Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Resumo

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Resumo

As experiências para medir as propriedades de permeabilidade dos microvasos perfundidos individualmente fornecer uma ponte entre a investigação dos mecanismos moleculares e celulares que regulam a permeabilidade vascular em monocamadas de células endoteliais em cultura e as propriedades de leitos microvasculares inteiros câmbio funcionais. Um método para canular e perfundir microvasos venulares de mesentério de ratos e medir a condutividade hidráulica da parede de microvasos é descrito. O principal equipamento necessário inclui um microscópio intravital com um palco modificado grande que suporta micromanipuladores para posicionar três microtools diferentes: (1) uma micropipeta de vidro chanfrado de canulação e perfundem o microvasos; (2) um micro-vidro oclusor para bloquear temporariamente a perfusão e permitir a medição de transvascular movimento fluxo de água a uma pressão hidrostática medida, e (3) uma vareta de vidro fechado para estabilizar o tecido mesentérico ao sítio de canulação. A Landis micro-oclusão techniq modificadoue utiliza células vermelhas suspensas no perfusato artificial como marcadores de circulação de fluido transvascular, e também permite medições repetidas destes fluxos condições experimentais são alteradas e diferença de pressão osmótica e hidrostática colóide através dos microvasos são cuidadosamente controlados. As medições de condutividade hidráulica primeiro usando um perfusado de controlo, em seguida, após a re-canulação da mesma microvasos com os perfusatos teste permitir comparações de resposta de microvasos sob estas condições bem controladas emparelhado. As tentativas para alargar o método de microvasos no mesentério de ratos com modificações genéticas que se espera modificar a permeabilidade vascular foram severamente limitada, devido à ausência de microvasos compridas rectas e não ramificados no mesentério do rato, mas a recente disponibilidade dos ratos com modificações genéticas semelhantes usando CRISPR tecnologia / Cas9 deverá abrir novas áreas de investigação onde os métodos aqui descritos podem ser aplicados.

Introdução

Microperfusão na vasculatura inclui estabelecer um fluxo de perfusato artificial de composição conhecida controlada através de uma micropipeta em um vaso sanguíneo geralmente menos de 40 um de diâmetro. O recipiente continua a ser perfundido no seu ambiente de tecido normal e é perfundido com sangue do animal até ao momento da punção. Quando usado em conjunto com uma série de imagens de vídeo ou técnicas fluorométricos, em microperfusão situ permite a medição de fluxos de água e de solutos através das paredes de microvasos em condições onde as forças de condução para estes fluxos são conhecidos e as propriedades de permeabilidade da parede vascular podem ser avaliada diretamente. Além disso, por controlo da composição do líquido que rodeia o de microvasos no tecido (perfusado e superfusate), a regulação da permeabilidade microvascular e podem ser investigadas de câmbio, permitindo que as células endoteliais que formam a parede de microvasos para ser exposta a uma variedade de econdições Xperimental (agonistas, condições de perfusão modificados, indicadores fluorescentes para medir a composição e sinalização intracelular) por períodos precisamente medidas de tempo (seg a hr). Além disso, as avaliações ultra-estruturais ou citoquímicos de estruturas moleculares celulares chave que regulam a barreira pode ser investigadas no mesmo microvasos em que a permeabilidade está diretamente medidos. A abordagem assim, forma uma ponte entre a investigação dos mecanismos celulares e moleculares para modificar a função de barreira endotelial em monocamadas de células endoteliais cultivadas e investigação em microvasos intactas. Consulte os seguintes comentários para uma avaliação mais aprofundada ^1-6.

Uma limitação de microperfusão é que ela só pode ser utilizada em leitos microvasculares que são finas, transparentes e possuem integridade estrutural suficiente para permitir a canulação com uma micropipeta de vidro. Enquanto as primeiras investigações usado microvasos rã no mesentério e fino cutânea pectoris muscle ^7,8, de longe, a preparação mais utilizada em modelos de mamíferos é o mesentério de rato ^9-15. A maioria das investigações concentraram-se em alterações agudas na permeabilidade vascular estudado ao longo de períodos de 1-4 horas, mas as investigações mais recentes foram estendidos para medições em navios individuais 24-72 horas após uma perfusão inicial ^12,16. A tecnologia CRISPR recentemente desenvolvido, que promete tornar mais modelos de ratos geneticamente modificados disponível para estudar regulação da permeabilidade vascular ¹⁷ deverá permitir que os métodos descritos na presente comunicação a ser aplicado em microvasos venulares do mesentério nestes novos modelos importantes de ratos.

O método requer um microscópio invertido equipado com um estágio de microscópio construído sob encomenda suficientemente grande para conter tanto a preparação dos animais e, pelo menos, três micromanipuladores usadas para microferramentas posição próxima do vaso e perfundidos para alinhar uma micropipeta de perfusão com o naviolúmen. Por exemplo, uma plataforma personalizada para um estágio de microscópio XY (cerca de 90 × 60 cm) pode ser fabricada a partir de uma chapa de aço de 1 cm de espessura com um revestimento à prova de ferrugem. O palco está ligado a uma tabela de índice de engenharia ou duas lâminas de cauda de andorinha montados em ângulos retos e apoiados em pilares de teflon ou transferências bola para o movimento no plano horizontal. Um equipamento típico (ver Figura 2) tem muito em comum com o microscópio e microposicionamento equipamento utilizado para uma série de experimentos microcirculação intravital tais como aqueles para medir o fluxo único dos vasos sanguíneos e hematócrito, entrega local de oxigênio pelo sangue perfusão microvasos, regulação da liso vascular tônus ​​muscular, eo acúmulo microvascular local dos marcadores fluorescentes injetadas em toda a circulação ^18-26.

O aspecto fundamental da técnica é a medição do volume do caudal (J _v) através de uma área de superfície definido (S) da parede de microvasos. Cumpriresta via a técnica Landis modificado aqui descrito um microscópio invertido simples é adequada. Uma pequena câmara de vídeo está montado na porta e o sinal de imagem de vídeo, com uma base de tempo adicional, é apresentada num monitor de video e registadas na forma digital num computador ou como um sinal digital ou analógico de um gravador de vídeo. Uma vez que a microvasculatura é canulada a porção do microvasos visível para a câmara pode ser alterado movendo o palco e manipuladores como uma unidade, sem perturbar a canulação.

Medição dos fluxos transvascular pode também ser combinado com investigações mais detalhadas, utilizando um microscópio de fluorescência com filtros adequados sofisticados, tais como sondas utilizadas para as medições de permeabilidade soluto, fluorescente monitorização relação de cálcio citoplasmático ou outros mecanismos celulares, e imagiologia confocal ^{6,12,13, 27.} Uma das principais vantagens de todas as abordagens microperfusão é a capacidade de fazer medidas repetidas, no mesmo navio, Sob a mudança controlada de força motriz, tais como pressões hidrostática e oncótica, ou mudança induzida em respostas dos vasos para condições inflamatórias. O design mais comum é uma comparação pareada da condutividade hidráulica medida (L _p) no mesmo navio com o primeiro recipiente de perfusão através de uma micropipeta preenchido com um perfusato controle e suspensão de eritrócitos para estabelecer um estado permeabilidade da linha de base, em seguida, com uma segunda pipeta com o agente de teste adicionado ao perfusado. Várias cânulas são possíveis com o ciclo repetido após reperfusão, com a pipeta de controle.

O presente protocolo demonstra a canulação e microperfusão de um navio venular em mesentério de rato para gravar fluxos de água através da parede de microvasos e medir a G _P da parede do vaso, um índice útil da permeabilidade da via comum para a água e os solutos através da intacta barreira endotelial. O procedimento é chamado de techniq Landis modificadoue porque o princípio original Landis de utilizar o movimento relativo de células vermelhas como uma medida de troca de fluido transvascular após perfusão é bloqueado é preservada ^28, mas a gama de condições experimentais (por exemplo, as diferenças de pressão oncótica hidrostáticas e albumina através da parede de microvasos) disponível depois de microperfusão é muito maior do que no sangue perfusão microvasos canulados ^8,29.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional.

1. Fabricação preliminar de Micropipetas, contenção e bloqueadores

1. Puxar vários tubos capilares de vidro de borosilicato limpas ao meio usando um extractor de electrónica ajustada de modo que, quando puxado, a parte alongada do tubo é de cerca de 1 cm de comprimento e as duas metades são um tanto simétrica. Certifique-se de que a vela é coerente com as dimensões em Figura 1. Use as duas metades para micropipetas, limitadores e bloqueadores.
   1. Bevel as micropipetas usando um rebolo ar impulsionado ^{30 com} 0,5 um papel abrasivo banhado com água. Definir o ângulo do suporte de micropipeta de modo que é cerca de 30 graus a partir da horizontal.
   2. Lave e seque as micropipetas usando sucção para puxar acetona limpa através da ponta e até o eixo. Inspecionar as micropipetas (Figura 1A), utilizando um pequeno microscópio vertical com 4 × 40 × objectivos e equipados com um titular micropipeta jacaré e um retículo ocular.
   3. Seleccione micropipetas com abertura da ponta cerca de 50 um longo com um chanfro cuja relação comprimento / largura é de entre 3,1 e 3,5 e com um ponto agudamente afilada o que ajuda a penetrar nas fibras de colágeno difíceis no mesentério.
   4. Armazenar 15-20 micropipetas de tamanhos ligeiramente diferentes em uma caixa livre de poeira.
2. Faça limitadores utilizando tubos capilares puxados preparados no passo 1.1). Segurar um tubo capilar de vidro removido brevemente perto de uma microflame para formar uma extremidade romba (Figura 1B). Armazenar vários em uma caixa livre de poeira.
3. Faça microoccluders utilizando tubos capilares puxados preparados no passo 1.1). Segure um tubo capilar puxado sob uma microflame e dobre (usando um adaptador de tubulação, por exemplo., 23G), a ponta fina (cerca de 4 mm a partir da ponta) para fazer um ângulo de cerca de 120 graus para o eixo ( Figura 1C). Fazer e armazenar vários.

2. Preparação animal e Cirurgia

1. Anestesiar ratos fêmea Sprague-Dawley macho (350-450 g) ou (200-300 g) com pentobarbital de sódio (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761), por injecção subcutânea; proteger o mesentério, não utilizando injecção intraperitoneal.
2. Ao longo de procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, manter a anestesia por injecções suplementares (30 mg / kg), conforme necessário. Determinar a profundidade da anestesia por pitada dedo do pé ou reflexo da córnea. Após a conclusão do procedimento experimental, a eutanásia através de sobredosagem de pentobarbital de rato ou injecção intra-cardíaca de cloreto de potássio saturado, sob anestesia.

3. Prepare Soluções e Erythrocytes para uso como marcadores de fluxo

1. Preparar a solução de Ringer de mamífero para a solução de controlo e superfusate perfusato (solução de Ringer contendo 10 mg / ml de ácido gordo de mamífero normalmentealbumina livre de soro bovino, BSA).
   1. Perfusato filtro através de 0.2 mm filtros de seringa para remover partículas minúsculas que podem bloquear a ponta micropipeta; filtrar para pequeno recipiente limpo.
2. Prepare eritrócitos por tiragem de cerca de 0,2 ml de sangue a partir da veia da cauda do rato anestesiado em uma agulha 20G num pequeno seringa contendo 0,05 ml de heparina (1000 U / ml) e transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo cerca de 14 ml de mamífero solução de solução de Ringer .
   1. Centrifugar para embalar suavemente as células vermelhas (cerca max 200 x g durante 7 min). Empate fora o sobrenadante e re-suspender as células vermelhas em solução de Ringer.
   2. Após centrifugação e remoção do sobrenadante, três vezes deixar os glóbulos vermelhos no fundo do tubo para uso posterior. Note-se que este processo reduz as plaquetas em perfusatos finais para menos do que 0,1% dos níveis normais de ^31.

