Una procedura chirurgica per la resezione Rib Mouse: Un modello per le grandi ossa lunghe Repair

Riepilogo

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

Abstract

Questo protocollo introduce ricercatori di un nuovo modello di grande riparazione ossea utilizzando la costola del mouse. Dettagli La procedura seguente: preparazione del animale per la chirurgia, aprendo la parete del corpo toracica, esponendo la nervatura desiderato dai muscoli intercostali circostanti, asportare la sezione desiderata della costola senza indurre un pneumotorace, e chiudendo le incisioni. Rispetto alle ossa dello scheletro appendicolare, le nervature sono altamente accessibile. Inoltre, nessun fissatore interno o esterno è necessario in quanto le nervature adiacenti forniscono una fissazione naturale. L'intervento utilizza commercialmente scorte disponibili, è semplice da imparare, e ben tollerato dall'animale. La procedura può essere eseguita con o senza rimuovere il periostio circostante, e quindi il contributo del periostio di riparazione può essere valutata. I risultati indicano che se il periostio viene mantenuta, riparazione robusto si verifica in 1 - 2 mesi. Ci aspettiamo che l'uso di questo protocollo saràstimolare la ricerca in riparazione costola e che i risultati faciliteranno lo sviluppo di nuovi modi per stimolare la riparazione ossea in altre località in tutto il corpo.

Introduzione

Debilitante lesioni scheletriche, osteoartrite cronica, ei gravi problemi connessi con la chirurgia ricostruttiva impatto produttività economica, benessere familiare, e la qualità della vita. Mentre piccole pause e le lesioni possono guarire abbastanza bene, gli esseri umani non sono in grado di riparare grandi difetti e quindi deve fare affidamento su procedure ricostruttive per ripristinare la struttura e la funzione. La ricostruzione può comportare innesti allogenici o heterogeneic, osso morcellized, ponteggi impiantati, o distrazione osteogenesi. Sfortunatamente, non solo vi sono fattori di morbilità persistenti associati a questi trattamenti, ma la forza originaria dell'osso riparato è raramente raggiunto. Pertanto, sono necessari nuovi approcci clinici.

Senso unico per sviluppare metodi innovativi per il trattamento di difetti segmentali è quello di studiare le situazioni in cui la riparazione su larga scala avviene naturalmente. Anfibi notoriamente in grado di rigenerare gli elementi scheletrici, mentre i mammiferi sono considerate limitate in thè la capacità. Tuttavia, dal momento che la prima parte del 20 ^° secolo, alcuni rapporti di rigenerazione della costola umana sono stati pubblicati suggerisce che gli esseri umani non possono essere limitati così ^1-4. Attualmente questo fenomeno è meglio conosciuto da chirurghi plastici che usano materiale costola per mascella, viso e orecchio ricostruzione, ma non è più ampiamente apprezzato ^5. Per studiare questa riparazione più in dettaglio, abbiamo sviluppato un modello chirurgica utilizzando il mouse. Usando questo protocollo, i ricercatori possono individuare i fattori innati coinvolti e utilizzare queste informazioni per facilitare la guarigione scheletrico in altri luoghi.

Ci sono molti vantaggi di utilizzare le costole come modello per lo studio di riparazione scheletrica. Innanzitutto, le nervature circostanti offrono un fissatore naturale (rispetto alla resezione del femore ^6,7). Questo riduce il rischio di morbilità fissatori interni ed esterni e semplifica la procedura chirurgica. In secondo luogo, gli strati muscolari sottili degli wa pettoll fornire un facile accesso e una visibilità eccellente che fanno il test paragonabile alla comodità di resezioni cranica ^8. In terzo luogo, in contrasto con la Calvariae che costituiscono da ossificazione intramembranosa, forma nervature da encondrale e crescere in lunghezza tramite allungamento a placche di crescita situati alle due estremità di un diafisi centrale. Pertanto, la riparazione delle costole può essere più paragonabile a riparazione delle ossa lunghe dello scheletro appendicolare. Inoltre, abbiamo trovato che rispetto al femore, il periostio della nervatura è più spessa e può essere più facilmente manipolato. Così, gli investigatori che vogliono saggiare riparazione ossea al fine di studiare il periostio o testare terapie cellulari, gli agenti farmacologici e / o impalcature tissutali potrebbero trovare questo modello chirurgica utile. In sintesi, questo modello di resezione costola fornisce un contesto all'interno del quale studiare la riparazione ossea larga scala naturale nei mammiferi in quanto tale modello in uso generale attualmente esistente.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sono in accordo con un protocollo animali approvato dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso la University of Southern California.

1. Preparazione per la chirurgia

1. Lay out gli strumenti e le forniture chirurgici necessari (sterilizzato, articoli 1-18 nella lista dei materiali) e di organizzare un microscopio da dissezione e una fibra ottica trans-illuminatore in un cappuccio o su un tavolo downdraft.
2. Posizionare un mouse sessualmente matura (20 - 30 g, 1 - 3 mesi) di una camera di induzione con 4% isoflurano per indurre l'anestesia.
3. Confermare anestesia con una zampa e / o test di coda pizzico.
4. Applicare una pomata per gli occhi del topo per evitare secchezza oculare durante l'intervento chirurgico.
5. Spostare il mouse alla fase microscopio. Posizionare il mouse nel naso cono del tubo manutenzione e posizionare lateralmente. Fornire un sacchetto riscaldamento adiacente all'animale per aiutare a mantenere la temperatura corporea.
   NONE:. Posizione del mouse è dipendente da preferenze personali e / o manualità del chirurgo, lato a destra oa sinistra va bene.
6. Regolare isoflurano al 2 - 3% per la manutenzione, e guardare la frequenza respiratoria.
7. Iniettare buprenorfina (0,05 mg / kg) per via sottocutanea (fianco laterale della gamba) per dolore post-operatorio con un ago 25 G. La gamba può contrarsi, che è una risposta normale.

Incisione 2. Apertura

1. Rileva la costola voluta da palpazione, e ripulire l'area di capelli con un rasoio.
   NOTA: Ribs 8-10 sono raccomandati dal costole 1-7 sono più vicini ai polmoni e 11-13 sono notevolmente più brevi. Contando le costole dovrebbe iniziare con la costola più rostrale come numero 1.
2. Preparare la zona con alternanza iodopovidone e isopropanolo (70%) tampone (3x è spesso raccomandato dai protocolli di utilizzo degli animali).
3. Tagliare un'incisione di 2 cm attraverso la pelle, direttamente sopra e parallela alla costola desiderata con le forbici microchirurgia medie dimensioni. Incise attraverso gli strati muscolari e adipose sottostanti.
4. Mettere tutti 3 strati (pelle, muscoli, grasso) in un riavvolgitore per esporre l'area chirurgica, riducendo al minimo la dimensione della incisione.

3. ablazione del Rib

1. Tagliare i muscoli intercostali sovrastanti la sezione desiderata della costola con un bisturi 5,0 millimetri. Posizione questa incisione attorno a 5 mm prossimale al giunto chondrocostal come questo è dove la costola non è così altamente curvo. Separare con cura il muscolo dall'osso con una pinza a punta fine.
2. Per creare una resezione mantenendo periostio nell'animale, tagliare il periostio, lungo la lunghezza della nervatura con un bisturi 5,0 millimetri. Separare con cura il periostio dall'osso sottostante lateralmente con una pinza a punta fine. Procedere con cautela, come periostio è molto delicata e ha una consistenza gelatinosa.
3. Successivo fare una sezione trasversale attraverso l'osso ad una estremità con sottili micro-forbici. Se necessario, misurare la resezione conun reticolo nel microscopio o un manometro tipo righello. Quindi sollevare con attenzione l'osso dal periostio e tagliare l'altra estremità.
   NOTA: Procedere con cautela. Questo è il passo più delicato, come tirare senza asportare la costola di seguito si strappare la membrana pleurica e il risultato in un pneumotorace. Se la membrana pleurica è strappata questo sarà immediatamente evidente come l'interno della cavità toracica diventa visibile.
4. Se l'emorragia si verifica come risultato di taglio dell'osso, applicare pressione alla fine del taglio con un panno di cotone per 4 - 5 sec per fermare l'emorragia.
   NOTA: Nelle rare occasioni che il sanguinamento continua, può essere necessario per fermare e eutanasia dell'animale come significativa perdita di sangue comprometterà recupero (senza sostituzione di liquidi, il volume massimo di sangue che può essere tranquillamente essere perso è del 10% del volume totale del sangue 7,7 -. 8 microlitri / g Per 25 g del mouse, questo è equivalente a circa 180-200 microlitri ^9).
5. Porre immediatamente la nervatura rimosso in4% PFA per le analisi future.
   NOTA: Se la resezione sia l'osso e periostio deve essere effettuata, omettere l'incisione periostio e la separazione (passo 3.2). Dal momento che il periostio è molto strettamente attaccato alla membrana pleurica procedere con cautela, prendere in giro la costola di distanza dalla membrana pleurica con una pinza per evitare strappi.

4. Chiusura della incisione

1. Suturare la muscoli intercostali sopra la parte superiore del manicotto periostio restante con 9-0 suture (2 suture sono generalmente sufficienti). Posizionare i punti di sutura direttamente sopra le estremità tagliate della costola, di agire come indicatori per posizione chirurgia.
2. Rimuovere il divaricatore. Suturare il muscolo sovrastante e grasso con 9-0 punti di sutura (3 - 4 punti di sutura sono generalmente sufficienti). In topi con particolarmente spessi strati muscolari e / o grasso, suturare ogni strato separatamente (ad esempio, 1 strato di suture per lo strato muscolare e 1 strato di suture per lo strato grasso).
3. Chiudere ilpelle con 7-0 punti di sutura (4 - 5 punti di sutura sono generalmente sufficienti).
4. Fissare l'incisione con la colla sutura, pizzicando i bordi con le grandi pinze.
5. Lentamente svezzare il mouse fuori isoflurano per primo adeguamento al 1% per alcuni minuti e poi si spegne.
6. Posizionare il mouse sotto una lampada di calore e lasciare fino coscienza è recuperato, 5 - 10 min. Dopo la coscienza è riconquistato e per tutto il periodo di guarigione, il mouse dovrebbe muoversi e deambulare normalmente e non mostrano segni di sofferenza.

5. Recupero e analisi

1. Fornire la gestione del dolore post-operatorio compresa la somministrazione di buprenorfina in forma di gelatina orale a 0,5 mg / kg ogni 12 ore per 48 ore. La somministrazione orale non richiede immobilizzare l'animale che potrebbe causare dolore alla regione toracica.
2. Mantenere il mouse in una gabbia con libero accesso a cibo e acqua durante il periodo di guarigione. Dopo l'incisione è asciutto, le femmine possono essere co-ospitati durante maschios deve restare isolato per evitare lotte.
3. Dopo il periodo di guarigione, seguire la procedura approvata per l'eutanasia. Rimuovere la gabbia toracica per la fissazione e l'analisi.

Risultati

Animali tipicamente recuperare rapidamente da questa procedura, l'incisione guarisce bene, e gli animali mostrano un comportamento normale. La procedura utilizza materiali di consumo disponibili sul mercato e dopo la pratica, può essere completato in meno di 1 ora. Prima di utilizzare questa procedura per generare dati sperimentali, è importante analizzare resezione al punto di tempo di giorno 0 per determinare se eventuali grandi frammenti ossei potrebbero rimanere all'interno della zona di resezione. Un modo...

Discussione

La prima volta che l'apprendimento di questo protocollo, determinando dove localizzare l'incisione iniziale può essere impegnativo. Tuttavia, la pratica sui topi eutanasia aiuta il chirurgo imparare dove posizionare l'incisione iniziale ed esporre la costola desiderato da asportato. Lavorare su cadaveri migliora anche le capacità fine-motorie necessarie per rimuovere la parte toracica, con o senza il periostio. Inoltre, qualcuno di nuovo a questa procedura potrebbe trovare manipolare le belle strumenti e s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm)	Fine Science Tools	15003-08
Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)	Fine Science Tools	15000-04	curved tip is beneficial
Micro-scalpel 5.0 mm	Fine Science Tools	10315-12	other fine scalpels can be substituted
Dumont 55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Retractor	Fine Science Tools	17004-05	adjustability is convenient
Micro-needle holders	Fine Science Tools	12060-01
9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best	Ethicon	2819G or similar	taper point best but reverse cutting is also good
7.0 prolene sutures (Prolene)	Ethicon	8700H or similar	6-0 can be used too, needle point can vary
Large forceps (Adson Forceps)	Fine Science Tools	11006-12	other brands are fine
Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears)	Akorn	17478-062-35
Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive)	Abbot	32046-01	has excellent working time
Shaver	Wahl	9918-6171 or similar
Clamp lamp	Zoo Med	LF-5
Infrared Bulb, 75W	Zoo Med	RS-75
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
IsoFlo (Isoflurane)	Abbot	05260-05
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Betadine	Purdue Frederick	67618015017
Flavored Gelatin, raspberry	Jell-O	B000E1FYL0	made up firm, to the consistency of 'jigglers'