Preparação e Caracterização de SDF-1α-Quitosana As nanopartículas de sulfato de dextrano

Resumo

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

Resumo

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

Introdução

O sulfato de dextrano (DS) e quitosana (CS) são polissacarídeos com múltiplas substituídos grupos sulfato carregados negativamente (em DS), ou grupos amina carregados positivamente (desacetilados CS). Quando misturado numa solução aquosa, os dois polissacáridos formar complexos de polielectrólitos através de interacções electrostáticas. Os complexos resultantes podem formar grandes agregados que irá ser progressivamente-separado da solução aquosa (ou precipitados), pequenas partículas que são dispersíveis em água (colóides). As condições específicas que contribuem para esses resultados têm sido extensivamente estudada, e foram resumidos e ilustrado em pormenor numa publicação recente ^1. Entre essas condições, dois requisitos básicos para a produção de partículas dispersíveis em água são os polímeros de carga oposta deve 1) têm massa molar significativamente diferente; e 2) ser misturado numa relação não estequiométrica. Estas condições permitirão que os segmentos poliméricos complexados carga neutra gerados pela carganeutralização para segregar e formar o núcleo da partícula, e o excesso de polímero para formar o invólucro exterior ^1. As partículas de glicanos descritos neste protocolo são destinados para a administração pulmonar, e são projetados para serem net carregado negativamente, e de dimensões nanométricas. A carga de superfície negativa reduz a probabilidade de absorção celular das partículas de ^2,3. Partículas de dimensão nanométrica facilitar a passagem através das vias aéreas distais. Para atingir este objectivo, a quantidade de DS utilizado nesta preparação é em excesso de CS (proporção em peso de 3: 1); e alta massa molecular DS (peso-médio MW 500.000) e de baixo peso molecular, CS (MW gama 50-190 kDa, 75-85% desacetilada) são usadas.

SDF-1α é um factor homing células estaminais, que exerce a função de homing através da sua actividade quimiotáctica. SDF-1α desempenha um papel importante no retorno e manutenção de células estaminais hematopoiéticas na medula óssea e no recrutamento de ProgeNitor células no tecido periférico para a reparação de lesão ^4,5. SDF-1α tem um local de ligação à heparina na sequência da proteína, o que permite que a proteína se liga à heparina / sulfato de heparano, formam dímeros, ser protegido contra a protease (CD26 / DPPIV) inactivação, e interagem com células alvo através dos receptores de superfície celular ^6-8. DS tem propriedades estruturais semelhantes às da heparina / sulfato de heparano; assim, a ligação de SDF-1α para DS seria semelhante à dos seus ligantes poliméricos naturais.

No protocolo seguinte, descreve-se a preparação de nanopartículas de SDF-1α-DS-CS. Os procedimentos representam uma das formulações que foram previamente estudadas ^9. O protocolo é originalmente adaptado de uma investigação do VEGF-DS-CS nanopartículas ^10. Uma preparação em pequena escala é descrito, o qual pode ser facilmente dimensionado para cima com as mesmas soluções de reserva e as condições de preparação. Após a preparação, as partículas são caracterizadas by examinar seu tamanho, potencial zeta, a extensão da incorporação SDF-1α, in vitro tempo de liberação e atividade do incorporada SDF-1α.

Protocolo

1. Preparação de SDF-1α Glicano Nanopartículas

Devido ao efeito da administração in vivo, esterilizar todos os recipientes, pipetas, e pontas usadas na preparação.

1. Prepare as seguintes soluções de em água ultrapura: 1% de sulfato de dextrano; NaOH 1 M (esterilizado por filtração com uma membrana PES); Quitosano a 0,1% em 0,2% de ácido acético glacial (0,8 e filtra-se através de filtros de 0,22 um, consecutivamente e ajustar o pH para 5,5 com NaOH depois); 0,1 M _ZnSO4; 15% de manitol; e 0,92 mg / ml de SDF-1α (armazenado em alíquotas a 80 ° C, e mantida a 4 ° C uma vez descongelado).
2. Esteriliza-se através de soluções de estoque 0,22 mM membranas de filtro. Avaliar os níveis de endotoxina na solução preparada com ensaio limulus amebócito lisado (LAL) coágulo de gel. Certifique-se que os níveis são <0,06 EU / ml.
3. Adicionar 0,18 ml de água ultrapura para um frasco de vidro de 1,5 ml contendo uma barra de agitação magnética. Defina a velocidade de agitação a 800 rpm. Adicionar 0,1 ml de 1%sulfato de dextrano e agita-se durante 2 min. Adicionar 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml de 0,92 mg / ml de SDF-1α solução) e agitar durante 20 min.
4. Adicionar 0,33 ml de 0,1% de quitosano, gota a gota e agita-se durante 5 min. Alterar a velocidade de agitação para o máximo e adicionar 0,1 ml de 0,1 M _ZnSO4 lentamente com uma seringa de 0,1 mL (ao longo de 1 min).
5. Retorno velocidade de agitação para 800 rpm e mexa por 30 min. Adicionar 0,4 ml de 15% de manitol e agita-se durante 5 min. Transferir a mistura reaccional para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 16.000 xg, a 4 ° C durante 10 min.
   Nota: A presença de manitol facilita a ressuspensão das partículas após centrifugação. Dependendo da compactação do sedimento, a concentração de manitol pode variar de 0% a 5%. Ressuspensão completa das partículas após cada centrifugação é crítico para evitar agregados na suspensão final.
6. Aspirar o sobrenadante e utilizar uma pipeta para remover a última gota do líquido lentamente. Adicionar 0,2 ml de 5% de manitol. Suspender o pellet com 0,5 ml, 29 G needle seringa. Adicionar 1 ml de 5% de manitol. Centrifuga-se a 16000 xg durante 15 min.
7. Repita o passo 1.6.
8. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 0,2 ml de 5% de manitol. Armazenar a suspensão de partículas a 4 ° C.
   Nota: A suspensão de partículas também pode ser armazenado congelado a -80 ° C ou liofilizado. Incluindo 5% de manitol em suspensão é essencial para evitar a agregação das partículas após congelação e descongelação ou após liofilização e re-hidratação. O manitol pode ser removido por centrifugação da suspensão, após o armazenamento.

2. A medição do tamanho de partícula e Potencial Zeta

O tamanho de partícula e potencial zeta são analisados ​​por dispersão de luz dinâmica e electroforético da dispersão de luz, respectivamente, com um analisador de partículas indicada na lista de materiais.

1. Configure os seguintes parâmetros para medição do tamanho de partícula: tempos de Capitalização: 70; Repita vezes: 4; Temperatura: 25 ° C;Diluente: água; Ajuste de intensidade: auto.
2. Dilui-se a amostra SDF-1α-DS-CS com água (diluição de 10 vezes). Carregar 100 ul da amostra a uma cuvete descartável de UV, tais como numa cuvete de Eppendorf. Coloque a célula no suporte da célula. Aguarde até que o ajuste de intensidade para chegar a "Optimum" (~ 10.000 cps). Iniciar a aquisição de dados.
3. Após a medição está completa, gravar os resultados cumulantes de diâmetro (nm) e índice de polidispersão. Calcular a média dos resultados obtidos a partir de cada uma das quatro leituras repetidas e calcular o desvio padrão.
4. Carga de 500 ul de 10 vezes a amostra diluída partícula a uma célula de fluxo para medição do potencial zeta. Configure os seguintes parâmetros para a medição: tempos de Capitalização: 10; Repita vezes: 5; Temperatura: 25 ° C; Diluente: água; Ajuste de intensidade: auto. Registam-se os resultados do potencial zeta (mV). Média, o resultado de cada um dos 5 leituras repetidas, e calcular o deviatio padrãon.

3. Quantificação de SDF-1α nas Partículas

1. Dilui-se em forma livre SDF-1α a concentrações de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, e 0,05 mg / ml em tampão de amostra de Laemmli 1,3x. Diluir 6 ul amostras SDF-1α-DS-CS com tampão de amostra de 40 ul 1,3x Laemmli. (Preparar tampão de Laemmli 4x estoque contendo 0,25 M de Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% glicerol, 0,05 mg / ml de azul de bromofenol, e 8% de 2-mercaptoetanol. Dividir a solução estoque em pequenas alíquotas a -20 e manter ° C para uso individual.)
2. Aquecer as amostras a 100 ° C durante 10 min. Agitar as amostras duas vezes (cada uma de 10 segundos à velocidade máxima) durante o tempo de aquecimento de 10 min de modo a dissociar as partículas completamente. Arrefecer as amostras até à TA durante 2 min. Centrífuga a 10.000 xg por 0,5-1 min para derrubar o condensado de água. Vortex novamente para misturar bem.
   Nota: Neste ponto, a solução da amostra deve ser límpida sem precipitados visíveis presentes.
3. Carga 10 &# 181; l sample / bem a um gel SDS 4-20%. Executar electroforese a 200 V durante 20 min. Manchar o gel com Coomassie mancha azul proteína.
4. Examinar a densidade de banda de proteína de SDF-1α usando um gerador de imagens e análise de densitometria software molecular. Calcular a quantidade de SDF-1α nas partículas contra uma curva padrão construída com padrões SDF-1α livres.

4. Ensaio de Libertação In Vitro

1. Misturar partículas de glicano SDF-1α com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco sem cálcio e magnésio (D-PBS) a uma proporção de 1: 1 (v / v).
2. Dividir a suspensão de partículas em 0,05 ml de partes alíquotas em tubos de 1,5 ml. Coloque as amostras para o fundo dos tubos. Evitar a introdução de bolhas de ar ou perturbar a superfície do líquido. Selar o topo dos tubos com parafilme.
   NOTA: Ao fazer isso, o líquido irá permanecer na parte inferior durante a rotação de cima para baixo subsequente sobre o misturador tubo.
3. Gire os tubos a 37 &# 176; C em um giro Micro-Tube Mixer. Retirar as alíquotas de nos tempos designados, e imediatamente centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
4. Separa-se os sobrenadantes e peletes, e reconstituir o sedimento com 0,05 ml de D-PBS. Armazenar as amostras a -20 ° C. Depois de todas as amostras são recolhidas, examinar-se os sobrenadantes e peletes sobre um gel de SDS como descrito acima.

5. Migration Assay

Este ensaio mede a actividade quimiotáctica de SDF-1α. Interacção de SDF-1α com o seu receptor (CXCR4) na superfície da célula causa a migração da célula no sentido do gradiente de SDF-1α. Neste ensaio, as células são carregadas para um bem superior (separados por uma membrana semi-permeável, a partir de um poço inferior) e SDF-1α solução em um tubo inferior.

1. Diluir SDF-1α (forma livre ou ligado a partículas) com tampão de migração (meio RPMI-1640 contendo 0,5% de albumina de soro de bovino) na proporção de 3-FOld diluição em série para as concentrações finais de 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, e 0,05 ng / ml.
2. Adicionar 0,6 ml de solução a SDF-1α diluída ou tampão de migração apenas (controlo negativo) a uma cavidade da placa de 24 poços. Adicionar tampão migração 0,57 ml a um bem (controle de célula de entrada). Incubar a 37 ° C durante 30 min. Coloque uma inserção de cultura de célula Transwell permeável tal como (tamanho de poro de 5 um, 6,5 mm de diâmetro) na parte superior do poço inferior. Carregar 0,1 ml de células de Jurkat (5 x 10 ⁵⁾ para inserir o Transwell. Coloque 0,03 ml de células directamente para a célula de entrada de controlo bem. Incubar a placa a 37 ° C durante 2 horas numa atmosfera de 5% de _CO2.
3. Remova as inserções Transwell. Transferem-se as células que migraram para os poços inferiores a um tubo de poliestireno de 4 ml. Contar as células migraram com um citômetro de fluxo.
4. Calcular a migração como uma percentagem do número de células de entrada (o número de células no controlo de célula de entrada bem x 100/30) após subtracção dos números em negative controles (células migraram para os poços contendo tampão migração só).

Resultados

O tamanho e potencial zeta das partículas preparadas SDF-1α-DS-CS são determinadas com um analisador de partículas. A Figura 1 mostra a análise da medição do tamanho. A partir dos resultados obtidos a partir de quatro cumulantes medições repetidas, o diâmetro hidrodinâmico médio das partículas SDF-1α-DS-CS é 661 ± 8,2 (nm) e a polidispersidade é de 0,23 ± 0,02. O resultado da medição do potencial zeta é mostrado na Figura 2. A partir das cinco medições repetidas, ...

Discussão

Como mencionado acima, as nanopartículas DS-CS são formados através de neutralização de cargas entre polianião (DS) e policatião (CS) moléculas. Uma vez que a interacção de cargas ocorre prontamente durante a colisão molecular, a concentração das soluções de polímero e a velocidade de agitação durante a mistura é crítica para o tamanho das partículas resultantes. A tendência geral é que DS e CS ¹⁵ soluções e maior resultado velocidade de agitação em partículas menores mais diluído...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738