Microperfusion Техника по расследованию Правила микрососудов проницаемость у крыс брыжейки

Резюме

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Аннотация

Эксперименты по измерению свойств проницаемости микрососудов индивидуально перфузированных обеспечить мост между расследования молекулярных и клеточных механизмов, регулирующих проницаемость сосудов в культивируемых эндотелиальных монослоев клеток и функциональных свойств обменных целых микрососудистых кровати. Метод, чтобы иглу и заливать венулярного микрососудов брыжейки крыс на и измерения гидравлической проводимости в микрососудов стенки описано. Основное оборудование включает в себя необходимости прижизненной микроскоп с большим модифицированной стадии, которая поддерживает микроманипуляторами позиционировать три различных микроинструментов: (1) скошенной стекла микропипетки, чтобы иглу и заливать микрососудов; (2) стекло микро-обтуратор, чтобы временно блокировать перфузии и позволяют измерять transvascular движения потока воды в измеряемой гидростатического давления, и (3) тупым стеклянной палочкой, чтобы стабилизировать ткань брыжеечной на месте катетеризации. Модифицированный Лэндис микро-окклюзия TechniqUE использует эритроцитов, взвешенных в искусственном перфузат в качестве маркеров transvascular движения жидкости, а также позволяет повторные измерения этих потоков, экспериментальные условия изменились и разницы гидростатического и коллоидного осмотического давления в микрососудах тщательно контролируется. Измерения гидравлической проводимости в первую очередь с использованием управления перфузат, то после повторного катетеризации же микрососудов с тестов perfusates позволяют парных сравнений на ответ микрососудов в этих хорошо контролируемых условиях. Попытки продлить способ микрососудов в брыжейку мышей с генетической модификации ожидаемых изменить проницаемость сосудов были строго ограничены из-за отсутствия длинных прямых и неразветвленных микрососудов в брыжейку мыши, но в последнее время наличие у крыс с аналогичными генетических модификаций, используя CRISPR технологии / Cas9 планируется открыть новые области исследования, когда методы, описанные здесь, могут быть применены.

Введение

Microperfusion в сосудистой входит установка контролируемый поток искусственного перфузату известного состава с помощью микропипетки в кровеносном сосуде обычно меньше, чем 40 мкм в диаметре. Перфузией судно остается в пределах его нормальных условиях ткани и перфузии животного крови до времени катетеризации. При использовании в сочетании с различными видео изображений или флуорометрическими методов, в месте microperfusion позволяет измерять воды и растворенных веществ протекает через стенки микрососудов в условиях, когда движущие силы для этих потоков известны и свойства проницаемости сосудистой стенки может быть непосредственно оценены. Кроме того, путем регулирования состава жидкости, окружающей микрососудов в ткани (перфузату и superfusate), регулирование проницаемости микрососудов и обмена может быть исследована путем предоставления эндотелиальные клетки, формирующие стенки микрососудов подвергаться различным еXperimental условия (агонисты, модифицированные условия перфузии, люминесцентные индикаторы для измерения внутриклеточного состава и сигнализации) для измеренных именно периоды времени (с до часов). Кроме того, ультраструктурных или цитохимические оценки ключевых клеточных структур, регулирующих молекул барьер может быть исследована в тех же микрососудов, в котором проницаемость измеряется непосредственно. Подход, таким образом, образует мост между расследования клеточных и молекулярных механизмов, чтобы изменить функцию эндотелия барьер в культивируемых эндотелиальных монослоев клеток и расследования в интактных микрососудов. Смотрите следующие обзоры для дальнейшей оценки ^1-6.

Ограничение microperfusion, что он может быть использован только в микрососудистых кровати, которые являются тонкими, прозрачными и имеют достаточную структурную целостность, чтобы позволить катетеризации со стеклянной микропипетки. В то время как ранние исследования использовали лягушачьи микрососудов брыжейки в тонкой кожной и жабы мuscle ^7,8, на сегодняшний день наиболее часто используется в моделях подготовка млекопитающих является крыса брыжейки ^9-15. Большинство исследований были сосредоточены на острых изменений в сосудистой проницаемости исследуемой за периоды 1-4 часов, но более поздние исследования были распространены на измерения на отдельных судов 24-72 ч после первоначального перфузии ^12,16. Недавно разработанная технология CRISPR, который обещает сделать более генетически модифицированные модели крыс для изучения регулирования проницаемости сосудов ¹⁷ следует включить методы, описанные в этой связи должны применяться в венулярного микрососудов брыжейки в этих важных новых моделей крыс.

