Um procedimento cirúrgico para ressecção do mouse Rib: Um Modelo de Grande Escala Repair longo osso

Resumo

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

Resumo

Este protocolo introduz investigadores para um novo modelo de grande escala reparação óssea utilizando a costela mouse. O procedimento detalha o seguinte: preparação do animal para a cirurgia, a abertura da parede torácica corpo, expondo a costela desejado a partir dos músculos intercostais circundantes, extirpando a seção desejada da costela sem induzir um pneumotórax, e fechar as incisões. Em comparação com os ossos do esqueleto apendicular, as nervuras são altamente acessível. Além disso, não fixador interno ou externo é necessário uma vez que as nervuras adjacentes proporcionam uma fixação natural. A cirurgia utiliza comercialmente fornecimentos disponíveis, é fácil de aprender, e bem tolerado pelo animal. O procedimento pode ser realizado com ou sem a remoção do periósteo circundante, e, por conseguinte, a contribuição do periósteo ao reparo pode ser avaliada. Os resultados indicam que, se o periósteo é retida, reparação robusta ocorre em 1-2 meses. Esperamos que o uso deste protocoloestimular a pesquisa em reparação de costela e que os resultados irão facilitar o desenvolvimento de novas formas de estimular a reparação óssea em outras localidades ao redor do corpo.

Introdução

Debilitante lesão esquelética, artrose crônica, e os graves problemas associados com a cirurgia reconstrutiva impactar a produtividade econômica, o bem-estar da família e qualidade de vida. Enquanto pequenas pausas e lesões podem curar razoavelmente bem, os seres humanos não são capazes de reparar defeitos grandes e, portanto, deve contar com procedimentos reconstrutivos para restaurar a estrutura e função. Reconstrução pode envolver transplante alogênico ou heterogeneic, osso morcellized, andaimes implantados, ou distração osteogênica. Infelizmente, não só existem fatores de morbidade persistentes associados a esses tratamentos, mas a força original do osso reparado é raramente alcançada. Assim, são necessárias novas abordagens clínicas.

One-way para desenvolver métodos inovadores para o tratamento de defeitos segmentares é estudar as situações em que o reparo em grande escala ocorre naturalmente. Anfíbios famosa pode regenerar elementos esqueléticos, enquanto os mamíferos são considerados limitados em thé a capacidade. No entanto, desde o início do ^século 20, alguns relatos de regeneração na costela humana foram publicados sugerindo que os humanos não podem ser tão limitado ^1-4. Atualmente este fenômeno é mais conhecido por cirurgiões plásticos que utilizam material de costela para queixo, rosto e orelha de reconstrução, mas não é mais amplamente apreciada ^5. Para estudar este reparo em mais detalhes, nós desenvolvemos um modelo cirúrgico usando o mouse. Usando este protocolo, os pesquisadores podem identificar os fatores inatos envolvidos e usar essa informação para facilitar a cicatrização óssea em outras localidades.

Há muitas vantagens em usar as costelas como um modelo para o estudo de reparação óssea. Em primeiro lugar, as nervuras circundantes proporcionar um fixador naturais (como comparado a ressecção do fémur ^6,7). Isso diminui o risco de morbidade de fixadores internos e externos e simplifica o procedimento cirúrgico. Em segundo lugar, as camadas musculares finas dos wa peitovai fornecer para fácil acesso e excelente visibilidade que fazer o ensaio comparável à conveniência de ressecções calota craniana ^8. Em terceiro lugar, em contraste com a calvárias que formam por ossificação intramembranosa, a forma de nervuras ossificação endocondral e crescer em comprimento por meio de extensão em placas de crescimento localizadas em cada extremidade de uma diáfise central. Portanto, a reparação das costelas pode ser mais comparável ao reparo dos ossos longos do esqueleto apendicular. Além disso, verificou-se que em comparação com o fémur, no periósteo da nervura é mais espessa e pode ser mais facilmente manipulado. Assim, os investigadores que desejam para ensaiar a reparação óssea com a finalidade de estudar o periósteo ou testar terapias celulares, agentes farmacológicos, e / ou suportes de tecido podem encontrar este modelo cirúrgico útil. Em resumo, este modelo de ressecção de costela fornece um contexto no qual a estudar reparação óssea em grande escala natural em mamíferos como existe tal modelo em uso geral existe atualmente.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos estão em conformidade com um protocolo de animais aprovado pelo cuidado e uso Comitê de animal Institucional (IACUC) da Universidade do Sul da Califórnia.