4. Organizar o tecido no animalBandeja

1. Raspar o abdome do rato anestesiado abaixo do umbigo ao apêndice xifóide. Assegure-se que a área raspada se estende em torno do lado direito (para o rato colocado no lado direito), de modo que o cabelo não se forma um pavio para desenhar o superfusate fora do tecido bem. Remover cabelos cortados com uma gaze molhada ou tecido.
   1. Segurar a pele com uma pinça sem corte serrilhada e fazer uma incisão no centro da linha (2-3 cm de comprimento) através da pele utilizando uma tesoura resistentes. Usando uma multa (íris) tesoura fazer uma incisão semelhante através da linha alba, levantando a parede abdominal com uma pinça serrilhada para evitar danos ao intestino.
   2. Com o animal em seu lado na bandeja do animal, puxe cuidadosamente o intestino a partir da cavidade abdominal utilizando aplicadores com ponta de algodão (vara de madeira) embebidos em solução de Ringer e uma pinça sem corte serrilhadas. Organizar o intestino no tecido bem para que o mesentério é estendida sobre o pilar para visualização através do microscópio tendo o cuidado de evitar tocar o mesentério (potentially danificar microvasos), quer com fórceps ou algodão.
      Nota: O tabuleiro do animal (Figura 2A) pode ser construído a partir de Plexiglas e requer um tecido bem (aproximadamente 3 mm de profundidade), uma coluna opticamente transparente (por exemplo, quartzo polido cerca de 2 cm de diâmetro e 5 mm de altura.), E uma almofada de aquecimento ajustada para manter a temperatura do animal. A espessura do pilar não deve exceder a distância de trabalho do objectivo.
2. Posição da bandeja do animal sobre a platina do microscópio de modo que o mesentério é visível através das oculares.
3. Posicione uma linha de gotejamento alimentado por gravidade para superfuse continuamente o mesentério com solução de Ringer de mamífero mantida a 35-37 ° C. Use compressas de gaze para manter o intestino no lugar, ajudar a reter a umidade, e pavio excesso de solução de Ringer fora da superfície. Ajustar o fluxo e aspirar o efluente para manter uma espessura superfusate consistente.
4. Identificar alvo microvasos venulares, que sãonão ramificados segmentos a jusante do fluxo convergente, um ou dois ramos distais aos verdadeiros capilares. Encontrar um vaso não ramificada (de preferência, 600 a 1000 um de comprimento) com o fluxo de sangue livre e rápida de células brancas que furam na parede do vaso.
5. Posicionar o teste de microvasos no centro do campo do microscópio e mover o limitador para a posição perto do sítio de canulação escolhido.

5. Preencha Micropipeta e Monte em Detentor

1. Pouco antes da canulação, suspender as células vermelhas no perfusato. Adicionar 7 ul de eritrócitos a 0,5 ml de perfusato em um tubo de ensaio limpo borosilicato. Nota: hematócritos de 1-3% pode ser usado, mas hematócrito consistente levará a concentrações de perfusão consistente de qualquer substâncias libertadas a partir das células vermelhas.
2. Caber numa seringa de 1 ml com um adaptador de tubulação de 23G e PE 50 tubos (5-15 cm de comprimento). Desenha-se a mistura de células do perfusato / vermelho para dentro da seringa. Inverta a seringa para misturar e expulsar todas as bolhas de tubulação eadaptador. Para maior eficiência, ajuste tubulação para várias seringas antes do experimento começa e mantê-los em uma caixa livre de poeira ou saco plástico.
3. Encher a micropipeta com o avanço do tubo na extremidade mais larga da micropipeta até a mesma se encostar a região cónica. Aplicar um empurrão rápido suave sobre o êmbolo da seringa para encher a ponta da micropipeta. Nota: Um pequeno córrego ou uma gota deve ser visível na ponta para comprovar o preenchimento completo.
4. Retirar o tubo enquanto empurrando suavemente o êmbolo para preencher a parte mais larga do eixo micropipeta. Remover pequenas bolhas no grande eixo sacudindo cuidadosamente o eixo micropipeta. Nota: Um procedimento semelhante foi ilustrado ^32.
5. Coloque a micropipeta em um suporte da pipeta com uma porta lateral que permite uma ligação de fluido contínuo a um manómetro de água. Assegure-se que o suporte, o qual está ligado a um accionamento hidráulico usado para controlar o avanço muito fina da micropipeta, é com um ligeiro ângulo (15-25 °)com a horizontal, de modo que a aresta do cone micropipeta não atingiu o intestino ou o tabuleiro.
6. Montar a unidade hidráulica de um micromanipulador móvel, que tem x, y, z e unidades para permitir alinhamento próximo ao recipiente de ensaio (Figura 2).
7. Ajustar a pressão hidrostática aplicada ao fluido na micropipeta com uma seringa ou ampola de borracha cheio de água, para alterar a altura do fluido na coluna de água do manómetro de cerca de 40 cm H _{2 O acima} do mesentério.
8. Canular o de microvasos, logo que possível depois de encher a pipeta; células vermelhas assentar no fundo da pipeta, de modo que após cerca de 40 min muito poucas células vermelhas irá fluir para o vaso.

6. Microcannulation e microvasculares Medição Pressão

1. Antes de posicionar a micropipeta preenchido sob o microscópio, pressione suavemente a restrição sobre o tecido perto do microvasos aplicar força suficiente para segurar o tecido. Desenhe olimitador de volta, que se estende ligeiramente o tecido de acordo com o de microvasos, de modo que as tensões nas fibras de colagénio mesentéricos são alinhados com o navio.
   1. Alinhe a micropipeta com a embarcação e abaixe-o na vista através das oculares. Colocar a ponta imediatamente a montante do sítio de canulação escolhido e colocá-la sobre o tecido, de modo que possa obstruir parcialmente o fluxo no interior do recipiente, mas isso não ocluir.
2. Canular o navio dirigindo a ponta da pipeta lentamente para o lúmen do vaso usando a unidade hidráulica. Ter cuidado para não apertar através do lado inferior do recipiente.
   Observação: Como a micropipeta entra no lúmen, o perfusato lava-se rapidamente o sangue no vaso para fora do lúmen e flui livremente perfusato em circulação distal do animal ao teste de microvasos, deslocando algumas das perfusão normal do sangue nos vasos jusante.
3. Diminuir a pressão de perfusão, ajustando o manómetro até que o sangue (conforme indicadopelas células vermelhas do animal) é atraído de volta para o segmento de perfusão; esta determina a pressão de equilíbrio onde os glóbulos vermelhos oscilar suavemente no lúmen do vaso e mede a pressão hidrostática de microvasos (P _C) na extremidade distai do segmento de microvasos. Manter a perfusão navio em todas as pressões acima essa pressão equilíbrio.

7. Microocclusion e Coleta de Dados

1. Passo opcional: Antes de usar o micro-oclusor para bloquear o recipiente, que pressiona para o tecido numa zona não utilizada de mesentério longe de qualquer recipiente de modo que a ponta se acumula uma fina camada de tecido que protege o recipiente experimental durante micro repetido oclusões.
2. Colocar o bloqueador de cima do vaso perfundido perto da borda inferior do campo do microscópio.
3. Grave o seguinte com vídeo e áudio.
   1. Verbalmente registar a localização do sítio de bloqueio e o bordo inferior da tela, como visto no retículo ocular.
   2. Com a pontado bloqueador colocado imediatamente acima do de microvasos, utilizar o controlo Z fina do micromanipulador para diminuir suavemente o bloqueador até que o fluxo no vaso está ocluso. Observe a pressão do manômetro (P _c) em áudio. Aplicar oclusão normalmente para 3-10 segundos e solte, restaurando a perfusão livre. Mover o site quadra até o navio em direção à ponta da pipeta em 5-10 mm etapas com base no tempo (> 5 min após o bloco inicial em um site), número de oclusões (3-5), para evitar danos da parede do vaso no local bloco .

8. Análise de Dados e Medição da L _{p (de} água)

1. Durante a reprodução de vídeo, determinar a distância inicial (ℓ ₀₎ a partir de um marcador de células vermelhas para o local de oclusão através da utilização de uma imagem de um micrómetro de plataforma e as posições conhecidas sobre as imagens. Determinar a velocidade inicial (dl / dt) da célula de marcador a partir da sua posição em vários quadros durante a 3-10 segundos de imagens gravadas. Dissuadirmina o raio do vaso (r) a partir das imagens captadas durante a oclusão (Figura 3).
2. Calcular J _v / S para cada oclusão como (dl / dt) x (1 / ℓ ₀₎ x (r / 2). Calcular G _P a uma pressão constante como (J _v / S) dividida pela pressão de condução (microvasos pressão - a pressão osmótica colóide eficaz; ver discussão).

Resultados

A Figura 4 mostra os resultados da medição do curso de tempo das alterações no G _P num rato venular microvasos canulada sucessivamente com quatro perfusatos. ³³ A magnitude de L _p calculado a uma pressão constante foi usada como uma medida de mudanças na microvasos permeabilidade da parede, primeiro no estado de controlo com um perfusato contendo 1% de albumina de soro bovino, em seguida, quando o recipiente foi exposta ao agente inflamatório bradicinina (BK) atra...

Discussão

Detalhes dos cálculos de _{L p.} Embora o movimento fluido transvascular ocorre enquanto o navio é perfundido livremente, essa troca é pequena demais para ser medido durante a perfusão livre porque é tipicamente menor do que 0,01% da taxa de perfusão navio. No entanto, quando a perfusão é transitoriamente interrompido por oclusão da micro-vasos, o fluxo transvascular (isto é, por filtração) é medido a partir do movimento das células marcador vermelho no lúmen que a coluna de líq...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon