcançar uma concentração final de 0,75 UI / ml. Misture delicadamente o sangue por inverting o tubo 2-3 vezes.

3. Sangue endotelial Câmara Modelo

1. Fabricar câmaras de sangue (Figura 1A; vista superior) em polimetilmetacrilato acrílico (PMMA), que consiste de dois cilindros (oito milímetros de altura e raio 9 mm) que são coladas a uma lâmina de PMMA (25 x 75 mm). Montar as bordas dos cilindros virados para cima com borracha O-rings para vedar a câmara sanguínea contra as lâminas de vidro com as células endoteliais em cultura (Figura 1B). Rodar as câmaras sanguíneas ligados ao slide de cultura com células endoteliais em seguida numa posição vertical (Figura 1C).
2. Use uma ponteira CHS revestido de transferir 1,5 ml de sangue para cada CHS revestidos câmara com cuidado para não ativar o sangue.
3. Transferir 1 ml de sangue em tubos de microcentrífuga contendo 30 ul de EDTA 0,34 MK ₃ para atingir uma concentração final de 10 mM de K ₃ EDTA para determinação das concentrações plasmáticas de proteína inicial usandoum ensaio imunoenzimático (ELISA). Misturar cuidadosamente o sangue e manter os tubos em gelo.
4. Retirar as paredes de plástico das lâminas de vidro de cultura de células de acordo com as instruções do fabricante e lava-se cuidadosamente as células em PBS pH 7,4. Certifique-se de remover posteriormente o máximo de líquido possível dos slides. Não deixe que as células secar.
5. Colocar a lâmina no topo das câmaras sanguíneas, com células de frente para o sangue. Prenda o slide, colocando uma braçadeira ao redor da câmara de células endoteliais do sangue. Use uma lâmina de plástico para suporte adicional para evitar a ruptura da cultura de células de vidro deslizante ao colocar a braçadeira.
6. Fixar a câmara de células endoteliais do sangue em uma roda giratória (40 cm de diâmetro) coloque em um banho de água a 37 ° C. Rodar cada câmara na roda a 0,5 xg durante 30 min.
7. Após a incubação, desmontar a câmara da célula endotelial arterial. Lavar as lâminas de cultura de células em PBS pH 7,4 e consertar as células em gelo frio 1% de paraformaldeído (PFA) fou 10 min. Transferir 1 ml de sangue de cada câmara para tubos de microcentrífuga contendo 30 ul de EDTA 0,34 MK ₃ para atingir uma concentração final de 10 mM de K ₃ EDTA e misturar os tubos suavemente. Manter os tubos em gelo.
8. Centrifugar os tubos a 4560 xg durante 10 min em 4 ° C. Transfira o plasma sanguíneo para novos tubos de microcentrifuga e armazenamento em -70 ° C até análise posterior.

4. Análise de Sangue endotelial Interações

1. Realize coloração de imunofluorescência com o mouse anti-CD16 humano seguido de cabra secundário anti-rato Alexa 488 e phalloidin-TexasRed. Executar cada etapa de coloração durante 1 hora à temperatura ambiente e lava-se as lâminas em PBS pH 7,4 entre cada passo. Contracoloração os núcleos com DAPI durante 10 min a temperatura ambiente. Analise componentes sanguíneos ligados às células endoteliais por microscopia de fluorescência, em combinação com análise de imagem utilizando software de análise de imagem adequado, tal como CellProfiler.
2. Quantify as reacções no compartimento de sangue com trombina-antitrombina (TAT) como ELISA acordo com as instruções do fabricante das amostras de plasma.
3. Use ferramentas estatísticas adequadas, por exemplo., Um teste t não pareado, para analisar os dados.

Resultados

A necessidade do CHS Coating

A fim de medir as reacções específicas em sangue total para aqueles induzido pelas células endoteliais, todos os materiais utilizados para a câmara da célula endotelial arterial deve ser fornecida com um revestimento CHS antes da utilização. A Figura 2A (à esquerda) mostra uma câmara não revestidos após 30 min de contato do sangue com um presente coágulo claramente visível. Tratar com a câmara de CHS (Figura 2A, à direita), por outro lado protege o sangue a partir da activação descontrolada, assegurando que os resultados são devido às interacções de células endoteliais-sangue.

O efeito do volume de sangue na Câmara

Ativação da coagulação é mais provável em sangue estagnado como a probabilidade de interação entre os fatores de coagulação ativados é aumentada. No modelo de câmara da célula endotelial de sangue, o sangue é mantido em movimento, devido à circulação de uma bolha de ar no interior da câmara. Em order para determinar o efeito das variações no volume de sangue, e portanto, também o tamanho da bolha de ar, uma câmara de CHS revestido foi ligado a uma lâmina de vidro revestida CHS que foi testada com 1,5 ml ou 1,75 ml de sangue total para 30 minutos. O volume de sangue sem qualquer movimento pela bolha de ar é 2,5 vezes maior quando 1,75 ml de sangue é adicionado à câmara quando comparado com 1,5 ml de sangue é usado (Figura 2B). Os valores medidos TAT sugeriu aumento TAT-formação com o aumento do volume de sangue (Figura 2D). Quando HUVEC (Figura 2C) foram incubadas ou com 1,5 ou 1,75 ml de sangue completo, nenhuma diferença foi observada entre os dois grupos, sugerindo que as células endoteliais podem modular a activação da coagulação (Figura 2D).

O efeito do TNF no recrutamento de células do sangue e ativação da coagulação

A fim de estudar o efeito do TNFa sobre o recrutamento de leucócitos, as HUVEC foram mimoed com 20 ng / ml TNF 4 horas antes do contato do sangue. O contato do sangue - quer com 1,5 ml ou 1,75 ml de sangue - foi continuada durante 30 min, após o que as lâminas de cultura foram coradas para CD16 (Figura 2F), representada por imagem e o número de células CD16 ⁺ foi quantificado. O recrutamento de células CD16 ⁺ aumentou significativamente com o tratamento com TNFa (Figura 2E) 100-256 células CD16 ⁺ / mm ² (p <0,0001), com 1,5 ml de sangue e 172-378 (P <0,0001) com 1,75 ml de sangue. A formação de complexos de TAT foram medidos nas amostras de plasma correspondentes do sangue incubadas com células ou TNFa tratados ou não tratados (Figura 2G). Células de TNFa estimulada induzida uma duplicação aproximada dos complexos de TAT em comparação com células não tratadas.

Figoure 2: Funcionalidades do modelo de câmara de células endoteliais do sangue. (A), com ou sem câmaras CHS foram incubadas com sangue inteiro. Sem CHS, um coágulo foi formado após 30 min. Medição da trombina-antitrombina (TAT) complexos, um marcador indireto de coagulação, no sangue incubadas sem CHS foi> 6000 mg / ml. (B) O volume de sangue não continuou se movendo pela bolha de ar em rotação varia de acordo com diferentes volumes de sangue. Com a adição de 1,5 ml de sangue, este volume será de 0,3 ml, ao passo que irá aumentar para 0,74 ml com a adição de 1,75 ml. (C) HUVEC com imagens de microscopia de contraste de fase típica mostram a morfologia das células endoteliais de uma monocamada confluente antes de contato do sangue. (D) os valores TAT para câmaras completamente CHS revestidos mostram uma ligeira diferença quando diferentes volumes de sangue são adicionados. A adição de 1,5 ml de sangue resultou em 35 ± 11 ug / ml (n = 7) em comparação com 1,75 ml, o que resultou em 8577; 70 ug / ml de TAT (n = 8). Esta diferença já não está presente quando as HUVEC foram incubadas com os mesmos volumes do sangue; 66 ± 55 ug / ml para 1,5 ml (n = 5) e 66 ± 29 ug / ml para 1,75 ml (n = 7). (E) Quantificação do número de células CD16 ⁺ presentes em ambos não estimuladas ou estimuladas TNFa HUVEC depois contato do sangue. O número de células CD16 ⁺ é significativamente aumentada com TNFa estimulado células incubadas quer com 1,5 ml (basais: 100 ± 40 células / mm; TNFa: 256 ± 121 células / mm) ou 1,75 ml (basais: 172 ± 67 células / mm; TNF: 378 ± 185 células / mm) de sangue total (F) Imagens representativas de não estimulada e TNF estimulada HUVEC coradas para phalloidin (vermelho), CD16 (verde) e DAPI (azul).. Barra de escala = 250 um (L) A formação de complexos TAT é aproximadamente o dobro TNFa estimulada por células, em comparação com células não tratadas foram incubadas com sangue (1,5 ml:. 2.1 ± 0,1 vezes mais TAT, n = 3; 1,75 ml: 1,7 ± 1,0 vezes mais TAT, n = 4). Todos os valores são apresentados como média ± desvio padrão; os valores de p foram calculados por meio de testes t não pareado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Várias interacções entre a parede do vaso sanguíneo e são normalmente mantidos num estado de repouso, devido à natureza não-adesiva e anti-trombótica do endotélio. ⁷ Durante condições patológicas que envolvem inflamação, o endotélio é activado com um consequente aumento na expressão de receptor de adesão e ⁸ uma capacidade reduzida de inibir a hemostasia. ⁹ A activação dos sistemas de cascata no sangue por sua vez, amplia a trombogenicidade do endotélio causando ainda mais recrutamento de leucócitos e trombose. ¹⁰ Para obter uma melhor compreensão das interacções entre esta delicadas células endoteliais e sangue total, temos desenvolveram um novo método in vitro onde as células endoteliais em cultura são colocadas em contacto com o sangue total. Para o nosso conhecimento, a nossa configuração é o primeiro a mostrar as células endoteliais incubadas com sangue humano inteiro com nenhum ou muito pouco anticoagulante por períodos de tempo mais longos.

nt "> A sensibilidade deste sistema é activado por punção venosa sistema aberto em combinação com uma camada protectora de heparina imobilizada em todas as superfícies colocadas em contacto com o sangue. A utilização de um sistema aberto durante a recolha de sangue reduz a activação dos sistemas de cascata durante a punção venosa embora permita o uso de uma quantidade de auto-determinada de anticoagulante. tubos de sangue evacuados comercialmente disponíveis podem, no entanto, ser utilizadas, dependendo dos pontos finais pretendidos do estudo. A concentração final de anticoagulante adicionados a tubos de sistema fechado mais disponíveis comercialmente podem inibir sensível e, caso contrário difícil de estudar, interacções na configuração. ⁶ Uma superfície protectora heparina elimina adicionalmente a activação de sangue através de contacto de superfície por quaisquer outras do que as células endoteliais superfícies. ⁵ De fato, a incubação de sangue completo suplementado com uma pequena quantidade de heparina não fraccionada em câmara, sem a protecção de CHS resultou na formação do coágulo.

A bolha de ar no interior da câmara permite que a mistura do sangue durante a incubação com as células endoteliais. A fim de avaliar o efeito do tamanho da bolha de ar, foram usados ​​dois volumes de sangue diferentes. Neste modelo, medimos os níveis de TAT semelhantes independentemente do tamanho da bolha de ar nas câmaras de incubação com HUVEC. TAT foi, no entanto, aumentada com um tamanho de bolha de ar menor nos totalmente CHS tratada câmaras. Isto, em conformidade com o descrito anteriormente as propriedades das células endoteliais ^11, indica um efeito regulador sobre o aumento da activação da coagulação fornecida pelas células endoteliais que estão ausentes na câmara de CHS inerte. A bolha de ar no sistema cria um fluxo mediante a rotação da câmara. O tamanho da bolha irá afectar as forças dentro deste sistema rotativo. Isto é mostrado pelos nossos resultados na Figura 2D eram uma bolha menor cria TAT valores mais elevados representam uma diminuição da força sobre o sangue ou seja, o movimento de sangueno interior da câmara é menor e, assim, a activação do sistema de cascata ocorre a uma maior extensão. Deve mencionar-se que neste sistema que estão a criar um fluxo rotativo que irá ser diferente da velocidade através da câmara, com a maior velocidade ao longo das paredes e com o menor no centro. Isso obviamente não é um ambiente ideal no que diz respeito ao fluxo e tensão de cisalhamento para as células endoteliais, mas ainda temos um sistema de produção de resultados estáveis ​​e repetíveis. Mais condições óptimas incluiria fluxo laminar que circula na ausência de turbulência. Esta é, no entanto, não é possível no modelo representado aqui e para o nosso conhecimento de um tal sistema não está disponível até à data. Embora, existem vários sistemas de microfluido comercialmente disponíveis, que não são possíveis de se combinar com o sangue total sem ou com baixos níveis de anticoagulante adicionado ao sistema, assim, deixar de permitir a avaliação sensível adequada das interacções entre todos os componentes presentes no sangue e células endoteliais.

Além disso, houve um aumento de 2 vezes no recrutamento de células sanguíneas para TNFa HUVEC activadas em combinação com a formação de TAT duplicou independentemente do volume de sangue. Isto verifica a estabilidade do sistema de modelo e mostra também a possibilidade de usar um endotélio activado em combinação com sangue total. Futuro em diante, a câmara da célula endotelial sangue pode ser usado para investigar o recrutamento de células do sangue para as células endoteliais activadas por uma variedade de marcadores expressos em células em várias condições e fases de activação. Além disso, o modelo pode ser usado em combinação com agentes farmacológicos, a fim de avaliar os efeitos sobre as condições inflamatórias.

Em resumo, mostramos o grande benefício da combinação de um modelo de câmara com as células do sangue e vasculares humanos para criar um ser humano completo em sistema in vitro para realizar investigações relevantes da doença vascular.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)	PromoCell	C-12200	Any other type of primary human endothelial cell may be used.
Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)	PromoCell	C-22120
Gelatin	Sigma-Aldrich	G-2500	Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.
TAT ELISA	Enzyme Research Lab.	TAT-EIA-C
Mouse anti-human CD16	DAKO	F7011	Dilution 1:100
Goat anti-mouse Alexa 488	Molecular Probes	A11001	Dilution 1:500
Phalloidin-Texas Red	Molecular Probes	A22287	Dilution 1:200
DAPI	Molecular Probes	D1306	Dilution 10 μg/ml
EDTA	Sigma	E-6758
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco Life Tecnologies	25200-056
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437
1 well cell culture slides	BD Falcon	354101
Blood Chambers	NA	NA	Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS
Clamps	Office Depot	2052204
Corline Heparin Surface (CHS)	Corline Systems AB	945-00
Hypodermic needle	Terumo	NN-1850R	Size: 18 G x 5 mm
Unfractionated Heparin (UFH)	Leo Pharma	585679
K3EDTA	Alfa Aesar	1709958	Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H2O
PFA	Sigma-Aldrich	P-6148
Fluorescence microscope	Nikon	80i
Light microscope	Nikon	TS100
Image analysis software	Broad Institute	CellProfiler	Available for free at www.cellprofiler.org