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Resumo

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Resumo

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

Introdução

A próstata é um tecido heterogéneo composto por epitélio secretor dispostos em ácinos glandular rodeado por estroma fibromuscular composto principalmente de músculo liso 1. O compartimento epitelial é composto por cinco tipos de células diferentes, mas organizados: células basais, células secretoras, células neuroendócrinas, células amplificadoras de trânsito e células-tronco 2. No cancro da próstata (CaP), que surge a partir de células epiteliais luminais, o crescimento do adenocarcinoma provoca um declínio progressivo evidente do compartimento estromal 3. Por estas razões, as amostras de tecido terá diferenças distintas na proporção de estroma e tipo de célula epitelial com base na extensão de CaP. Estas diferenças podem levar a pressupostos enviesada dos dados de expressão de genes adquiridos a partir de tecidos inteiros sem ter em conta a microdissecação de o tipo de célula desejado. Portanto, para eliminar esta polarização é essencial para separar tipos de células antes da extracção de ARN eAnálise da expressão do gene.

Macrodissection microdissecação ou pode ser usado para separar fisicamente as áreas epiteliais bem caracterizadas do estroma circundante 4 -6. Macrodissection é tipicamente feito com uma lâmina de barbear sob um microscópio de dissecação e funciona bem para a separação de grandes CaP nódulos de estroma, mas não é capaz de remover a partir de epitélio benigna estroma circundante (ver exemplo de histologia benigna da próstata na Figura 1). Microdissection com um laser (LCM) é significativamente mais trabalho intensivo do que macrodissection, mas pode dissecar com muita precisão epitélio benigno 4.

Publicações recentes de nosso laboratório demonstraram que o RNA pode ser extraído com sucesso por LCM de qualquer um (FFPE) biópsias embebidos em parafina fixadas em formalina ou tecido congelado 4,7-9. Os principais desafios na extracção LCM-ARN são: 1) para dissecar com precisão as áreas desejadas do tecido, e 2) para preservar RNA integridade durante o processo de LCM 4,10 e isolamento. ARN isolado a partir de populações de células puras podem ser utilizados para análise da expressão do gene através de vários métodos, incluindo a transcrição reversa-PCR quantitativo (RT-qPCR) 7,8, 11 microarray, e profunda -sequencing 12-14.

O objetivo deste protocolo é para isolar RNA total de LCM prostática epitélio de tecido congelado para análise de expressão de genes a jusante.

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Protocolo

Todos os tecidos humanos utilizados para estas experiências foram adquiridas através de um protocolo aprovado Institutional Review Board e / ou isenção na Universidade de Illinois em Chicago.

1. Seção Fresco Congelado próstata para PEN-slide e para Cobrado placa de vidro

  1. No dia anterior ou poucas horas antes do corte da amostra, ferramentas limpas (isto é, escova, fórceps, coplins, lâminas, lâminas PEN-emoldurados (se já não estiver RNase livre), um marcador ETOH seguro e um lápis) e no interior de um RT criostato com uma solução de RNase-descontaminação usando um frasco de spray e LAB-toalhetes.
    1. Permita que a solução de descontaminação RNase-a descansar por 5 minutos antes de enxugar, enxaguar com DEPCH 2 0 para remover sobra solução e uma lavagem final com 70% EtOH (preparado com DEPCH 2 0) RNase-descontaminação.
      Nota: É essencial para manter um espaço de trabalho livre de RNase. Todos os coplins, ferramentas, meio de montagem congelados, lâminas e slides utilizados devem ser usados ​​apenas para RNase de trabalho livree nunca usado em um ambiente livre não-RNase padrão. Todos os instrumentos têm de ser tratada com uma solução de descontaminação de RNase antes de cada experiência.
  2. Cryostat legal a -24 ° C.
  3. Coloque os seguintes instrumentos RNase gratuitas limpos dentro cryostat esfriar por pelo menos 30 min antes do corte: slide com etanol a 100%, as ferramentas, as pequenas cassetes de tecido congelado e chuck montagem cheio de coplin.
  4. Recuperar a partir de tecido da próstata congelado cryostorage e lugar em um balde espuma seca-cheia de gelo para o transporte. Colocar em criostato de tecido equilibrar à criostato temperatura durante pelo menos 30 min.
    Nota: tecidos da próstata humanos para a captura de laser de micro-dissecção pode ser fresco congelado ou formalina-fixados em parafina (FFPE). As limitações de tempo e preparação da lâmina são ligeiramente diferentes entre fontes de tecido. Aqui nós descrevemos os passos para cortes congelados.
  5. Trabalhar com um tecido de cada vez, e esguichar meio de montagem congelado no bottom da cassete e rapidamente montar o tecido prostático congelado para o meio de montagem congelado utilizando a pinça refrigerados.
  6. Coloque a gaveta com o tecido em resfriador em criostato durante 5 min para definir meio de montagem congelado.
  7. Tutuca uma pequena quantidade de meio de montagem congelada para o chuck e pressione cuidadosamente tecido montado lado de baixo para cima do meio de montagem congelada. Deixe definido no criostato durante 5 min para permitir que o meio de montagem congelados para solidificar completamente.
  8. Coloque chuck no suporte e aperte.
  9. Trave a manivela na posição de bloqueio e coloque uma lâmina nova para o criostato. Para terminais moleculares a jusante que incluem um passo de amplificação (ou seja, qPCR), é aconselhável a utilização de uma lâmina nova para cada paciente para evitar a contaminação (ou mover a lâmina através de utilização da área da lâmina para a amostra seguinte).
  10. Destravar a alça e cuidadosamente avançar o tecido à mão ou com um pedal para uniformizar e expor o tecido com 50 μsecções M até a exposição do tecido desejado seja alcançado.
  11. Ajuste cryostat a 5 um, cortar uma ou duas seções e colocá-los em cobrados lâmina de vidro para hematoxilina e eosina (H & E) coloração (ver Passo 2).
  12. Colocar imediatamente a deslizar para o etanol frio a 100% durante 2 min.
  13. Remover a lâmina de vidro carregada a partir de etanol e deixar secar à RT, antes de prosseguir para a coloração com H & E (Passo 2).
  14. Coloque RT PEN-quadro de slide em um torcedor do quadro.
  15. Ajuste cryostat 10 seções um e lugar para os slides quadro RT PEN. Um a quatro secções pode ser colocado em cada corrediça, dependendo do tamanho do tecido.
  16. Mergulhar imediatamente a deslizar para o etanol frio a 100% durante 2 min.
  17. Retirar as lâminas PEN-quadro a partir de etanol e armazenar o slide em uma caixa de slide em uma caixa de secador em um freezer -80 ° C até que esteja pronto para LCM. Três dias é o tempo máximo de armazenamento para recuperação de RNA ideal.
  18. Prossiga com a Etapa 2 para apenas o vidro cobrado deslizoue. Prossiga com a Etapa 3 para PEN-quadro de slide.

2. Hematoxilina e Eosina-Y (H & E) da mancha por histológica Mark-up

Nota: Este caso para o tecido sobre a lâmina de vidro carregada e não o slide PEN-quadro para LCM.

  1. Hidratar as secções sobre lâminas de vidro carregada mergulhando a lâmina por meio de etanol graduada como segue: mergulha o slide duas vezes em etanol a 100% durante 3 min, duas vezes em etanol a 95% durante 3 min, uma vez em etanol a 70% durante 3 min e dois vezes em H2O destilada durante 3 min.
    1. Preparar a solução de álcool de ácido: 99 ml de etanol a 70% + 1 ml de 1% de HCl e solução de bicarbonato de sódio a 0,1%: 0,1 g de bicarbonato de sódio em 100 ml de H2O destilada
  2. Mergulhe as lâminas em hematoxilina Gill II (0,4%) por 5 min.
  3. Lavar o excesso de corante em constante funcionamento torneira H2O por 3 min.
  4. Mergulhe o slide 10 vezes em álcool ácido
  5. Lave o slide no corrente da torneira H2O por 3 min.
  6. Mergulhe o slidenuma solução de bicarbonato de sódio a 0,1% durante 30-60 seg para transformar a cor púrpura para azul.
  7. Lave o slide no corrente da torneira H2O por 3 min.
  8. Lavar as lâminas em etanol a 95%, com 10 mergulhos.
  9. Mergulhe o slide no Eosina-Y 2-3 vezes 15 seg total.
  10. Desidratar o slide através de etanol classificados da seguinte forma: mergulhe a lâmina duas vezes em etanol a 95%, duas vezes em etanol a 100%, e duas vezes em xileno (certifique-se o tecido parece claro o que indica desidratação completa).
  11. Montar o slide com não aquoso difícil montagem médio e tampa de deslizamento permanente.
  12. Deixe que a corrediça seco durante 30 min.
  13. Digitalização de slides com qualquer scanner de slides todo e imprimir uma imagem grande, de alta resolução para 8 "x 11" papel.
  14. Esboço áreas de interesse (normalmente feito por um patologista certificado bordo) com um marcador. Essa marcação é o guia para o procedimento LCM.

3. Azul de Toluidina coloração das lâminas PEN-quadro

Nota: Thestá é feito o mesmo dia como o LCM. Use DEPCH 2 O de água para todas as soluções. Conclua todas as etapas em área livre de RNase. Todos os coplins devem ser limpas com uma solução de RNase-descontaminação.

  1. O dia de LCM remover as lâminas PEN-quadro de -80 ° C e hidrato de congelador por lâminas inclinadas em declive em EtOH a 90% durante 2 minutos, em seguida, 75% de EtOH durante 2 min.
    1. Prepare 0,5% azul de toluidina por dissolução em água biologia molecular grau em seguida, filtrar através de um filtro de esterilizar e armazenar 0,2 m à temperatura ambiente. Esta solução pode ser reutilizada durante até 6 meses. Nota: É altamente aconselhável para preparar a solução antes que a filtração pode levar algumas horas.
  2. Manchar o tecido da próstata mergulhando suavemente slides em 0,5% azul de toluidina para 5-30 seg. Destain o tecido desliza por lavagem 2 vezes em DEPCH 2 O durante 15 segundos seguido por 75% de EtOH durante 30 segundos a 3 minutos. Nota: mancha e destain tempos podem ser ajustados para assegurar uma boa coloração. Próstata tende a sobre a mancha.
  3. Transferir as lâminas PEN-quadro para recipiente seco RNAase-livre no gelo.

Captura Laser-4. Micro-dissecção (LCM)

  1. Imediatamente antes de LCM, a corrediça seco sobre uma lâmina quente a 42 ° C durante 15 min. Dry apenas o slide que será processado e armazenar o resto em gelo até estar pronto para eles.
  2. Ligue o computador e LCM, por esta ordem, o poder do microscópio, a chave de laser, o interruptor do laser e, em seguida, o computador. O lançamento do software Laser Microdissection.
  3. Use o software para controlar o microscópio para carregar os slides e tubos de coleta. Clique em "suporte de amostras de descarga", carregue o slide com as seções no suporte de slides do microscópio com o tecido voltado para baixo e insira o suporte de slides na ranhura apropriada no microscópio, em seguida, clique em "continuar".
    1. Clique em "tubos de coleta de descarregamento", rótulo e carregar 0,5 ml tubos no suporte do tubo e inseri-lo no slot apropriado no instrumento. Uma veztampas estão garantidos, adicionar 35 ul de tampão de lise para as tampas de coleta e tentar evitar bolhas. Em seguida, clique em "OK".
      Nota: Se a evaporação é um problema, dilui-se o tampão da seguinte forma: 25 ul de tampão de lise com 10 ul depcH2O.
  4. No software, seleccionar a posição em que a corrediça tem sido colocada no suporte da lâmina. Selecione a tampa de cobrança para recolher a amostra LCM.
  5. Visualize e focar o slide através do computador em 10X. Use o software para calibrar o laser, selecionando "Laser" e depois "calibrar". Ajustar a potência, a abertura ea velocidade do laser, escolhendo por "laser", em seguida, "controlo" para permitir que o feixe de laser para cortar a área seleccionada completa e eficiente. Repetir até que os ajustes cortes a laser completamente através do tecido.
  6. Usando o patologista mark-up 8 "x 11" como um guia, use a ferramenta de "chamar a forma" de circunscrever as áreas desejadas de Epítetoslium na vista e evitar a coleta de qualquer estroma.
    Nota: Várias áreas podem ser selecionadas dentro de um ponto de vista, mas não se movem para outra vista sem primeiro corte clicando a ferramenta "cortar forma".
    1. Se uma área não fica completamente cortada pelo laser de usar a ferramenta "mover e cortar" para passar por isso manualmente. Continue a mover o objetivo de novos pontos de vista e repita o corte a laser até slide é completamente dissecado ou a quantidade desejada de tecido foi coletada (tipicamente 100 glândulas benignas produzir 150-500 ng de RNA). (ver o exemplo na Figura 1A).
  7. Remova cuidadosamente os tubos de suporte à recolha e fechar as tampas, lembrando do tampão de lise e tecido nas calotas. Resumidamente, centrifugar durante 30 segundos para recolher o líquido e o tecido na parte inferior do tubo. Incubar as amostras a 42 ° C durante 30 min e armazenar a -80 ° C até estar pronto para o isolamento de ARN.

5. Isolamento de ARN total com um FilKit baseada em ter e Análise de Qualidade

  1. Descongelar os tubos em gelo e levar o volume da solução para 100 uL.
  2. Pré-molhou a micro filtro de um kit de isolamento de ARN através da aplicação de 30 ul ofLysis Solução para o centro do filtro e deixe de molho whileperforming os dois passos seguintes (pelo menos, 5 min).
  3. Adicionar 3 ml de solução de LCM Aditivo (fornecido no kit) ao lisado e misturar em vortex durante 5 segundos. Centrifugar durante 30 segundos para recolher o fluido na parte inferior do tubo.
  4. Centrifugar o filtro pré-humedecido para ~ 30 segundos na velocidade superior para remover o líquido.
  5. Adicionar 1,25 volumes (neste caso 129 ul) de etanol a 100% para a mistura de lisado, suavemente vórtice ou pipeta cima e para baixo. ** Este método irá recuperar as duas espécies de RNA grandes e pequenos.
  6. Carregar a amostra sobre o micro-filtro pré-humedecido, e centrifuga-se a 10.000 xg durante 1 minuto para se ligarem a ARN ao filtro. Em seguida, lave o filtro micro com 180 ul de "solução de lavagem 1, R21; centrifugar a 10000 xg durante 1 min.
    Nota: Deste ponto em diante todas as centrifugações deve ser feito a 13.000 xg, ou velocidade máxima.
  7. Lavar duas vezes com filtrar 180 ul de "soluções de lavagem 2 e 3", respectivamente, conforme indicado pelo protocolo do kit. Centrifugar durante 30 segundos, em seguida, descartar o fluxo através de, e girar o filtro durante 1 min para remover o líquido residual e para secar o filtro.
  8. De transferência do filtro para um novo tubo de recolha.
  9. Solução quente de eluição a -95 ° C (fornecido com o kit).
  10. Aplicar 10 ul de solução de eluição pré-aquecido para o centro do filtro, fechar a tampa e armazenar durante 5 min à TA. Em seguida centrifugar durante 1 min para eluir o ARN, e repetir este passo de cada vez, para se obter ~ 20 ul de ARN.
  11. Realizar o tratamento de DNase I durante 15 minutos a 37 ° C.
  12. Quantificar o ARN com um espectrof otómetro de absorvência a 260 nm. A relação de densidade óptica no comprimento de onda de 260 nm e 280 nm é utilizado para avaliar a pureza deo RNA (ver Tabela 1) 15.

6. Análise da expressão gênica

Nota: A expressão dos genes de espécies de ARN de comprimento (como mRNAs e lncRNAs) é mostrado no passo 6.1 e de espécies de RNA curtas (como microARNs) é mostrado no passo 6.2. Diferentes kits estão disponíveis para RT-qPCR e da quantidade de RNA necessário varia de acordo com kit (tão pouco quanto 10 ng). A análise de sequenciação de ARN é descrito em 6.3.

  1. Transcrever reversa (RT) do ARN para ADNc da mistura de 5 mL de 20 ng / ul de amostra de ARN com 5 uL da mistura principal RT (tampão RT, dNTP, iniciadores aleatórios, enzima RT, inibidor de RNase). Incubar a reacção durante 25 min a 25 ° C, em seguida, 120 min a 37 ° C e 5 min a 85 ° C.
  2. Dilui-se a reacção de RT 1:10 com RNase isenta de água e usar 2,5 mL por 10 jil de reacção qPCR com iniciadores ou conjuntos iniciador / sonda para os genes de interesse.
    Nota: Para facilitar a análise de RNA parcialmente degradada É aconselhável a utilização de primers for amplicões mais curtos (menos do que 100 pb) 16. (Tabela 2B)
    1. Para análise de expressão microARN executar a reacção de RT através da mistura de 5 mL de 2-10 ng / ul de amostra de ARN com 5 uL da mistura principal RT.
      Nota: cada tecnologia de detecção com base em PCR microARN disponível comercialmente requer a utilização de iniciadores de RT e de propriedade específicos.
  3. Alternativamente ou em adição a RT-PCR, utilizar sequenciação geração seguinte (SEQ ARN-ARN ou de pequena-SEQ) para quantificar diferentes espécies de ARN. Tipicamente, usar 500 ng de ARN para este procedimento (Tabela 3) e levar a cabo o método tal como indicado pelo fabricante e detecção instrumento.

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Resultados

Num estudo anterior demonstrou que a utilização de LCM para recolher os tecidos epiteliais e do estroma para comparar perfis de expressão por RT-qPCR de ARNm e microARNs de tecidos da próstata e congelados FFPE a partir do mesmo paciente 4. LCM é demorado, especialmente se grande quantidade de RNA deve ser recolhida para análise de sequenciamento de próxima geração. Portanto, é crucial manter o espaço de trabalho e ferramentas de RNase livre. Recomenda-se para analisar os controlos de qualidade e c...

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Discussão

A expressão do gene de perfis a partir de amostras humanas pode ser um desafio, não só para a qualidade ou quantidade de tecido disponível, mas também para as várias entidades histológicas presentes numa determinada amostra de tecido. Isto é particularmente difícil na próstata em que os tecidos benignos são em grande parte tecidos estromais e áreas de cancro são desprovidos de estroma. LCM facilita a separação física do estroma prostático e ARN epitélio para uma assinatura mais preciso dos dois tipos d...

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Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
RNase-AWAY MBP7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides Leica11600289
Glass slides, Superfrost PlusFisherBrand12-550-15
Ethanol 200 proofDecon labs.2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)SigmaD-5758
CryostatLeicaCM3050
Coplins (Staining jar)IHCWORLDM900-12
Coplins (Staining rack)IHCWORLDM905-12
Aperio ScanScopeAperio(Leica)ScanScope® CS
Toluidine BlueFluka89640-5G
Laser Microdissection SystemLeicaLMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCMThermo ScientificAB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation KitAmbionAM1931Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDropThermo ScientificND-1000
Qubit 2.0 FluorometerLife TechnologiesQ32866Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitApplied Biosystems4368814Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxnsExiqon203301
TaqMan microRNA RT kitApplied Biosystems4366597Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain Ricca Chemical Company3536-16
Eosin-YRichard Allan Scientific 7111

Referências

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  4. Nonn, L., Vaishnav, A., Gallagher, L., Gann, P. H. mRNA and micro-RNA expression analysis in laser-capture microdissected prostate biopsies: valuable tool for risk assessment and prevention trials. Experimental and molecular pathology. 88, 45-51 (2010).
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  8. Giangreco, A. A., et al. Tumor suppressor microRNAs, miR-100 and -125b, are regulated by 1,25-dihydroxyvitamin D in primary prostate cells and in patient tissue. Cancer prevention research. 6, 483-494 (2013).
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