Подготовка и характеристика SDF-1α-хитозан-Декстрансульфат наночастиц

Резюме

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

Аннотация

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

Введение

Декстрансульфат (DS) и хитозан (CS) являются полисахариды с несколькими замещенных отрицательно заряженных групп сульфат (в DS), или положительно заряженные аминогруппы (деацетилируется CS). При смешивании в водном растворе, два полисахариды образуют полиэлектролитных комплексов путем электростатических взаимодействий. Полученные комплексы могут образовывать крупные агрегаты, которые будут фазовое разделение из водного раствора (выделений), или мелкие частицы, которые диспергируемые в воде (коллоиды). Конкретные условия, которые способствуют этих результатов были тщательно изучены, и были обобщены и подробно показано на недавнем обзоре ^1. Среди этих условий, два основных требования для получения диспергируемые в воде частицы являются противоположно заряженные полимеры должны 1) имеют существенно различные молекулярную массу; и 2) можно смешивать в не-стехиометрическом соотношении. Эти условия позволят заряд, нейтральный образующего комплекса полимерных сегментов, генерируемых бесплатноНейтрализация отделить и образуют ядро частицы, а избыток полимера с образованием внешнюю оболочку ^1. Гликан частицы, описанные в этом протоколе предназначены для доставки в легкие, и предназначены для чистой заряжены отрицательно, и нанометровых размеров. Отрицательный поверхностный заряд снижает вероятность клеточного захвата частиц ^2,3. Частицы размерности нанометров облегчения прохождения через дистальных дыхательных путях. Для достижения этой цели, количество DS, используемый в этом препарате превышает CS (массовое соотношение 3: 1); и высокой молекулярной массой DS (средневзвешенный МВт 500000) и низкой молекулярной массой CS (диапазон MW 50-190 кДа, 75-85% деацетилированный) используются.

SDF-1α является фактором самонаведения стволовых клеток, который оказывает функцию самонаведения через его активности хемотаксиса. SDF-1α играет важную роль в самонаведения и обеспечения гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге, и найма PROGEnitor клетки к периферической ткани для ремонта травма ^4,5. SDF-1α имеет сайт гепарин-связывающей в его последовательности белка, что позволяет белок связывается с гепарином / гепарансульфата, образуют димеры, быть защищены от протеазы (CD26 / DPPIV) инактивации и взаимодействуют с клетками-мишенями через рецепторы клеточной поверхности ^6-8. DS имеет аналогичные структурные свойства, как гепарин / гепарансульфата; Таким образом, связывание SDF-1α в DS будет похож на своих природных полимерных лигандов.

В следующем протоколе мы описываем получения наночастиц SDF-1α-DS-CS. Процедуры представляют собой один из составов, которые были ранее изученных ^9. Протокол изначально приспособлены из исследования VEGF-DS-CS наночастиц ^10. Небольшой подготовки масштаб описано, которые могут быть легко расширены с тех же исходных растворов и условий приготовления. После подготовки, частицы характеризуются бу исследуя их размер, дзета-потенциал, степень SDF-1α регистрации, в пробирке время выпуска и деятельность объединенной SDF-1α.

протокол

1. Подготовка SDF-1α Glycan наночастиц

В связи с целью доставки в естественных условиях, стерилизовать все контейнеры, пипетки, а также советы, использованных при подготовке.

1. Подготовьте следующие растворы измерении воды: 1% сульфата декстрана; 1 М NaOH (стерильно фильтруют через мембрану PES); 0,1% хитозана в 0,2% ледяной уксусной кислоты (фильтр через 0,8 и 0,22 мкм фильтры последовательно и регулировать рН до 5,5 с помощью NaOH после); 0,1 M ZnSO _4; 15% маннита; и 0,92 мг / мл SDF-1α (хранили в аликвотах при 80 ° С, и выдерживают при 4 ° C После оттаивания).
2. Стерилизовать растворы через фильтр 0,22 мкм мембраны. Оценка уровня эндотоксина в приготовленном растворе с Лаймулус amebocyte лизат (LAL) гель сгустка анализа. Убедитесь, что уровни <0,06 EU / мл.
3. Добавить 0,18 мл сверхчистой воды в стекл нный сосудик на 1,5 мл, содержащую магнитную мешалку. Установите скорость перемешивают при 800 оборотах в минуту. Добавить 0,1 мл 1%сульфат декстрана и перемешивают в течение 2 мин. Добавить 0,08 мг SDF-1α (0,087 мл 0,92 мг / мл SDF-1α раствор) и перемешивали в течение 20 мин.
4. Добавить 0,33 мл 0,1% хитозана по каплям и перемешивают в течение 5 мин. Изменение скорости перемешиванием до максимума и добавить 0,1 мл 0,1 М ZnSO ₄ медленно с 0,1 мл шприца (более 1 мин).
5. Возвращение скорости перемешиванием 800 оборотов в минуту и ​​перемешивали в течение 30 мин. Добавить 0,4 мл 15% маннита и перемешивали в течение 5 мин. Передача реакционной смеси в 1,5 мл пробирке. Центрифуга при 16000 х г при 4 ° С в течение 10 мин.
   Примечание: Наличие маннита способствует рефиксацией частиц после центрифугирования. В зависимости от компактности гранул, концентрации маннита может изменяться от 0% до 5%. Полное ресуспендирования частиц центрифугированием после каждого очень важно, чтобы избежать агрегатов в конечной суспензии.
6. Отберите супернатант и использовать пипетку, чтобы удалить последние капли жидкости медленно. Добавить 0,2 мл 5% маннита. Приостановить осадок с 0,5 мл, 29 г урожденнаяDLE шприц. Добавить 1 мл 5% маннита. Центрифуга при 16000 х г в течение 15 мин.
7. Повторите шаг 1,6.
8. Аспирата супернатант. Ресуспендируют осадок в 0,2 мл 5% маннита. Хранить суспензии частиц при 4 ° С.
   Примечание: Суспензия частиц также может быть сохранена в замороженном виде при -80 ° С или лиофилизируют. В том числе 5% маннита в суспензии важно, чтобы предотвратить агрегацию частиц после замораживания и оттаивания или после лиофилизации и регидратации. Маннит может быть удален центрифугированием суспензии после хранения.

2. Измерение размера частиц и дзета-потенциал

Размер частиц и дзета-потенциал анализируют с помощью динамического рассеяния света и электрофоретического рассеяния света, соответственно, с помощью анализатора частиц указанного в списке материалов.

1. Настройте следующие параметры для измерения размера частиц: временами накопления: 70; Повторите раз: 4; Температура: 25 ° С;Разбавитель: вода; Регулировка интенсивности: авто.
2. Развести образец SDF-1α-DS-CS водой (10-кратным разбавлением). Загрузка 100 мкл образца к одноразовому УФ кювету, такие как кюветы Эппендорфа. Вставьте кювету в держатель клеток. Подождите для регулировки интенсивности, чтобы достичь «Оптимум» (~ 10 000 гц). Начните сбор данных.
3. После окончания измерения, записи кумулянтов результаты диаметра (нм) и индекс полидисперсности. Нормальное результаты, полученные от каждого из 4 повторных показаний и расчета стандартного отклонения.
4. Нагрузка 500 мкл 10-кратного разбавленного образца частиц в проточной кювете на дзета-потенциал измерения. Настройте следующие параметры для измерения: раз накопления: 10; Повторите раз: 5; Температура: 25 ° С; Разбавитель: вода; Регулировка интенсивности: авто. Запишите результаты дзета-потенциал (мВ). Среднее значение полученного результата от каждого из 5 повторных чтениях, и вычислить стандартное deviatioп.

3. Количественная оценка SDF-1α в частицах

1. Развести в свободной форме SDF-1α в концентрации 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, и 0,05 мг / мл в 1,3 раза Laemmli буфера для образцов. Развести 6 мкл образцов SDF-1α-DS-CS с 40 мкл 1.3x Лэммли буфера для образца. (Подготовка 4x Laemmli запаса буфер, содержащий 0,25 М Трис-HCl, рН 7,5, 8% SDS, 40% глицерина, 0,05 мг / мл бромфенолового синего, и 8% 2-меркаптоэтанола. Разделить маточного раствора в виде небольших аликвот и держать при температуре от -20 ° C для одноразового использования.)
2. Тепло образцов при 100 ° С в течение 10 мин. Vortex образцы в два раза (на 10 секунд при максимальной скорости) в течение 10 мин время нагрева для того, чтобы отделить частицы полностью. Охладить образцы до комнатной температуры в течение 2 мин. Центрифуга на 10000 мкг в течение 0,5-1 мин, чтобы сбить водный конденсат. Vortex снова хорошо перемешать.
   Примечание: В этот момент раствор образца должно быть ясно, без каких-либо видимого осадка настоящее время.
3. Загрузить еще 10 &# 181; л образца / хорошо 4-20% SDS гель. Запуск электрофореза на 200 V в течение 20 мин. Пятно гель с голубым Кумасси белков пятно.
4. Проверьте плотность полосы белка SDF-1α с помощью молекулярной тепловизором и анализа денситометрия программного обеспечения. Рассчитать количество SDF-1α в частицах по сравнению со стандартной кривой, построенной с бесплатными SDF-1α стандартам.

4. В пробирке Пробирной релиз

1. Смешайте SDF-1α гликанов частицы с фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко без кальция и магния (D-PBS) в соотношении 1: 1 (объем / объем).
2. Разделите суспензии частиц в 0,05 мл аликвоты в 1,5 мл пробирки. Загрузка образцов в нижней части трубы. Избегать введения пузырьков воздуха или нарушения поверхности жидкости. Печать в верхней части трубки с парафильмом.
   Примечание: В этом жидкость будет оставаться в нижней во время последующей верхней до нижней вращения на смеситель трубки.
3. Поворот трубы на 37 и# 176; C на вращающемся Micro-Тюбе Mixer. Удалить аликвот из труб на установленное время и сразу же центрифуги образцов при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
4. Отдельные супернатанты и гранул, и восстановить гранул с 0,05 мл D-PBS. Хранить образцы при -20 ° С. После того как все образцы собирали, рассмотрим супернатанты и гранул на геле SDS, как описано выше.

5. Миграция Пробирной

Этот анализ измеряет активность хемотаксиса из SDF-1α. Взаимодействие SDF-1α с его рецептором (CXCR4) на поверхности клетки вызывает миграцию клетки в направлении SDF-1α градиента. В этом анализе клетки загружают в верхнюю лунку (разделенные полупроницаемой мембраной из нижней а) и SDF-1α раствора в нижнюю лунку.

1. Развести SDF-1α (бесплатно или частиц связаны, образуют) с миграцией буфера (RPMI-1640, содержащей 0,5% бычьего сывороточного альбумина) в 3-FOLD последовательного разведения до конечных концентраций 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, и 0,05 нг / мл.
2. Добавить 0,6 мл разбавленного раствора SDF-1α или миграции буфер, только (отрицательный контроль), чтобы хорошо в 24-луночного планшета. Добавить 0,57 мл миграции буфера в лунку (входного контроля клетки). Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Поместите проницаемую вставку для культивирования клеток, таких как Transwell (размер пор 5 мкм, диаметр 6,5 мм) в верхней части ниже, а также. Добавить 0,1 мл Jurkat клетки (5 × 10 ⁵⁾ в Transwell вставить. Загрузка 0,03 мл клеток непосредственно в управления вводом клеток также. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 2 ч в 5% CO ₂ инкубаторе.
3. Снимите вставки Transwell. Передача клетки, которые мигрировали к нижней лунки в 4 мл полистирола трубки. Граф мигрировавших клеток с цитометром потока.
4. Рассчитать миграции в процентах от числа входных клеток (количество клеток в контроле клеточной и входного х 100/30) после вычитания чисел в negatив управления (клетки мигрировали в лунках, содержащих только буфер миграции).

Результаты

Размер и дзета-потенциал подготовленных частиц SDF-1α-DS-CS определяются с помощью анализатора частиц. На рисунке 1 представлен анализ измерения размера. Из результатов, полученных в кумулянтов четыре повторных измерений, средний гидродинамический диаметр частиц SDF-1α-DS-CS являетс?...

Обсуждение

Как упоминалось выше, наночастицы DS-CS сформированы с помощью нейтрализации заряда между полианиона (DS) и поликатиона (CS) молекул. Поскольку взаимодействие заряда происходит легко при молекулярном столкновения, концентрация полимерных растворов и перемешивание скорости во время смеши...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738