Метод требует инвертированного микроскопа, оснащенного встроенным микроскопом обычай этапе достаточно большой, чтобы держать и подготовку животных и по крайней мере три микроманипуляторами используется для позиционирования микроинструментов близких к перфузии судна и согласовать перфузии микропипетку с суднаПросвет. Например, пользовательские платформы для стадии ху микроскопа (около 90 × 60 см) могут быть изготовлены из листа толщиной 1 см стального листа с антикоррозийной покрытием. Этап прикреплен к столу инженерно индексом или двух голубей хвост слайды, установленных под прямым углом и поддерживаемых на тефлоновых столбов или шаровые переводов для движения в горизонтальной плоскости. Типичный установка (рисунок 2) имеет много общего с микроскопом и микропозиционированное оборудования, используемого для диапазона прижизненных экспериментов микроциркуляции, таких как те, для измерения одного потока кровеносного сосуда и гематокрита, локальную доставку кислорода кровью перфузии микрососудов, регуляция сосудистого гладкой тонус мышц, и локальное скопление микрососудов флуоресцентных индикаторов, введенных в обращение всей. ^18-26

Принципиальной особенностью метода является измерение объемного расхода (J) через _об области, определенной поверхности (ы) микрососудов стенки. Для достиженияэто через модифицированной методики Landis описанного здесь простой перевернутый микроскоп является адекватной. Небольшое видео камера установлена ​​на порт изображений и видеосигнала, с добавлением временной базы, отображается на видеомониторе и записаны как в цифровом виде на компьютере или в виде цифрового или аналогового сигнала на видеомагнитофоне. После того, как микрососудов канюлировали часть из микрососудов видимой камере, может быть изменена путем перемещения этап и манипуляторы в качестве единицы, не нарушая катетеризации.

Измерение transvascular потоков может быть также в сочетании с более детальных исследований с использованием флуоресцентного микроскопа сложный с соответствующими фильтрами, таких как установок, используемых для измерения растворенного проницаемости, люминесцентного контроля соотношения цитоплазматического кальция или других клеточных механизмов, и конфокальной микроскопии ^{6,12,13, 27.} Ключевым преимуществом всех подходов microperfusion является способность делать повторные меры, на том же судне, При контролируемом изменении движущей силы, такой как гидростатического и онкотического давлений или индуцированного изменения ответов судна в воспалительных состояний. Наиболее распространенной конструкцией является попарное сравнение измеренного гидравлической проводимости _(L P) на том же сосуде с судна первой перфузии с помощью микропипетки, заполненной контрольной перфузату и красной суспензии клеток, чтобы установить состояние базовой линии проницаемости, то со второй пипетки с тестируемым агентом добавлены перфузату. Несколько cannulations возможны цикла повторного после реперфузии с контрольной пипетки.

Настоящий протокол показывает катетеризации и microperfusion из венулярного судна крысы брыжейки записывать потоки воды по всей микрососудов стенки и измерения _L P стенки сосуда, полезную индекс проницаемости общего пути для воды и растворенных веществ через неповрежденный эндотелия барьер. Процедура называется модифицированной Landis TechniqUE потому, что первоначальный принцип Landis использования относительное движение эритроцитов в качестве меры transvascular обмен жидкости после перфузии блокируется сохраняется ^28, но диапазон условий эксперимента (например, гидростатические и альбумина различия онкотического давления на микрососудов стенки) доступны после microperfusion намного больше, чем в крови uncannulated перфузии микрососудов ^8,29.

протокол

О себе этика: Все процедуры были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная.