1. Preparação para a cirurgia

1. Separe as ferramentas e suprimentos cirúrgicos necessários (esterilizado, itens 1-18 na lista de materiais) e organizar um microscópio de dissecação e uma fibra óptica trans-iluminador em uma capa ou em uma mesa de corrente descendente.
2. Coloque um rato sexualmente maduros (20-30 g, 1-3 meses de idade) em uma câmara de indução com 4% de isoflurano para induzir a anestesia.
3. Confirme a anestesia com uma pata e / ou teste de cauda pitada.
4. Aplicar pomada para os olhos do rato para evitar o ressecamento do olho durante a cirurgia.
5. Mova o rato para o estágio do microscópio. Posicione o mouse para dentro do cone do nariz da mangueira de manutenção e posicionar lateralmente. Proporcionar uma bolsa de aquecimento adjacente ao animal para ajudar a manter a temperatura corporal.
   NÃOE:. Posição do rato é dependente de preferência pessoal e / ou destreza manual do cirurgião, do lado esquerdo ou direito está bem.
6. Ajuste isoflurano a 2 - 3% para manutenção, e assistir a freqüência respiratória.
7. Injectar buprenorfina (0,05 mg / kg) subcutaneamente (flanco lateral da perna) para a dor pós-operatória com uma agulha 25 G. A perna pode contorcer-se que é uma resposta normal.

Incision 2. Abertura

1. Detectar a costela desejado por palpação, e limpar a área de cabelo com uma máquina de barbear.
   NOTA: Reforços 8-10 são recomendados desde costelas 1-7 estão mais próximos dos pulmões e 11-13 são consideravelmente mais curto. Contando as costelas deve começar com a costela mais rostral como número 1.
2. Preparar a área alternando com povidona-iodo e de isopropanol (70%) raspagem (3x é frequentemente recomendada pelos protocolos de utilização de animais).
3. Corte de 2 cm da incisão através da pele, directamente por cima e paralela à nervura desejado com uma tesoura de microcirurgia e média dimensão. IncÉe através das camadas musculares e adiposas subjacentes.
4. Coloque todos os três camadas (pele, músculo, gordura) em um retractor para expor o local cirúrgico, minimizando o tamanho da incisão.

3. excisão do Rib

1. Corte através dos músculos intercostais que recobrem a seção desejada da costela com um bisturi 5,0 milímetros. Posição esta incisão de cerca de 5 mm proximal à articulação do condrocostais como este é onde a costela não é tão altamente curvado. Separe cuidadosamente o músculo do osso com uma pinça de ponta fina.
2. Para criar uma ressecção, mantendo o periósteo no animal, por meio de corte do periósteo, ao longo do comprimento da nervura com um bisturi 5,0 milímetros. Separe cuidadosamente o periósteo do osso subjacente lateralmente com uma pinça de ponta fina. Proceda com cuidado, como o periósteo é muito delicada e tem uma consistência gelatinosa.
3. Em seguida, faça um corte transversal através do osso numa extremidade com micro-tesouras finas. Se necessário, medir a ressecção comum retículo no microscópio ou um medidor tipo régua. Em seguida, levantar cuidadosamente o osso para fora do periósteo e cortar na outra extremidade.
   NOTA: Proceda com cuidado. Esta é a etapa mais delicada, como puxar para cima sem excisão do costela abaixo vai rasgar a membrana pleural e resultar em um pneumotórax. Se a membrana pleural é rasgada este será facilmente evidente como o interior da cavidade torácica, tornam-se visíveis.
4. Se o sangramento ocorre como um resultado de corte do osso, aplicar pressão na extremidade de corte com um cotonete para 4-5 segundos para parar a hemorragia.
   NOTA: Nas raras ocasiões em que o sangramento continua, pode ser necessário parar e sacrificar o animal a perda de sangue tão significativa comprometerá recuperação (sem reposição de líquidos, o volume máximo de sangue que pode ser seguramente ser perdido é de 10% do volume total de sangue ou 7.7 -. 8 mL / g para 25 g um rato, isso é equivalente a cerca de 180-200 mL ^9).
5. Colocar imediatamente a nervura removido emPFA 4% para análise futura.
   NOTA: Se a ressecção de ambos os ossos e do periósteo é para ser realizada, omitir o periósteo incisão e separação (passo 3.2). Desde o periósteo é muito bem ligado à membrana pleural proceder com cautela, provocando a costela longe da membrana pleural com uma pinça para evitar rasgos.

4. fechar a incisão

1. Suturar os músculos intercostais ao longo do topo da manga periosteal remanescente com 9-0 suturas (2 suturas são geralmente suficiente). Coloque as suturas diretamente acima das extremidades cortadas do costela, para atuar como indicadores para o local da cirurgia.
2. Remover o afastador. Suturar o músculo e gordura sobreposta com 9-0 suturas (3-4 suturas são normalmente suficientes). Em ratinhos com camadas particularmente espessas de músculo e / ou a gordura, suturar cada camada em separado (por exemplo, uma camada de fios de sutura para a camada muscular e uma camada de suturas para a camada de gordura).
3. Feche opele com 7-0 (4-5 suturas são normalmente suficientes).
4. Fixe a incisão com cola de sutura, apertando as bordas junto com grandes fórceps.
5. Lentamente desmamar o mouse para fora isoflurano ajustando primeiro a 1% por alguns minutos e, em seguida, desligue.
6. Posicione o mouse sob uma lâmpada de fogo e deixe até que a consciência é recuperada, 5 - 10 min. Depois de consciência é recuperada e durante todo o período de cicatrização, o rato deve mover-se e deambular normalmente e não mostram sinais de angústia.

5. Recuperação e Análise

1. Fornecer o manejo da dor pós-operatória, incluindo a administração de buprenorfina de forma oral de gelatina a 0,5 mg / kg a cada 12 horas para 48 horas. A administração oral não necessita de prender o animal que pode causar dor na região torácica.
2. Manter o rato em uma gaiola com livre acesso a comida e água durante o período de cicatrização. Após a incisão é seca, as fêmeas podem ser co-macho alojados enquantos deve permanecer isolada para evitar lutas.
3. Após o período de cicatrização, siga o procedimento aprovado para a eutanásia. Retire a caixa torácica para fixação e análise.

Resultados

Animais tipicamente recuperar rapidamente a partir deste procedimento, a incisão cura bem, e os animais exibem comportamento normal. O procedimento utiliza fontes comercialmente disponíveis e após a prática, pode ser concluído em menos de 1 hora. Antes de usar este procedimento para gerar os dados experimentais, é importante analisar a ressecção no dia 0 ponto de tempo para determinar se os fragmentos de ossos grandes pode permanecer na zona de ressecção. Uma forma de avaliar o procedimento adequado é avaliar...

Discussão

Quando aprendendo este protocolo, determinando onde localizar a incisão inicial pode ser um desafio. No entanto, a prática em ratos sacrificados ajuda o cirurgião saber onde colocar a incisão inicial e expor a costela desejado a ser ressecado. Trabalhando em cadáveres também melhora as habilidades motoras fine-necessárias para remover a porção de costela com ou sem o periósteo. Além disso, alguém novo para este procedimento pode encontrar manipular as ferramentas finas e suturas finas para ser difícil. Enqu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm)	Fine Science Tools	15003-08
Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)	Fine Science Tools	15000-04	curved tip is beneficial
Micro-scalpel 5.0 mm	Fine Science Tools	10315-12	other fine scalpels can be substituted
Dumont 55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Retractor	Fine Science Tools	17004-05	adjustability is convenient
Micro-needle holders	Fine Science Tools	12060-01
9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best	Ethicon	2819G or similar	taper point best but reverse cutting is also good
7.0 prolene sutures (Prolene)	Ethicon	8700H or similar	6-0 can be used too, needle point can vary
Large forceps (Adson Forceps)	Fine Science Tools	11006-12	other brands are fine
Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears)	Akorn	17478-062-35
Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive)	Abbot	32046-01	has excellent working time
Shaver	Wahl	9918-6171 or similar
Clamp lamp	Zoo Med	LF-5
Infrared Bulb, 75W	Zoo Med	RS-75
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
IsoFlo (Isoflurane)	Abbot	05260-05
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Betadine	Purdue Frederick	67618015017
Flavored Gelatin, raspberry	Jell-O	B000E1FYL0	made up firm, to the consistency of 'jigglers'