Laser-capture Microdissezione di Human prostatica Epitelio per l'analisi di RNA

Riepilogo

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Abstract

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

Introduzione

La prostata è un tessuto eterogeneo composto da epitelio secernente disposti in acini ghiandolari circondato da stroma fibromuscolare composta principalmente da muscolatura liscia ^1. Il vano epiteliale è composto da cinque diversi tipi di cellule, ma organizzati: cellule basali, cellule, cellule neuroendocrine secretoria, cellule amplificazione di transito e cellule staminali ^2. Nel cancro della prostata (APC), che deriva dalle cellule epiteliali luminali, la crescita del adenocarcinoma provoca un evidente declino progressivo del vano stromale ^3. Per queste ragioni, campioni di tessuto saranno chiare differenze nella proporzione di stromali e cellule epiteliali tipo basato sulla misura dei PCA. Queste differenze possono portare a ipotesi di parte dei dati di espressione genica acquisiti dai tessuti interi senza riguardo per microdissezione del tipo cellulare desiderato. Pertanto, per eliminare questa tendenza è indispensabile separare tipi cellulari prima dell'estrazione dell'RNA eanalisi di espressione genica.

Macrodissection o microdissezione possono essere utilizzati per separare fisicamente aree epiteliali ben caratterizzati dallo stroma circostante ^{4 -6.} Macrodissection è tipicamente fatto con una lama di rasoio sotto un microscopio da dissezione e funziona bene per separare grande PCa noduli da stroma, ma non è in grado di rimuovere dell'epitelio benigna da stroma circostante (vedi esempio di iperplasia prostatica istologia in figura 1). Microdissezione con un laser (LCM) è significativamente più manodopera rispetto macrodissection, ma può sezionare molto preciso epitelio benigna ^4.

Pubblicazioni recenti del nostro laboratorio hanno dimostrato che l'RNA può essere estratto con successo da LCM da entrambi inclusi in paraffina (FFPE) biopsie fissati in formalina o tessuti congelati ^4,7-9. Le principali sfide a estrazione LCM-RNA sono 1) a sezionare con precisione le aree desiderate del tessuto, e 2) per preservare RIntegrità NA durante il ^4,10 LCM e isolamento del processo. RNA isolato da popolazioni cellulari pure può essere utilizzato per l'analisi di espressione genica in diversi modi tra cui trascrizione inversa PCR quantitativa (RT-qPCR) ^7,8, microarray ^11, e profondo -sequencing ^12-14.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare RNA totale da LCM prostatico epitelio dal tessuto congelato per le analisi di espressione genica a valle.

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Protocollo

Tutti i tessuti umani usati per questi esperimenti sono stati acquisiti tramite un protocollo Institutional Review Board approvato e / o di esenzione presso University of Illinois a Chicago.

1. Sezione freschi congelati prostata su PEN-scivolo e sulla Charged vetrino

1. Il giorno prima o qualche ora prima sezionare il campione, attrezzi puliti (ad esempio, spazzola, pinze, coplins, lame, scivoli PEN-incorniciati (se non è già RNasi gratuito), un ETOH marcatore di sicurezza e una matita) e l'interno di una RT criostato con la soluzione RNase-decontaminazione utilizzando uno spray e di laboratorio-salviette.
   1. Lasciare la soluzione-RNasi decontaminazione a sedere per 5 minuti prima asciugandosi, sciacquare con depcH ₂ 0 da rimuovere sinistra su una soluzione e un risciacquo finale con il 70% EtOH (preparato con depcH _{2 0)} RNasi-decontaminazione.
      Nota: E 'essenziale mantenere uno spazio di lavoro RNasi-free. Tutti coplins, strumenti, mezzo di montaggio congelato, lame e diapositive usati devono essere utilizzati solo per RNasi lavoro gratise mai usato in un ambiente privo di serie non RNasi. Tutti gli strumenti devono essere trattati con una soluzione di decontaminazione RNasi prima di ogni esperimento.
2. Raffreddare criostato a -24 ° C.
3. Posizionare i seguenti puliti strumenti gratuiti RNasi all'interno criostato raffreddare almeno 30 minuti prima di sezionamento: slide Coplin-riempita con 100% di etanolo, gli strumenti, le piccole cassette di tessuto congelato e mandrino montaggio.
4. Recupera tessuto prostatico congelato da crioconservazione e posto in una schiuma secchio pieno di ghiaccio secco per il trasporto. Collocare il tessuto in criostato equilibrare al criostato temperatura per almeno 30 minuti.
   Nota: tessuti della prostata umane per laser-capture micro-dissezione possono essere sia fresco congelato o fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE). I vincoli di tempo e preparazione del vetrino sono leggermente diverse tra le fonti di tessuto. Qui si descrivono i passaggi per sezioni congelate.
5. Lavorare con un tessuto alla volta, e schizzare mezzo di montaggio congelato nel bottom della cassetta e rapidamente montare il tessuto prostatico congelato nel mezzo di montaggio congelati utilizzando le pinze refrigerati.
6. Posizionare la cassetta con il tessuto sul refrigeratore in criostato per 5 minuti per impostare montante congelato.
7. Bagnate una piccola quantità di mezzo di montaggio congelato sul mandrino e premere delicatamente il tessuto montato lato basso verso l'alto sul montante congelato. Let impostato nel criostato per 5 minuti per consentire la soluzione di montaggio congelato solidificare completamente.
8. Posizionare mandrino nel supporto e stringere.
9. Bloccare la maniglia in posizione di blocco e posizionare una nuova lama sul criostato. Per gli endpoint molecolari downstream che comprendono una fase di amplificazione (cioè, qPCR) è consigliabile utilizzare una nuova lama per ogni paziente per prevenire la contaminazione (o spostare la lama verso utilizzare parte della lama per il campione successivo).
10. Sbloccare la maniglia e far avanzare con attenzione il tessuto a mano o con un pedale per uniformare ed esporre il tessuto con 50 μm sezioni fino all'esposizione tessuto desiderato viene raggiunto.
11. Regolare criostato a 5 micron, tagliare una o due sezioni e metterli su vetrino addebitato per ematossilina eosina (H & E) colorazione (vedi punto 2).
12. Porre immediatamente il vetrino al freddo 100% di etanolo per 2 min.
13. Rimuovere il vetrino caricato da etanolo e lasciare asciugare a temperatura ambiente prima di procedere alla colorazione H & E (punto 2).
14. Posizionare RT PEN-frame di diapositive su un supporter telaio.
15. Regolare criostato a 10 micron e posizionare le sezioni sui vetrini telaio PEN RT. Da uno a quattro sezioni può essere posto su ciascun vetrino a seconda delle dimensioni del tessuto.
16. Immergere immediatamente il vetrino al freddo 100% di etanolo per 2 min.
17. Rimuovere i vetrini PEN-telaio da etanolo e conservare il vetrino in una scatola di diapositive in una scatola in un essiccatore -80 ° C freezer fino al momento LCM. Tre giorni è il tempo massimo di conservazione per il recupero ottimale RNA.
18. Procedere con la fase 2 per solo il vetro carica scivolòe. Procedere con il passaggio 3 per PEN-telai per diapositive.

2. ematossilina e eosina-Y (H & E) Stain per istologico Mark-up

Nota: Questo se per il tessuto sul vetrino carica e NON la slitta PEN-cornice per LCM.

1. Idratare le sezioni sul vetrino carica immergendo il vetrino attraverso etanolo classificato come segue: immergerlo due volte in 100% di etanolo per 3 min, due volte in 95% di etanolo per 3 min, una volta in 70% di etanolo per 3 min e due volte in acqua distillata H _{2 O} per 3 min.
   1. Preparare la soluzione alcolica acida: 99 ml di etanolo al 70% + 1 ml 1% e 0,1% di HCl soluzione di bicarbonato di sodio: 0,1 g di bicarbonato di sodio in 100 ml di acqua distillata H ₂ O
2. Immergere il vetrino in ematossilina Gill II (0,4%) per 5 min.
3. Lavare eccesso macchia in costante rubinetto aperto H _{2 O} per 3 min.
4. Immergere il vetrino 10 volte in alcol acido
5. Lavare il vetrino in esecuzione rubinetto H _{2 O} per 3 min.
6. Immergere il vetrinonello 0,1% soluzione di bicarbonato di sodio per 30-60 secondi per accendere il colore violaceo a blu.
7. Lavare il vetrino in esecuzione rubinetto H _{2 O} per 3 min.
8. Sciacquare il vetrino in etanolo al 95% con 10 tuffi.
9. Immergere il vetrino in tempi eosina-Y 2-3 per 15 sec totale.
10. Disidratare il vetrino attraverso etanolo classificato come segue: immergere il vetrino due volte in etanolo al 95%, due volte in 100% di etanolo, e due volte a xilene (assicurarsi che il tessuto appare chiaro che indica la disidratazione completa).
11. Montare la slitta con non acquoso dura mezzo di montaggio e copertura di slittamento permanente.
12. Lasciare asciugare il vetrino per 30 min.
13. Diapositiva scansione con qualsiasi scanner intera diapositiva e stampare una grande, un'immagine ad alta risoluzione su 8 "x 11".
14. Outline aree di interesse (in genere fatto da un consiglio di anatomopatologo certificata) con un pennarello. Questa marcatura è la guida per la procedura di LCM.

3. Toluidine Blu colorazione dei vetrini PEN-telaio

Nota: Thsi è fatto lo stesso giorno il LCM. Utilizzare depcH _{2 O} acqua per tutte le soluzioni. Completare tutti i passaggi zona di libero RNasi. Tutti coplins devono essere puliti con la soluzione RNase-decontaminazione.

1. Il giorno della LCM rimuovere i vetrini PEN-frame da -80 ° C freezer e idratare da diapositive immersione delicatamente nel 90% EtOH per 2 minuti poi il 75% EtOH per 2 min.
   1. Preparare 0,5% toluidina blu sciogliendo in acqua per biologia molecolare, quindi filtrare sterilizzare attraverso un filtro 0,2 micron e conservare a temperatura ambiente. Questa soluzione può essere riutilizzato per un massimo di 6 mesi. Nota: E 'altamente consigliato di preparare la soluzione prima come la filtrazione può prendere un paio di ore.
2. Colorare il tessuto prostatico mediante immersione delicatamente diapositive in 0,5% toluidina blu per 5-30 secondi. Decolorare il tessuto mediante lavaggio vetrini 2 volte in depcH ₂ O per 15 secondi seguiti da 75% EtOH per 30 sec a 3 min. Nota: macchia e Decolorare tempi possono essere regolati per garantire una buona colorazione. Prostata tende a oltre macchia.
3. trasferimento diapositive PEN-struttura di riparo RNAase-gratuito su ghiaccio.

4. laser-capture Micro-dissezione (LCM)

1. Immediatamente prima LCM, scivolo secco su un vetrino più caldo a 42 ° C per 15 min. Secco solo la diapositiva che verrà elaborato e memorizzare il resto sul ghiaccio fino al momento per loro.
2. Accendere LCM e computer in questo ordine, di alimentazione del microscopio, la chiave laser, l'interruttore laser e quindi il computer. Avviare il software Microdissezione laser.
3. Utilizzare il software per controllare il microscopio per caricare le diapositive e tubi di raccolta. Clicca su "supporto del campione scaricare", caricare la slitta con le sezioni sul supporto vetrino da microscopio con il tessuto rivolto verso il basso e inserire il supporto diapositive nello slot appropriato al microscopio, quindi fare clic su "continua".
   1. Clicca su "tubi di raccolta scarico", etichetta e caricare 0,5 ml provette sul supporto tubo e inserirla nello slot appropriato nello strumento. Una voltatappi sono garantiti, aggiungere 35 ml di tampone Lysis per i tappi di raccolta e cercare di evitare le bolle. Quindi fare clic su "OK".
      Nota: se l'evaporazione è un problema, diluire il tampone come segue: tampone di lisi 25 microlitri con 10 microlitri depcH2O.
4. Nel software, selezionare la posizione in cui la diapositiva è stata posta nel portavetrini. Selezionare il cappuccio di raccolta per raccogliere il campione LCM.
5. Visualizza e mettere a fuoco la slitta attraverso il computer a 10X. Utilizzare il software per calibrare il laser selezionando "Laser" e poi "calibrare". Regolare la potenza, apertura e la velocità del laser, selezionando "laser" poi "controllo" per consentire il raggio laser per tagliare l'area selezionata completo ed efficiente. Ripetere le regolazioni fino tagli laser completamente attraverso il tessuto.
6. Utilizzando il mark-up 8 "x 11" patologo come guida, utilizzare lo strumento "disegnare forma" circoscrivere le aree desiderate di epithelium nella vista ed evitare la raccolta di qualsiasi stroma.
   Nota: le aree multipli possono essere selezionati all'interno di un punto di vista, ma non si spostano in un altro senza prima vista taglio facendo clic sullo strumento "taglio forma".
   1. Se un'area non viene completamente tagliato dal laser utilizzare lo strumento "circolare e di taglio" di andare oltre manualmente. Continua spostando l'obiettivo di nuove viste e ripetere taglio laser fino slitta è completamente sezionato o la quantità desiderata di tessuto è stato raccolto (tipicamente 100 ghiandole benigne resa 150-500 ng di RNA). (vedi esempio in figura 1A).
7. Rimuovere con attenzione i tubi dal titolare di raccolta e chiudere i tappi, memori del tampone di lisi e del tessuto nelle calotte. Brevemente centrifugare per 30 sec per raccogliere liquidi e tessuto del fondo della provetta. Incubare i campioni a 42 ° C per 30 min e conservare a -80 ° C fino al momento per l'isolamento dell'RNA.

5. totale isolamento di RNA con un FilKit base ter-e analisi di qualità

1. Scongelare le provette su ghiaccio e portare il volume della soluzione a 100 microlitri.
2. Pre-bagnare il micro filtro di un kit di isolamento dell'RNA applicando 30 microlitri ofLysis Soluzione al centro del filtro e lasciare in ammollo whileperforming le due fasi successive (almeno 5 minuti).
3. Aggiungere 3 ml di soluzione di LCM Additivo (fornito nel kit) al lisato e mescolare nel vortex per 5 secondi. Centrifugare per 30 secondi per raccogliere il liquido sul fondo della provetta.
4. Centrifugare il filtro di pre-bagnato per ~ 30 secondi alla massima velocità per rimuovere il liquido.
5. Aggiungere 1,25 volumi (in questo caso 129 ml) di 100% di etanolo alla miscela lisato, delicatamente vortice o pipetta su e giù. ** Questo metodo recuperare entrambe le specie di RNA grandi e piccoli.
6. Caricare il campione sul microfiltro pre-umidificati, e centrifugare a 10.000 xg per 1 min per legare l'RNA al filtro. Quindi lavare micro filtro con 180 ml di "soluzione di lavaggio 1, R21; centrifugare a 10.000 xg per 1 min.
   Nota: Da questo punto in tutte le centrifugazioni dovrebbe essere fatto a 13.000 xg, o la velocità massima.
7. Lavare Filtro due volte con 180 ml di "soluzioni di lavaggio 2 e 3", rispettivamente come indicato dal protocollo del kit. Centrifugare per 30 secondi, poi scarta il flusso attraverso, e girare il filtro per 1 min per rimuovere il liquido residuo e asciugare il filtro.
8. Trasferire filtro per un nuovo tubo di raccolta.
9. Soluzione calda eluizione a -95 ° C (fornito con il kit).
10. Applicare 10 ml di soluzione di eluizione preriscaldato al centro del filtro, chiudere il tappo e conservare per 5 minuti a RT. Poi centrifugare per 1 minuto per eluire l'RNA, e ripetere questo passaggio una volta a cedere ~ 20 ml di RNA.
11. Eseguire il trattamento DNasi I per 15 minuti a 37 ° C.
12. Quantificare l'RNA da spettrofotometro con assorbanza a 260 nm. Il rapporto di densità ottica a lunghezze d'onda di 260 nm e 280 nm viene utilizzato per valutare la purezzal'RNA (vedi Tabella 1) ^15.

6. Analisi di espressione genica

Nota: espressione genica delle specie di RNA lunghi (come mRNA e lncRNAs) è mostrato in Fase 6.1 e specie di RNA brevi (come microRNA) è mostrata in fase 6.2. Sono disponibili diversi kit per RT-qPCR e la quantità di RNA richiesta varia a seconda del kit (non più di 10 ng). RNA analisi di sequenziamento è descritto in 6.3.

1. Trascrivere inversa (RT) l'RNA in cDNA mescolare 5 ml di 20 ng / mL campione di RNA con 5 ml di master mix RT (tampone RT, dNTP di, primer casuali, RT enzima inibitore RNase). Incubare la reazione per 25 minuti a 25 ° C, poi 120 min a 37 ° C e 5 min a 85 ° C.
2. Diluire la reazione RT 1:10 con RNasi acqua gratuita e utilizzare 2,5 microlitri per 10 microlitri reazione qPCR con primer o set di primer / sonde per i geni di interesse.
   Nota: Per facilitare l'analisi di RNA parzialmente degradati Si consiglia di utilizzare primer for ampliconi più brevi (meno di 100 bp) ^16. (Tabella 2B)
   1. Per l'analisi di espressione dei microRNA eseguire reazione RT mescolando 5 ml di 2-10 ng / mL campione di RNA con 5 ml di master mix RT.
      Nota: ogni tecnologia di rilevamento microRNA disponibile in commercio a base di PCR richiede l'uso di primer RT proprietari e specifici.
3. In alternativa o in aggiunta a RT-PCR, utilizzare generazione sequenziamento successivo (RNA-seq o piccolo-RNA-seq) per quantificare diverse specie di RNA. Tipicamente, usare 500 ng di RNA per questa procedura (Tabella 3) ed eseguire il metodo come indicato dallo strumento costruttore e rilevamento.

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Risultati

In un precedente studio abbiamo dimostrato l'uso di LCM per raccogliere tessuti epiteliali e stromali confrontare profilo di espressione mediante RT-qPCR di mRNA e microRNA dai tessuti prostatici congelati e FFPE dallo stesso paziente ^4. LCM richiede molto tempo, specialmente se grandi quantità di RNA è da raccogliere per l'analisi di sequenziamento di prossima generazione. Pertanto, è fondamentale per mantenere lo spazio di lavoro e strumenti RNase. Si raccomanda di controllare la qualità e cellu...

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Discussione

Profilo di espressione genica da campioni umani può essere impegnativo, non solo per la qualità o la quantità di tessuto a disposizione, ma anche per le diverse entità istologiche presenti in un dato campione di tessuto. Ciò è particolarmente impegnativo nella prostata in cui tessuti benigni sono in gran parte i tessuti stromali e le aree di cancro sono privi di stroma. LCM facilita separazione fisica di stroma prostatico e l'epitelio RNA per una firma più accurata dei due diversi tipi di cellule (Fig...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-AWAY	MBP	7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides	Leica	11600289
Glass slides, Superfrost Plus	FisherBrand	12-550-15
Ethanol 200 proof	Decon labs.	2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D-5758
Cryostat	Leica	CM3050
Coplins (Staining jar)	IHCWORLD	M900-12
Coplins (Staining rack)	IHCWORLD	M905-12
Aperio ScanScope	Aperio(Leica)	ScanScope® CS
Toluidine Blue	Fluka	89640-5G
Laser Microdissection System	Leica	LMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM	Thermo Scientific	AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-1000
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32866	Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814	Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301
TaqMan microRNA RT kit	Applied Biosystems	4366597	Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain	Ricca Chemical Company	3536-16
Eosin-Y	Richard Allan Scientific	7111