1. Предварительное изготовление Микропипетки, Restrainers, и блокаторы

1. Извлеките несколько чистые боросиликатного стекла капилляров в половине использованием электронного съемник регулируется таким образом, что, когда тянули, растянутый участок трубки составляет около 1 см в длину и две половинки несколько симметрично. Убедитесь, что конус согласуется с размерами на рисунке 1. Используйте обе половинки для Микропипетки, restrainers и блокаторов.
   1. ФАСКА микропипетки использованием воздушным приводом шлифовального круга ³⁰ 0,5 мкм наждачной бумагой купались в воде. Установите угол держателя микропипетки так, что она составляет около 30 градусов от горизонтали.
   2. Тщательно вымыть и высушить с помощью микропипетки всасывание тянуть чистый ацетон через наконечник и вверх по валу. Осмотрите микропипетки (1А) с помощью небольшой прямой микроскоп с 4 × 40 × и целей, оснащенных держателя микропипетки крокодил и окуляра сетки.
   3. Выберите микропипетки с открытостью около 50 мкм длиной, с фаской, длина которой / ширине между 3.1 и 3.5 и с резко сужающейся точке, которая помогает проникнуть в жесткие коллагеновые волокна в брыжейки.
   4. Храните 15-20 микропипетки на несколько разных размеров в коробке пыли.
2. Сделать restrainers используя вытащил капиллярные трубки, подготовленные в шаге 1.1). Держите вытащил стеклянную капиллярную трубку кратко возле Микропламя сформировать тупой конец (рис 1B). Хранить несколько в коробке пыли.
3. Сделать microoccluders используя вытащил капиллярные трубки, подготовленные в шаге 1.1). Держите вытащил капиллярной трубки под Микропламя и аккуратно согнуть (с помощью адаптера труб., Например, 23G) штраф наконечник (около 4 мм от кончика), чтобы сделать угол близок к 120 градусов к оси ( Рисунок 1С). Марка и хранить несколько.

2. Подготовка животных и хирургии

1. Обезболить самца (350-450 г) или самок крыс Sprague-Dawley (200-300 г) пентобарбиталнатрием (80-100 мг / кг, Sigma-Aldrich, P3761) с помощью подкожной инъекции; защиты брыжейки, не используя внутрибрюшинного введения.
2. В течение хирургических операций и экспериментальных протоколов, поддерживать анестезию путем дополнительных инъекций (30 мг / кг) по мере необходимости. Определите глубину анестезии пальца щепоткой или роговицы рефлекс. После завершения экспериментальной процедуры, эвтаназии крысу через пентобарбиталом передозировки или внутри сердечной инъекции насыщенным раствором хлорида калия под анестезией.

3. Подготовить решения и эритроцитов для использования в качестве маркеров потока

1. Готовят раствор Рингера для млекопитающих superfusate и контроль перфузата раствора (обычно у млекопитающих раствор Рингера, содержащий 10 мг / мл жирной кислотыбесплатно бычий сывороточный альбумин, BSA).
   1. Фильтр Перфузат через 0,2 мкм шприц фильтры для удаления мелких частиц, которые могут блокировать кончик микропипетки; фильтр в небольшом чистом контейнере.
2. Подготовьте эритроциты, опираясь около 0,2 мл крови из хвостовой вены анестезированных крыс в 20G иглы на небольшом шприца, содержащего 0,05 мл гепарина (1000 ед / мл) и переносят в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую около 14 мл млекопитающих решение раствор Рингера ,
   1. Центрифуга мягко пакет эритроцитов (около 200 × макс г в течение 7 мин). Откачать супернатант и вновь приостановить эритроциты в растворе Рингера.
   2. После центрифугирования и удаления супернатанта в три раза оставить эритроцитарной в нижней части трубы для последующего использования. Следует отметить, что эта процедура снижает тромбоцитов в конечных perfusates до менее 0,1% от нормальных уровней ^31.

