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Resumo

A técnica eletrofisiológica da gravação intracelular é demonstrado e usado para determinar sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras único no olho composto de uma borboleta.

Resumo

gravação intracelular é uma técnica poderosa usada para determinar a forma como uma única célula podem responder a um dado estímulo. Na pesquisa visão, a gravação intracelular tem sido historicamente uma técnica comum usada para estudar as sensibilidades de células fotorreceptoras individuais a diferentes estímulos luminosos que ainda está sendo usado hoje. No entanto, continua a existir uma carência de metodologia detalhada na literatura para os investigadores que desejam replicar experiências de gravação intracelulares no olho. Aqui nós apresentamos o inseto como um modelo para examinar a fisiologia do olho em geral. células fotorreceptoras de insectos estão localizados perto da superfície do olho e são, portanto, fácil de alcançar, e muitos dos mecanismos envolvidos na visão são conservadas entre filos animais. Nós descrevemos o procedimento básico para in vivo de gravação intracelular de células fotorreceptoras no olho de uma borboleta, com o objetivo de tornar esta técnica mais acessível a pesquisadores com pouca experiência anterior em electrophysiology. Introduzimos o equipamento básico necessário, como preparar uma borboleta vivo para o registo, o modo de inserir um microeléctrodo de vidro em uma única célula, e, finalmente, o processo de gravação em si. Nós também explicar a análise básica de dados de resposta matérias para determinar sensibilidade espectral de tipos de células individuais. Embora o protocolo centra-se na determinação da sensibilidade espectral, outros estímulos (por exemplo, luz polarizada) e variações do método são aplicáveis ​​a esta configuração.

Introdução

As propriedades eléctricas de células tais como neurónios são observadas através da medição do fluxo de iões através das membranas celulares, como uma mudança na tensão ou corrente. Uma variedade de técnicas electrofisiológicas foram desenvolvidos para medir bioeléctico eventos em células. Os neurónios encontrados nos olhos dos animais são acessíveis e os seus circuitos muitas vezes é menos complexa do que no cérebro, fazendo com que estas células bons candidatos para estudo electrofisiológico. As aplicações comuns de eletrofisiologia no olho incluem eletrorretinografia (ERG) 1,2 e microeletrodos de gravação intracelular. ERG envolve a colocação de um eléctrodo dentro ou sobre o olho de um animal, aplicando-se um estímulo de luz e medindo a variação de tensão como a soma de todas as respostas de células vizinhas 3-6. Se alguém está interessado especificamente na caracterização sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras individuais, muitas vezes vários tipos de células respondem simultaneamente em diferentes pontos fortes para um dado estímulo; assimpode ser difícil determinar a sensibilidade de tipos específicos de células a partir de dados do ERG especialmente se houver vários tipos diferentes de células fotorreceptoras espectralmente semelhantes no olho. Uma possível solução é criar transgênicos Drosophila com o gene fotorreceptor (opsina) de interesse expressa nas células maioria R1-6 no olho e depois executar ERGs 7. Desvantagens potenciais deste método incluem não a baixa expressão da proteína fotorreceptor 8, eo período de tempo longo para a geração e triagem de animais transgênicos. Para os olhos, com menor número de tipos de fotorreceptores espectralmente distintos, a adaptação do olho com filtros coloridos podem ajudar com a redução da contribuição de alguns tipos de células para o ERG, permitindo assim a estimativa da sensibilidade espectral máximos 9.

gravação intracelular é uma outra técnica em que uma multa eletrodo espeta uma célula e um estímulo é aplicado. Os registros de eletrodos só isso indivA resposta de células idual para que a gravar e analisar várias células individuais podem produzir sensibilidades específicas de fisiologicamente diferentes tipos de células 10-14. Embora o nosso protocolo centra-se na análise de sensibilidade espectral, os princípios básicos da intracelular de gravação com eletrodos pontiagudos são modificáveis ​​para outras aplicações. Usando uma preparação diferente de uma amostra, por exemplo, e usando eléctrodos de quartzo afiadas, um pode gravar a partir de mais profundo no lobo óptica ou outras regiões do cérebro, de acordo com a questão que se coloca. Por exemplo, os tempos de resposta de células fotorreceptoras individuais 15, a actividade de células na óptica lóbulos 16 (lâmina, medula ou lobula 17), cérebro 18 ou outros gânglios 19 também podem ser gravadas com técnicas semelhantes, ou estímulos de cor pode ser substituído com polarização 20 -22 ou movimento estímulos 23,24.

Fototransdução, o processo pelo qual a luzenergia é absorvida e transformada em um sinal eletroquímico, é uma característica antiga comum a quase todos os dias atuais filos animais 25. O pigmento visual encontrado em células fotorreceptoras e responsável por iniciar fototransdução visual é rodopsina. Rodopsinas em todos os animais são constituídos por uma proteína opsina, um membro da família G transmembranar sete do receptor acoplado à proteína, e um cromóforo associado que é derivada de uma molécula de retina ou semelhantes 26,27. Opsina sequência de aminoácidos e estrutura cromóforo afectar a absorvência da rodopsina para diferentes comprimentos de onda de luz. Quando um fotão é absorvido pelo cromóforo a rodopsina torna-se activa, iniciando uma cascata de proteína G na célula que, em última análise conduz à abertura de canais iónicos ligados à membrana 28. Diferentemente da maioria dos neurônios, células fotorreceptoras sofrer alterações potenciais graduados que podem ser medidos como uma mudança relativa na amplitude da resposta com a mudança de estímulo luminoso. Tipicamente, uma dadaTipo de fotorreceptores expressa apenas um gene da opsina (embora existam exceções 8,10,29-31). visão de cores sofisticada, do tipo encontrado em muitos vertebrados e artrópodes, é conseguido com um olho complexo de centenas ou milhares de células fotorreceptoras cada expressando mais uma ou ocasionalmente tipos rodopsina. A informação visual é capturado por comparação das respostas sobre o mosaico de fotorreceptores via de sinalização a jusante neural complexo no olho e no cérebro, resultando na percepção de uma imagem completa a cores e com movimento.

Depois de medir as respostas de matérias de uma das células fotorreceptoras para diferentes comprimentos de onda da luz de gravação via intracelular, é possível calcular a sensibilidade espectral. Este cálculo baseia-se no princípio de Univariance, o que indica que a resposta de uma célula de fotorreceptores é dependente do número de fotões que absorve, mas não sobre as propriedades particulares dos fotões que absorve 32. Qualquer fotões que é absorbed por rodopsina irão induzir o mesmo tipo de resposta. Na prática, isto significa que a amplitude de resposta em bruto de uma célula irá aumentar devido a um aumento na intensidade da luz (mais fotões de absorver), ou a uma mudança no comprimento de onda para a sua sensibilidade de pico (maior probabilidade de rodopsina absorvendo esse comprimento de onda). Nós fazemos uso deste princípio em relacionar as respostas celulares a uma intensidade conhecida e ao mesmo comprimento de onda de respostas em diferentes comprimentos de onda e na mesma intensidade, mas sensibilidade relativa desconhecida. Os tipos de células são frequentemente identificado pelo comprimento de onda a que os seus picos de sensibilidade.

Aqui nós mostramos um método para gravação e análise de sensibilidade espectral de fotorreceptores no olho de uma borboleta intracelular, com um foco em tornar este método mais acessível à comunidade científica em geral. Embora a gravação intracelular continua a ser comum na literatura, particularmente com respeito à visão de cores em insetos, encontramos that descrições de materiais e métodos são geralmente demasiado curto para permitir a reprodução da técnica. Nós apresentamos este método em formato de vídeo com o objectivo de permitir sua replicação mais fácil. Descrevemos também a técnica de utilização de equipamento de fácil obtenção e acessível. Abordamos ressalvas comuns que muitas vezes não são relatados, que retardam a investigação ao otimizar uma técnica nova e complexa.

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Protocolo

Todos os animais foram tratados o mais humanamente possível. Os insetos foram enviados como pupas de Costa Rica Entomological Supply, Costa Rica.

1. Heliconius Pupae Cuidados

  1. Pendure todos pupas espaçadas 2-3 cm de distância em câmara úmida usando os pinos de insetos.
  2. Após a eclosão, permitir asas para secar em seguida, manter borboletas vivo por pelo menos 1 dia em câmara úmida e alimentar uma solução diluída de mel por dia antes da gravação.
    1. Diluir o mel com água a cerca de uma solução de mel a 20% em volume, e despeje em um prato raso Petri.
    2. Traga borboletas individuais para a placa de Petri, um por um. Ao tocar a solução com sua tarsos frente, as borboletas irão estender automaticamente seus proboscides e beber a partir da placa de Petri. Se sua tromba não estender automaticamente, utilize uma pinça para puxar a tromba para fora e apresentá-lo para a solução de mel.

2. Pista Optical, calibração e MEASURement of Experimental condições de luz

  1. Coloque uma lâmpada de arco de 150 W Xenon com moradia e alimentação universal e um conjunto de lente condensador ligado em uma extremidade de uma tabela pelo menos um metro de comprimento para fornecer luz branca brilhante.
    CUIDADO: lâmpadas de arco de xénon produzir luz extremamente brilhante, com intensidades UV fortes. óculos de proteção deve ser usado em todos os momentos e a lâmpada deve ser usado como indicado pelo fabricante para evitar a acumulação de ozono causadas pela interação da luz UV com o oxigênio atmosférico.
  2. Defina-se uma faixa de um metro de comprimento óptico para a luz que sai do conjunto de alojamento para passar através de (Figura 1).
    1. Lugar na seguinte ordem no caminho óptico com distâncias aproximadas de intervalo: 1) uma sílica convexa ou lente de quartzo de 40 cm a partir da montagem de condensador, 2) uma roda de filtro de densidade neutra (sem filtros atualmente no trajeto de luz) 22 cm mais longo a pista, 3) um obturador com a unidade de acionamento 14 cm do filtro NDs, 4) uma sílica ou quartzo lente côncava imediatamente adjacente seguindo o obturador, e 5) um collimating sonda feixe de 6 cm mais ao longo da extremidade da pista.
    2. Apor um cabo de fibra óptica de 600 um de diâmetro para a sonda de feixe de colimação.
      Nota: Dependendo da intensidade da luz, um cabo de fibra óptica 5-10 mm de diâmetro podem ser necessárias para proporcionar uma luz suficiente para outras preparações e pode ser substituído por este.
    3. Ajustar a distância, a altura e o ângulo de cada elemento óptico de modo que o feixe de luz que sai do conjunto é na maior intensidade possível.
    4. Como elementos de trilha ópticos podem ser ligeiramente diferentes, com diferentes aplicações, garantir que todos os elementos de transmitir luz no UVA e faixa visível (315-700 nm).
  3. Uma vez que a pista óptica é montada, medir a luz que passa através da instalação utilizando um espectrómetro. Calibrar o espectrômetro de primeira usando uma lâmpada de calibração com um espectro conhecido e software do fabricante.
    Nota: Nós descrever o seguinte configurar o uso de produtos da Ocean Optics para maior clareza, mas outros fabricantes (por exemplo, Avantes) vender produtos comparáveis.
    1. Acender a luz de calibração de tungsténio, pelo menos, 45 min antes de efectuar medições.
    2. Para calibrar, anexar o espectrômetro via USB a um computador com o software associado instalado. Em seguida, conecte o espectrômetro à lâmpada de calibração de tungstênio através de um corrector de transmissão cosseno UV-visível.
    3. Selecione "New Absolute Irradiance Medição" na guia "Arquivo" e selecione o espectrômetro como a "Fonte".
    4. Siga as instruções para criar uma nova calibração de arquivo "cal". Quando solicitado, carregar o arquivo de dados, previstas para o espectro conhecido da lâmpada de calibração de tungstênio na faixa da luz visível (300-800 nm) para o software, que calcula automaticamente o espectro corrigido a partir da saída espectrômetro.
    5. Salve o arquivo de calibração. Carregar este arquivo quando initializing o software para todas as medições futuras do espectro de luz usando o espectrômetro.
  4. Uma vez que o espectrômetro é calibrado, usar isso para registrar o espectro de luz a partir da configuração experimental. A partir de agora, quando o software é aberto, selecione "New Absolute Irradiance Medição" e carregar o arquivo de calibração salvo anteriormente. Em seguida, pegue um espectro escuro, bloqueando toda a luz ao espectrômetro.
    1. Com o espectrômetro atualmente medir as condições de luz experimentais desejados, ajustar o tempo de integração (4 ms), scans a média (5), ea largura vagão (5), de modo que o espectro está devidamente dimensionado e alisado. Manter as configurações a mesma para todas as medições espectrais, de modo que as intensidades de luz a partir de medições diferentes podem ser comparadas.
  5. Medir espectros de luz branca não atenuado, para todos os filtros de densidade neutra para ser utilizado durante as experiências, e para cada filtro de interferência de passagem de banda (Figura 2).
    1. Medir o espectro de luz branca, sem quaisquer filtros no caminho da luz pela aposição da extremidade livre do cabo de fibra óptica a partir do passo 2.2.2 do espectrômetro. Com o arquivo de calibração carregado a partir do passo 2.3, salvar o espectro de luz branca usando o software do espectrômetro como um arquivo de texto.
      Observação: Os espectros guardadas como ficheiros de texto listar o comprimento de onda (coordenadas X) em uma coluna e a intensidade da luz (Y coordenadas) na segunda coluna, de modo que os dados podem ser carregados em um folha de cálculo para o passo 2.6.
    2. Usando a mesma configuração como passo 2.5.1, gravar o espectro de cada densidade óptica (DO) (0-3,5 OD) utilizado durante as experiências, rodando a densidade neutra (ND) roda de filtros na faixa óptica, e salve o arquivo de texto para cada OD.
    3. Usando a mesma configuração como passo 2.5.1, coloque a interferência de banda meia nm 10 filtra um por um para o caminho da luz e registrar o espectro observado para cada filtro. Repita esse procedimento para cada um dos 41 filtros de interferência diferentes wtransmitâncias om pico espaçados a cada 10 nm 300-700 nm. Filtros espaçados mais distantes (20 nm) são aceitáveis ​​para a maioria das aplicações (por espectros, ver Figura 2).
  6. Corrigir as diferenças na intensidade da luz quando os filtros de interferência são colocadas no caminho da luz. Cada filtro de interferência permite um diferente número total de fotões para passar, e a baixa transmissão de alguns filtros faz com que seja difícil para atenuar ainda mais a intensidade de modo que todos os filtros permitem que os números iguais de fotões.
    1. Para calcular a intensidade relativa (I) para cada filtro de interferência de banda de 10 nm, para resolver I, na expressão, I = t / segundo, onde t é a área sob a curva espectral de cada filtro de interferência 10 nm (a partir de 2.5.3) e s é a irradiância absoluta (valor y de arquivo de texto salvo de 2.5.1) máximo de luz branca no comprimento de onda de pico de cada filtro (ver Figura 2 para um exemplo a 520 nm).
    2. Dividir todo intensit calculadas por o valor da intensidade máxima calculada em 2.6.1 para normalizar a um, e levar o recíproco dos valores normalizados relativamente à utilização de um factor de correcção aplicada à sensibilidade em bruto em cada comprimento de onda (ver Passo 6.4).
  7. Execute as etapas de 2.1 a 2.6 apenas uma vez antes de um conjunto de experiências. Durante o curso de uma experiência gravar periodicamente a irradiância absoluta da lâmpada de arco de xénon sob filtros de densidade neutra e luz brilhante, para garantir que a intensidade da luz de estímulo não é alterado.
  8. Durante o curso de uma experiência, se houver resposta celular a luz transmitida através dos filtros de interferência de métodos a amplitude da resposta máxima, utilizar os filtros ND para atenuar o sinal. Se ND filtros são utilizados durante uma experiência, representam o decréscimo correspondente de intensidade durante o cálculo de sensibilidade espectral.
  9. Configurar o controle óptico, calibração e filtros de dias ou semanas antes de começar as experiências. Mantenha os filtroscoberta para evitar acúmulo de poeira.

Setup 3. Equipamento de gravação

  1. Alimentar o mesmo cabo de fibra óptica utilizado para a calibração por meio de uma gaiola de Faraday e de montagem de um dispositivo, tal como um goniométrico perímetro braço Cardan (ver Figura 3 para a figura). O cabo será cerca de 10 cm de distância a partir do olho do espécime.
  2. Coloque uma fase de metal sobre uma mesa vibratoriamente isolado com um suporte de eléctrodo montado directamente por cima da fase sob o controlo de um micromanipulador (Figura 4). Colocar o braço cardan de modo que a cabeça do espécime está no centro da esfera, criada pelo movimento de rotação do braço.
  3. Utilizando um sistema de pré-amplificador intracelular, que inclui um amplificador (fora da gaiola de Faraday) e pré-amplif icador (andar de entrada, perto da preparação no interior da gaiola de Faraday) montar headstage acima da fase de metal, onde o espécime será colocado.
    1. Conecte um cabo coaxial à headstage através de umconexão BNC. Separação aberta apenas a ponta sobre a outra extremidade do cabo coaxial, e separar o revestimento de metal exterior do cabo a partir do fio interno.
    2. Soldar a bainha exterior (mantida ao potencial da terra), para uma extremidade de um fio de cobre isolado com um agrafo na outra extremidade. Este jacaré vai anexar ao eletrodo de referência de metal na plataforma espécime (Passo 5.1.4).
    3. Soldar o fio interno do cabo coaxial a um fio de prata fina, para servir como o eléctrodo de registo. Este fio deve ser fina o suficiente para ser alimentado no eletrodo de vidro cheio de solução no Passo 5.2.3.
  4. Coloque um estereomicroscópio ligada a um braço oscilante e da base no banco de madeira fora da gaiola de Faraday, de modo que pode ser oscilado para diminuir o eléctrodo para dentro do olho, e balançado novamente para fora uma vez que o eléctrodo é no olho.
  5. Certifique-se de tudo o metal dentro da gaiola de Faraday está devidamente fundamentada.
  6. Fora da gaiola de Faraday, anexar o preamplifER para a entrada de um redutor de ruído 50-60 Hz (opcional), e ligar a saída de um canal de um osciloscópio usando um adaptador T BNC.
  7. Usando a outra extremidade do adaptador T, ligar o sinal que passa através do osciloscópio para um canal do hardware. Una este hardware de um computador através de um cabo USB, que vai permitir que as respostas gravados com o pré-amplificador para ser lida por software no computador.
  8. Anexar o motorista do obturador da pista óptica para o segundo canal do osciloscópio usando outro T-adaptador e ligue a um gerador de pulso que irá controlar a frequência e duração das ondas de luz entregues ao olho (Passo 5.5).
    Nota: A instalação do próprio equipamento só deve ser feito uma vez. Break aqui até que esteja pronto para começar as gravações.

4. Prep no Dia da Gravação

  1. Ligue a lâmpada Xenon, pelo menos, 45 minutos antes do experimento e ligue o extrator de microeletrodos de vidro, pelo menos, 30 minutos antes puleletrodos de vidro ling.
  2. Ligue todos os equipamentos de gravação (obturador, amplificador, eliminador de ruído, gerador de pulso, osciloscópio, e aquisição de dados hardware) e certifique-se que o obturador é fechado por padrão, então nenhuma luz passa através do cabo de fibra óptica.
  3. Puxe borosilicato multa (ou aluminossilicato) microeletrodos de vidro (100-250 resistência mohms é ideal) usando um extrator de microeletrodos de vidro. Utilize eletrodos de vidro dentro de apenas algumas horas de ser puxado.
  4. Backfill os eléctrodos com cloreto de 3 M de potássio (KCl). Note-se que esta solução pode ser modificado de acordo com as necessidades do pesquisador, por exemplo corante injectável.

5. Espécime Prep e procedimento de gravação

  1. Prepare o Specimen
    1. Cole uma borboleta indivíduo dentro de um pequeno tubo de plástico com cera quente para a cabeça é imóvel e projectando-se a partir de uma extremidade do tubo. Cera para baixo tromba, antenas e asas (Figura 5).
    2. Mantenha pressionado tele abdómen com um pedaço de cera seca e manter o tubo humidificado pela colocação de um tecido húmido no interior do tubo por trás do abdómen. Certifique-se a amostra é completamente imóvel.
    3. Montar o tubo, utilizando um pequeno pedaço de cera numa pequena plataforma com uma articulação de esfera e caixa que está ligado a uma base magnética.
    4. Sob um microscópio de dissecação, inserir um fio de prata de 0,125 mm de diâmetro na cabeça através dos aparelhos bucais para ser utilizado como eléctrodo de referência. Antes do experimento, fixar permanentemente o fio para a plataforma de tal modo que o fio de cobre no Passo 3.3.2 pode cortar-se a ela, uma vez que a plataforma está colocada sobre o palco para a gravação.
    5. Uma vez que o eléctrodo de referência está numa posição apropriada, pode ser mantida no lugar por fusão e, em seguida, rapidamente cera de arrefecimento em torno do fio.
    6. Usando uma lâmina de aço-carbono quebrável, parte aderência da lâmina com um suporte de lâmina e cortar um pequeno pedaço de usar para cortar a córnea.
    7. Corte um pequeno buraco (~ 10 ommatidium de diâmetro) na córnea esquerda usando a lâmina de barbear e selar o buraco com vaselina para evitar a dessecação.
  2. Uma vez que a córnea é cortado, inserir o eléctrodo de registo para dentro do olho tão rapidamente quanto possível, porque hemolinfa no olho irá endurecer rapidamente e tornam impossível a adição de um eléctrodo. Se possível realizar a dissecção na plataforma onde a gravação ocorrerá.
    Nota: Vaseline não deve ser espalhada no resto do olho, pois isso vai desfocar a ótica.
    1. Se ainda não estiver no palco, coloque o espécime montado e uma plataforma para o palco na plataforma de gravação. Conecte o fio terra headstage do passo 3.3.2 para o eletrodo de referência na plataforma amostra usando clipes jacaré.
      Nota: Se for possível utilizar um filtro vermelho para iluminar o animal.
    2. Use uma fonte de luz com anexos gooseneck para iluminar brevemente o espécime sob um estereoscópio, baixando o eletrodo de registro no olho.
    3. Dentrosert o fio de prata ligado ao andar de entrada do passo 3.3.3 em solução de KCl na parte de trás de um microeléctrodo de vidro. Monte o eletrodo de vidro no suporte do eletrodo.
    4. Ajuste o suporte do eléctrodo de modo que o microeletrodo é diretamente sobre o buraco previamente cortado na córnea, cerca de um milímetro acima da córnea. Diminuir o microeléctrodo no olho utilizando o micromanipulador até que um circuito é completado, conforme demonstrado por uma grande alteração no potencial (mV) no osciloscópio.
  3. Uma vez no olho, balançar o estereoscópio fora da gaiola de Faraday, e desligar a fonte de luz que ilumina a amostra. O quarto deve ser mantido escuro, de modo que o olho torna-se escuro adaptado.
  4. Verifique a resistência do eléctrodo por aplicação de uma corrente de Na 1 a partir do amplificador e observando a mudança na tensão. A resistência deve ser tipicamente na faixa entre 100-250 mohms. resistências mais elevados são indicativos de bloqueio ou flexão do eléctrodo, e baixas resistências de electrquebra ode.
  5. Activar o gerador de impulsos de modo que o obturador se abre permitindo que um raio de luz com uma duração de 50 ms a cada 0,5 segundos, e permitir que ele continue a piscar durante a duração da experiência.
    1. Ajuste o gerador de impulsos, de modo que permite que os raios de até 50 mseg de duração. Esta duração e pausa de 0,5 segundos entre flashes mantém o espécime tão perto escuro adaptado quanto possível durante o experimento. Cinquenta ms está perto de a duração do flash menor que vai provocar a mesma amplitude em resposta como durações de flash mais longos.
    2. respostas re-medida no início e final do experimento (Passo 5,16). Ao longo de cerca de uma experiência de 20 minutos, estas configurações de flash não degradam a resposta ao longo do tempo. Diferentes preparações podem necessitar de ajustes para essas configurações de flash.
  6. Posicionar o braço de cardan de modo que o cabo de fibra óptica é dirigida para o olho.
  7. Verifique o osciloscópio para a mudança de tensão com cada flash de luz.A variação negativa na voltagem significa que o eléctrodo ainda não entrou uma célula.
  8. Mover o braço em torno de Cardan a amostra até que esteja posicionado num ângulo para o olho em que há um máximo de resposta de tensão.
  9. Gire o micromanipulador frente e para trás, fazendo com que pequenos movimentos verticais do eletrodo em ambas as direções, enquanto batendo levemente a base do porta-eletrodo ou usando a função do zumbido no pré-amplificador. Continue fazendo pequenos ajustes até que uma resposta clara despolarizante aparece no osciloscópio (Figura 6).
  10. Ajuste o braço Cardan novamente para encontrar o ângulo de incidência onde um flash de luz produz o maior sinal de despolarização. Faça pequenos ajustes com o micromanipulador e usar a função do zumbido no amplificador conforme necessário para garantir que o eletrodo está gravando de forma estável da célula e que ele vai ficar na célula para todo o experimento (veja o passo 5.11).
  11. Depois que a instalação é estável, comece recording. Uma gravação estável deve ter pouca ou nenhuma mudança em potencial, baixo nível de ruído de fundo, e uma forma consistente grande resposta despolarizante repouso (pelo menos 10: 1 sinal-ruído).
    1. Executar o software no computador, e começar uma "nova experiência", que irá abrir uma janela pop-up com quatro canais.
    2. Ajuste a escala de tensão no canto superior direito da janela do software a 500 mV. O primeiro canal irá exibir as respostas registadas a partir do eléctrodo e em tempo real, enquanto que o segundo canal irá registar a onda quadrada produzida pelo gerador de função, se o sinal é alimentado para o hardware de aquisição de dados através do osciloscópio, mostrando quando o obturador é aberto . Os outros dois canais são desnecessários.
    3. Clique em "Iniciar" no canto inferior direito para começar a gravar, e permitir que o software seja executado para a duração do experimento. Ajuste o zoom do X (tempo) e y (tensão) eixos, de modo que as respostas são claras.
  12. Primeiro, com a luz branca, gravar até 10 respostas individuais com a roda de filtros ND em 3,5 OD (cerca de 5-10 seg).
  13. Próximo registro o mesmo número de respostas em 3,3 OD, em seguida, 3.1, 3.0, 2.5, 2.3, 2.1, etc., em todas as combinações até 0,0 OD. Estas amplitudes de resposta à série de filtro ND irá fornecer a curva de intensidade da resposta-log na Seção 6. Se ocorrer branqueamento, usar menos flashes de estímulos luminosos durante o curso do experimento.
  14. Gravar a resposta da célula a todos os comprimentos de onda, utilizando os filtros de interferência.
    1. Primeiro encontrar o comprimento de onda de pico. Sem filtros ND no caminho da luz (0,0 OD), coloque um filtro de transmissão UV no caminho da luz e brevemente observar a amplitude da resposta. Repita com um filtro azul de origem, um filtro de transmissão verde, e um filtro de transmissão vermelho, que deve dar uma idéia de onde o pico de resposta será.
    2. Use filtros em cerca de 350, 450, 550, 650 nm para encontrar a região geral da sensibilidade pico emetapa 5.14.1. O comprimento de onda exata não importa nesta fase de pesquisa inicial, porque todos os comprimentos de onda será gravado na próxima etapa. Se existirem as sensibilidades de pico estimativas, ou que tenham sido gravadas anteriormente, de uso conhecido comprimentos de onda para identificar rapidamente a resposta de pico.
    3. Uma vez que a resposta máxima ou próximo a ele é identificado, ficha neste comprimento de onda de 10 respostas (cerca de 5 seg).
    4. Depois de gravar no comprimento de onda de pico de resposta, ficha com os outros filtros de interferência, 300-700 nm a 10 nm etapas. Iniciar a partir do pico e sair em direção a ambos os comprimentos de onda mais curtos e mais longos por trocar os filtros para fora do caminho da luz, um por um (por exemplo, se a resposta de pico é a 520 nm, as respostas registro neste comprimento de onda em primeiro lugar, em seguida, 510 nm, seguido de 530 nm, 500 nm, 540 nm, 490 nm, 550 nm, e assim por diante até que não haja nenhuma resposta).
    5. Permitir para até 10 respostas por filtro (5 segundos cada). Quando trocar filtros de interferência, permitir que a célula respond a 1-2 flashes de luz branca, sem qualquer filtro no caminho da luz, que é útil para monitorar se o pico de resposta está degradando ao longo do tempo. Reduzir o número de respostas ou aumentar o OD se o branqueamento ocorre.
  15. Se a resposta em qualquer filtro de interferência é muito perto da resposta máxima sob luz branca a 0 OD, em seguida, atenuam com filtros ND. Os filtros e tamanho do cabo de fibra óptica usado nesta experiência de interferência atenuar grandemente a intensidade da luz e assim por filtros ND normalmente não são necessários.
  16. Se a gravação permanece comprimentos de onda estáveis, regravar todo o pico de resposta, que serve como um pseudoreplicate para confirmar amplitudes de resposta anteriores e ajuda a garantir a resposta não tem degradado ao longo do tempo. Uma vez que todos os comprimentos de onda são registradas, re-gravar as respostas, nos termos da série ND, como no passo 5.12.
  17. Quando a gravação é concluída clique em "Stop" no software, e salvar a gravação para análise.
  18. Depois de uma experiência, sacrificar o indivíduo por congelação ou arrefecimento durante alguns minutos seguido por rapidamente cortar a cabeça e esmagamento do tórax.
  19. Desligue todos os equipamentos. Break aqui, se necessário, antes de fazer a análise.

6. Spectral Análise de Sensibilidade

  1. Com o software utilizado para registar as respostas matérias, calcular a amplitude da resposta média de 10 respostas individuais para cada filtro na série de valores medidos e para cada filtro de interferência.
  2. Criar uma função de resposta-log da intensidade (VlogI) a partir da série filtro ND gravado nos Passos 5,12-5,13 (Figura 7). Para fazer isso, traçando unidades logarítmicas de intensidade (OD) no eixo X, e a resposta a cada intensidade no eixo y.
    1. Para derivar sensibilidade espectral da célula em diferentes comprimentos de onda, tipicamente ajuste da equação Naka-Rushton com os dados do passo 6.2, e usar esta equação para relacionar as respostas espectrais obtidos experimentalmente de comprimentos de onda diferentes tO fótons relativos necessários para obter essa resposta no âmbito de um comprimento de onda constante (neste caso luz branca).
      Nota: A equação Naka-Rushton é: V / V máx = I N / (I + N N), onde I é a intensidade do estímulo, V é a amplitude de resposta, Vmax é a amplitude da resposta máxima, K é o estímulo intensidade dando ½ Vmax, e n é a inclinação exponencial. Vários métodos podem ser usados ​​para se ajustar esta equação para os dados VlogI, incluindo software de ajuste de curva, ou pacotes estatísticos baseados em código.
    2. Para ajustar a equação Naka-Rushton usando cálculos simples e um programa de planilha, transformar os dados de resposta VlogI para cada intensidade do estímulo: log [(V max / V) - 1]. Em seguida, realize a regressão linear sobre os dados transformados para obter a equação da linha de melhor ajuste.
      Nota: V max deve ser maior do que quaisquer respostas medidas; para manter esta consistente, este método estima Vmax como 1% GREater do que a maior resposta medida.
    3. A partir da equação da linha de regressão, estimar o expoente (n), tomando a inclinação negativa, e log (K) = intercepção y / n.
  3. Uma vez que os parâmetros de V max, N, e K foram estimados, determinar o número relativo de fotões necessários para provocar a resposta espectral da célula em cada comprimento de onda, ligando a resposta espectral medida a um determinado comprimento de onda como (v) e solução de I.
  4. Multiplicar a intensidade do estímulo calculada (I) a partir do passo 6.3 pelo factor de correcção para cada filtro de interferência (a partir do passo 2.4.3) em cada comprimento de onda.
  5. Para se ter sensibilidade, todas as intensidades deve estar relacionada com a curva V log-I para que eles possam ser comparados. Para fazer isso, relacionando cada intensidade de comprimento de onda a ½ V max ou K, calculada no Passo 6.2.3.
    1. Subtrair cada comprimento de onda da intensidade corrigida (Passo 6.4) a partir de K.
    2. Então, para cada intensidade de comprimento de onda, adicione "distância a partir do valor K "a K, e multiplica-se por (-1).
    3. Próximo trazer todos os pontos de dados positivos, adicionando o valor absoluto do menor ponto de dados em série para cada comprimento de onda.
  6. Encontrar sensibilidade em cada comprimento de onda, tomando o recíproco de todas as intensidades recém-calculados a partir do Passo 6.5.1. Transformar os dados de modo que o espectro de sensibilidade cai entre 0 e 1.
  7. Depois de gravar a partir de mais de uma célula do mesmo tipo da média das respostas finais e enredo com barras de erro padrão ou intervalos de confiança de 95% (Figura 8).

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Resultados

Para muitos elementos da configuração de gravação, uma descrição escrita não fornece detalhes suficientes. A Figura 1 é um esquema dos componentes envolvidos na configuração completa de gravação. Na Figura 2, os espectros são traçados para a luz branca e cada um filtro de interferência para dar um sentido de por que é necessário um factor de correcção eo que é necessário para calcular essa correção. A Figura 3 mostra fotos e um diagrama d...

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Discussão

gravação intracelular pode ser uma técnica difícil de dominar, devido aos muitos passos técnicos envolvidos. Para experiências com sucesso vários pontos importantes devem ser considerados. Em primeiro lugar, é importante ter uma tabela adequadamente vibratoriamente-isolado no qual é realizada a experiência. Muitos pesquisadores usam tabelas de ar, que separam completamente a mesa a partir da base, dando isolamento de vibração superior. Nossa configuração envolve uma mesa de mármore de espessura com uma ca...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos ao final de Rudy Limburg para fabricar as perímetro de braço cardan, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate para nos emprestar equipamentos e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, para o incentivo. Este trabalho foi apoiado por uma National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship para KJM e concessão NSF IOS-1257627 para ADB

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Butterfly pupaeSeveral local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits
Large plastic cylinderAny chamber that remains humidified will work
Insect pins, size 2BioQuip1208B2
100% Desert Mesquite HoneyTrader Joe'sAny honey or sucrose solution will work
Xenon Arc LampOriel Instruments66003Oriel is now a part of Newport Corporation
Universal Power SupplyOriel Instruments68805Oriel is now a part of Newport Corporation
Optical TrackOriel Instruments11190Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Large (2x)Oriel Instruments11641Oriel is now a part of Newport Corporation
Rail Carrier, Small (4x)Oriel Instruments11647Oriel is now a part of Newport Corporation
Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10Newport CorporationTA-8Q20-10
Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x)Newport CorporationSP-1
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x)Newport CorporationVPH-2
Fixed lens mount, 50.8 mmNewport CorporationLH-2
Fixed lens mount, 25.4 mmNewport CorporationLH-1
Condenser lens assemblyNewport Corporation60006
Convex silica lens, 50.8 mmNewport CorporationSPX055
Six Position Filter Wheel, x2Newport CorporationFW1X6
Filter Wheel Mount HubNewport CorporationFWM
Concave silica lens, 25.4 mmNewport CorporationSPC034
Collimator holderNewport Corporation77612
Collimating beam probeNewport Corporation77644
Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard FerruleNewport Corporation77670This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder 
600 μm diameter UV-vis fiber obtic cableOriel Instruments78367Oriel is now a part of Newport Corporation
Shutter with drive unitUniblitz100-2B
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 ODNewportFRQ-ND01
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 ODNewportFRQ-ND03
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 ODNewportFRQ-ND05
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 ODNewportFRQ-ND10
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 ODNewportFRQ-ND30
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 ODNewportFRQ-ND50
LS-1-Cal lampOcean OpticsLS-1-Cal
SpectrometerOcean OpticsUSB-2000
SpectraSuite SoftwareOcean Optics
Interference bandpass filter, 300 nm Edmund Optics67749
Interference bandpass filter, 310 nm Edmund Optics67752
Interference bandpass filter, 320 nm Edmund Optics67754
Interference bandpass filter, 330 nm Edmund Optics67756
Interference bandpass filter, 340 nm Edmund Optics65614
Interference bandpass filter, 350 nm Edmund Optics67757
Interference bandpass filter, 360 nm Edmund Optics67760
Interference bandpass filter, 370 nm Edmund Optics67761
Interference bandpass filter, 380 nm Edmund Optics67762
Interference bandpass filter, 390 nm Edmund Optics67763
Interference bandpass filter, 400 nm Edmund Optics65732
Interference bandpass filter, 410 nm Edmund Optics65619
Interference bandpass filter, 420 nm Edmund Optics65621
Interference bandpass filter, 430 nm Edmund Optics65622
Interference bandpass filter, 440 nm Edmund Optics67764
Interference bandpass filter, 450 nm Edmund Optics65625
Interference bandpass filter, 460 nm Edmund Optics67765
Interference bandpass filter, 470 nm Edmund Optics65629
Interference bandpass filter, 480 nm Edmund Optics65630
Interference bandpass filter, 492 nm Edmund Optics65633
Interference bandpass filter, 500 nm Edmund Optics65634
Interference bandpass filter, 510 nm Edmund Optics65637
Interference bandpass filter, 520 nm Edmund Optics65639
Interference bandpass filter, 532 nm Edmund Optics65640
Interference bandpass filter, 540 nm Edmund Optics65642
Interference bandpass filter, 550 nm Edmund Optics65644
Interference bandpass filter, 560 nm Edmund Optics67766
Interference bandpass filter, 570 nm Edmund Optics67767
Interference bandpass filter, 580 nm Edmund Optics65646
Interference bandpass filter, 589 nm Edmund Optics65647
Interference bandpass filter, 600 nm Edmund Optics65648
Interference bandpass filter, 610 nm Edmund Optics65649
Interference bandpass filter, 620 nm Edmund Optics65650
Interference bandpass filter, 632 nm Edmund Optics65651
Interference bandpass filter, 640 nm Edmund Optics65653
Interference bandpass filter, 650 nm Edmund Optics65655
Interference bandpass filter, 660 nm Edmund Optics67769
Interference bandpass filter, 671 nm Edmund Optics65657
Interference bandpass filter, 680 nm Edmund Optics67770
Interference bandpass filter, 690 nm Edmund Optics65659
Interference bandpass filter, 700 nm Edmund Optics67771
Faraday cageAny metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup.
Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnificationWild HeerbruggWild M5Any Stereomicroscope will do
Microscope stand with swinging arm and heavy baseMcBain InstrumentsAny heavy base with arm will do
Cardan armCustom built, See Figure 4
Fiber-lite high intensity illuminatorDolan-JennerMI-150For lighting specimen
Fiber-lite goose-neck light guideDolan-JennerEEG 2823Any goose-neck light guide will do
Marble table
Raised wooden tableHole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath
Wooden box filled with sandcustom built, any box with sand
ManipulatorCarl Zeiss - Jena
Electrode holder
Specimen stage
Alligator clip wires for grounding
Insulated copper wire
Silver wire, 0.125 mm diameterWorld Precision InstrumentsAGW0510
BNC cables
Preamplifier with headstageDagan CorporationIX2-700
Humbug Noise reducerQuest ScientificHumbug
Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probeEZ Digitalos-5030
BNC T-adapter
Powerlab hardware 2/20ADI instrumentsML820
Labchart softwareADI instrumentsChart 5
10 MHz Pulse GeneratorBK Precision4030
Glass pipette pullerSutter InstrumentsP-87
Borosillicate glass capillaries with filamentWorld Precision Instruments1B120F-4
Potassium chloride, 3 M
Slotted plastic tube
Low melting temperature wax
Soldering IronWeller
Platform with ball-and-socket magnetic baseHama photo and video
Double edge carbon steel, breakable razor bladeElectron Microscopy Sciences72004
Vaseline
Microsoft ExcelMicrosoft

Referências

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