4. Организовать ткань на животныхЛоток

1. Бритье брюшко под наркозом крысы снизу пупка до мечевидного отростка. Убедитесь, что выбритый участок простирается вокруг правой стороны (для крыс, размещенной на правой стороне), так что волосы не образуют фитиль обратить superfusate из ткани также. Удалить вырезать волосы с увлажненной марлевой салфеткой или тканью.
   1. Держите кожу с тупым зубчатыми щипцами и сделать центр строки разрез (длиной 2-3 см) через кожу, используя надежное ножницы. Использование штрафа (ирис) ножницы сделать подобный разрез через белой линии, поднимая брюшную стенку с зубчатыми щипцами, чтобы избежать повреждения кишечника.
   2. С животного на боку на лотке для животных, осторожно выньте кишки из брюшной полости с помощью хлопка наконечником аппликаторы-(дерево), смоченные палки в растворе Рингера и тупыми зубчатыми щипцами. Упорядочить кишку в ткани и таким образом, чтобы брыжейки накинутой столба для просмотра через микроскоп заботясь, чтобы избежать прикосновения брыжейки (Потьеntially повреждения микрососудов) либо с пинцетом или хлопка.
      Примечание: Лоток для животных (2А) могут быть построены из оргстекла и требует ткани хорошо (Deep около 3 мм), оптически ясно столба (например, полированный кварц около 2 см диаметром и 5 мм.) И потепления площадку регулируется для поддержания температуры животного. Толщина столба не должна превышать рабочее расстояние объектива.
2. Расположите лоток животных на сцене микроскопа так, чтобы брыжейки виден через окуляры.
3. Подставьте самотечных капельного линии постоянно переливать брыжейки раствором Рингера млекопитающих в поддерживаемой при 35-37 ° С. Используйте марлевые тампоны, чтобы держать кишечник в месте, помогают удерживать влагу, и фитиль решение избыточного Рингера с поверхности. Отрегулируйте поток и аспирации стоков для поддержания равномерной толщины superfusate.
4. Определение целевых венулярного микрососудов, которые являютсянеразветвленные сегменты вниз по течению конвергентной потока, один или два отделения дистальных истинных капилляров. Найти неразветвленную сосуд (в идеале, 600 до 1000 мкм в длину), имеющие оживленное кровообращение и свободной от лейкоцитов, торчащие на стенке емкости.
5. Поместите тест микрососудов в центре области микроскопа и переместить фиксатор в положение вблизи выбранного катетеризации сайта.

5. Заполните микропипетки и Гора в держатель

1. Перед cannulating, приостановить эритроциты в перфузат. Добавить 7 мкл эритроцитарной 0,5 мл перфузата в чистом тестовом боросиликатного трубки. Примечание: гематокрита 1-3% может быть использован, но в соответствии гематокрита приведет к последовательной концентрации перфузату любых веществ, поступающих из эритроцитов.
2. Установите 1 мл шприц с адаптером 23G труб и PE 50 труб (5-15 см длиной). Нарисуйте Перфузат / красный смесь клеток в шприц. Обратить шприц для смешивания и изгнать все пузырьки из трубы иАдаптер. Для повышения эффективности, подходят трубки до нескольких шприцев до начала эксперимента и держать их в свободном поле пыли или полиэтиленовый пакет.
3. Заполните микропипетки путем продвижения трубки в большом конце микропипетки, пока она не упрется в трапециевидный участок. Применить нежный быстрый толчок на поршень шприца, чтобы заполнить кончик микропипетки. Примечание: маленький ручеек или капель должна быть видна на кончике, чтобы свидетельствовать полное заполнение.
4. Вывод трубки, мягко нажимая на поршень, чтобы заполнить широкую часть микропипетки вала. Удалить мелкие пузырьки в широком вала тщательно стряхивая микропипетки вал. Примечание: Аналогичная процедура была проиллюстрирована ^32.
5. Поместите микропипетки в держатель пипетки с боковой порт, который позволяет соединение непрерывный жидкости к водяной манометр. Убедитесь, что держатель, который прикреплен к гидравлическим приводом используется для управления очень тонкой продвижение микропипетки, это под небольшим углом (15-25 °)к горизонтали таким образом, чтобы край конуса микропипетки не попал в кишечник или лоток.
6. Установите гидравлический привод на подвижной микроманипулятора, который имеет X, Y, Z и диски для того, чтобы тесную связь с испытательного сосуда (рис 2).
7. Регулировка гидростатическое давление, приложенное к жидкости в микропипетки с помощью шприца или заполненный водой резиновую грушу, чтобы изменить высоту жидкости в толще воды манометра до около 40 CMH _{2 O} выше брыжейки.
8. Иглу микрососудов как можно скорее после заполнения пипетки; эритроциты оседают на дно пипетки, так что после примерно 40 мин очень мало эритроцитов будет течь в сосуд.

6. Microcannulation и Микрососудистой Измерение давления

1. Перед установкой заполненный микропипетки под микроскопом, осторожно нажмите на фиксатор ткани вблизи микрососудов применения достаточную силу для захвата ткани. Нарисуйтефиксатор обратно, слегка растягивая ткань в соответствии с микрососудов, так что напряжения в брыжеечных коллагеновых волокон приведены в соответствие с судна.
   1. Совместите микропипетку с судна и опустите его в поле зрения через окуляры. Поместите наконечник непосредственно перед выбранной катетеризации сайта и опустить его на ткань так, чтобы она частично препятствует потоку внутри емкости, но не закрывают его.
2. Иглу судно при движении пипетки медленно в просвете сосуда, используя гидравлический привод. Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть нижней стороне судна.
   Примечание: В микропипетки вводит просвет, перфузат быстро моет крови в сосуде из просвета и перфузату свободно течет в циркуляционном дистальнее животного в испытательную микрососудов, вытесняя некоторые из нормального кровотока в сосудах ниже по течению.
3. Опустите перфузионное давление, регулируя манометр до крови (как указанокрасные клетки животного) втягивается обратно в перфузии сегменте; это определяет давление баланса, где эритроциты аккуратно колеблются в просвете сосуда и измеряет гидростатическое давление микрососудов (Р _с) на дистальном конце микрососудов сегмента. Поддерживать судно перфузии при всех давлениях выше этого давления баланса.

7. Microocclusion и сбор данных

1. Необязательный шаг: Перед использованием микро-окклюдер блокировать судно, нажмите его в ткани в неиспользуемом области брыжейки далеко от судна так, чтобы кончик накапливается штраф площадку ткани, которая защищает экспериментальную судно во время повторного микро- окклюзии.
2. Поместите блокатор выше перфузии судна вблизи нижнего края области микроскопа.
3. Запишите следующее с видео и аудио.
   1. Устно записать расположение блока сайте и нижний края экрана, как показано на окуляр визира.
   2. С кончикаблокатора размещены чуть выше микрососудов, использовать мелкий контроль г в микроманипулятора мягко опустите блокиратор, пока поток в сосуде не поглощается. Обратите внимание на давление манометра _{(Р) об} аудио. Применить окклюзии, как правило, 3-10 сек, а затем отпустите, восстановление бесплатный перфузии. Перемещение сайт загромождать судна в направлении кончика пипетки в 5-10 мкм шагов в зависимости от времени (> 5 мин после первоначального блока на сайте), количество включений (3-5), чтобы предотвратить повреждение сосудов стенки при блоке сайта ,

8. Анализ данных и измерения L _{р (Водопроницаемость)}

1. Во время воспроизведения видео, определить начальную расстояние (l ₀₎ из маркера эритроцитов к окклюзии сайта с помощью изображением микрометра и известных положений на изображениях. Определить начальную скорость (dℓ / DT) маркера клетки от его положения в нескольких кадрах в течение 3-10 сек записанных изображений. Удерживатьмой радиус сосуда (г) из снимков, сделанных во время окклюзии (рис 3).
2. Рассчитать J _{V / S} для каждого окклюзии как (dℓ / DT) × (1 / л ₀₎ × (R / 2). Рассчитать _L P при постоянном давлении в (J _{V / S),} деленное на давление вождения в (микрососудов давления - эффективного осмотического давления коллоидной; см Обсуждение).

Результаты

На рисунке 4 показаны результаты от измерения временной ход изменений в L _р у крысы венул микрососудов канюлированную последовательно четыре perfusates. ³³ Величина _L P, рассчитанной при постоянном давлении, использовали в качестве показателя изменений микрососудо...

Обсуждение

Подробная информация о L расчетов _стр. Несмотря на то, transvascular движение жидкости происходит в то время как судно свободно перфузии, такой обмен слишком мал, чтобы быть измерена в свободное перфузии, потому что это, как правило, меньше, чем 0,01% от стоимости перфузии сосудов. Одна?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon