Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

Resumo

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Resumo

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Introdução

O estudo de tecidos, órgãos ou sistemas in vitro é uma tentativa para simplificar os relacionamentos existentes muito complexas entre os vários subtipos celulares que compreendem organismos multicelulares. De facto, estudos in vitro tornam possível adquirir uma compreensão detalhada das populações de células individuais. Existem duas grandes vantagens da realização de experiências in vitro: 1) reduzidas interacções celulares, e 2) a capacidade de manipular facilmente o ambiente celular. Cientistas Assim, estas duas vantagens permitiram prever o comportamento de tipos específicos de células in vivo, levando a capacidade para regular os resultados de influências extrínsecos em organismos inteiros. Nesse sentido, em cultura de células in vitro muitas vezes funciona como uma ponte de ligação entre ciências básicas e aplicadas de vida. No entanto, também existem várias desvantagens de se trabalhar in vitro, o mais importante sendo que uma certa reserva pode habitar na fisiológicoal relevância dos fenótipos observados. Com efeito, quando um único tipo de célula é cultivada num vaso, a cultura perde, em graus diversos,, as suas ligações célula-célula com outros tipos de células, a sua contribuição para o ambiente humoral a partir do tecido e organismo de origem, e as âncoras dentro o tecido que lhe permitiu manter uma estrutura tridimensional em particular, por vezes crucial para a função da célula.

A questão da relação célula-célula foi abordada pelo desenvolvimento de técnicas de cultura mista. Neste método, duas ou mais populações de células são cultivadas em conjunto no mesmo vaso de cultura. No entanto, estas culturas mistas suportar inconvenientes importantes. Por um lado, alguns subtipos de células não interagem fisicamente com o outro no tecido de origem e depender unicamente das comunicações parácrinos sustentadas por fatores solúveis secretados e receptores nas proximidades. Este é o caso de vários processos inflamatórios que dependem da sinalização de citocina proximal. Em c mistaultures, interações físicas são inevitáveis ​​e torná-lo impossível estudar comunicações parácrinos na ausência de contatos célula-célula que podem produzir resultados alterados. Por outro lado, a realização interpretações específicos de células a partir de uma população mista torna-se inviável sem o uso de técnicas de separação duras que poderiam afectar de forma significativa os resultados.

Para resolver estes problemas importantes, a utilização de meios condicionados foi desenvolvido como uma técnica que permite culturas compartimentadas e o estudo da sinalização parácrina. Este método exige a transferência do sobrenadante de um tipo de células, o meio condicionado assim nomeados, às cavidades contendo outra população de células. No entanto, uma desvantagem importante é que as moléculas de vida curta não sobreviver o tempo suficiente no meio condicionado para ser transferida para os poços da segunda população de células. Mesmo moléculas de longa vida será muito diluídas ao longo do tempo devido à difusão. Além disso, tanto celularpopulações só participam na comunicação parácrina unidirecional e não em comunicação bidirecional ativa. Isto conduz à ausência de sinalização de feedback que é vital para recriar relações precisas multicelulares como elas existem in vivo.

Em consequência e motivado pela necessidade para melhor simular o original em condições in vivo no ambiente celular in vitro, a vários avanços nas técnicas de cultura de células foram obtidos ao longo dos anos. Um dos avanços mais significativos foi o uso de suportes permeáveis ​​com membranas microporosas para compartimentar culturas de células, utilizadas pela primeira vez por Grobstein em 1953 ^um. Tais suportes permeáveis ​​foram adaptados ao longo dos anos para acomodar vários tipos de células e para ser utilizada em várias aplicações diferentes. Hoje em dia, estes suportes existem inserções como ocos que são destinadas para descansar em poços de uma placa de cultura de tecido de poços múltiplos ou em circupratos Lar. Em um sistema de co-cultura, a inserção contém um tipo de célula ao passo que o poço ou prato contém a outra população celular, permitindo estudar a contribuição de duas populações diferentes de células no seu meio ambiente humoral (Figura 1). Como resultado, a polaridade celular (basolateral vs secreção apical ou a recepção do sinal) é preservada, conferindo, assim, sistemas de co-cultura inserir uma vantagem importante sobre as culturas mistas e técnicas de meio condicionado. Vários tipos de materiais de membrana estão disponíveis, as mais comuns sendo de poliéster (PET), policarbonato (PC) ou revestidos com colagénio de politetrafluoretileno (PTFE), e existem em diferentes tamanhos de poros variando de 0,4 um a 12,0 um. Estas variedades de materiais e tamanhos de poros oferecer um espectro de inserções exercendo características variáveis ​​relevantes para propriedades ópticas, a espessura da membrana e adesão celular que tornam prático a níveis diferentes para as seguintes utilizações não limitados a:
-estudandoa diferenciação celular, o desenvolvimento embrionário, a metástase tumoral e reparação de feridas por ensaios de quimiotaxia através de membranas permeáveis;
-evaluating penetração da droga, avaliando o seu transporte através de monocamadas epiteliais ou endoteliais cultivadas em suportes permeáveis, e;
-performing celulares co-culturas para analisar modulações comportamento celular induzida por factores solúveis segregadas na ausência de contacto célula-célula.

O objetivo deste artigo é descrever orientações metodológicas gerais para cumprir a terceira função dito acima, que é o de avaliar as alterações celulares mediadas por fatores solúveis secretados na ausência de contato célula-célula usando um sistema de co-cultura de inserção. Vários campos diferentes de pesquisa fazem uso de sistemas de co-cultura de inserção, a fim de responder a questões relevantes para o efeito de fatores solúveis secretados em populações de células. Com efeito, a sinalização parácrina que modula o comportamento celular em vários níveis é pertinente em todos os tecidose dos sistemas, o que torna os sistemas de co-cultura de inserção indispensável para garantir avanços nestes domínios. Por outro lado, a utilização de inserções pode confirmar que a transdução de sinal é por contacto directo célula a célula e não por factores segregados. Uma das utilizações mais importantes de inserções é em estudos de inflamação ^2-14, onde o efeito de citocinas secretadas é avaliada em vários agentes celulares de imunidade. Em particular, o estudo da inflamação no sistema nervoso central (SNC) tem muito lucraram com estudos co-cultura de inserção, que têm permissão para definir melhor os papéis parácrinos distintos de neurônios e microglia na condução neuroinflamação ^15-21. Estes sistemas também foram concebidos para estudar o potencial anti-inflamatório de moléculas que se baseia na sua capacidade de reduzir ou inibir a secreção de factores pró-inflamatórias ^22-26. Investigação referentes ao câncer de ^27-31, em particular os mecanismos subjacentes a angiogênese ^32-34 e inflammatiem ^35-42 na tumorigênese, também se beneficia de sistemas de co-cultura de inserção. Além disso, fatores solúveis são de primordial importância nos processos que impulsionam diferenciação e vários estudos têm usado as inserções para responder às perguntas em que determinado campo de ^43-50. No SNC, visto que o tecido neural tem um potencial de renovação muito limitado, o estudo de neurotrophism e neuroprotecção é fundamental e tem sido amplamente assegurada pela utilização de células estaminais em sistemas de co-cultura de ^51-56. Além disso, inserções também são utilizados em diversos campos como a nefrologia ^57,58, interacções endoteliais e angiogênese ^59-62, apoptose sinalização ^63-65, inflamação na obesidade e síndrome metabólica ^22,23,66-67, ouvido interno protecção das células ciliadas ^68,69, e até mesmo em fungos virulência ^70,71 e parasitologia ^72,73.

Este artigo oferece orientações metodológicas gerais, a fim de criar um experiment, tendo em vista avaliar as alterações celulares mediadas por fatores solúveis secretados usando um sistema de co-cultura de inserção. Em particular, vamos concentrar a nossa atenção em co-culturas de células nervosas e seus usos em estudar processo neuroinflamatória. Dada a muito vasto espectro de experiências que insere tornar possível piloto, é insuportável para cobrir todos os aspectos desta técnica de cultura de células. Como um exemplo, um protocolo específico para medir os efeitos de citocinas secretadas por lipopolissacárido (LPS) -activated microglia N9 em células PC12 neuronais será detalhado, oferecendo uma compreensão concreta da metodologia de co-cultura de inserção.

Protocolo

Nota: Cada um dos seguintes passos devem ser realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar, conforme necessário para a cultura de células de mamífero. Além disso, as orientações gerais para a cultura de células estéril optimizada aplica-se, por exemplo., Descartando dicas qualquer momento que eles podem levar à contaminação cruzada, reduzindo a quantidade de células de tempo são expostos ao ar ao realizar mudanças de suporte inteiras, adequadamente, mas que se agitava suavemente todos suspensões de células para garantir a sua pipetagem homogênea, etc. Além disso, as inserções são uma espécie de plasticware que requerem um tratamento especial. Em primeiro lugar, sempre que as inserções são manipulados, evite tocar a membrana frágil, que rasga facilmente e poderia, portanto, comprometer o experimento. Além disso, não é adequado para realizar a aspiração de vácuo do meio de cultura celular, como existe o risco de perfurar a membrana ou dissociar células aderentes. Em seguida, insere pendurado na placa de cultura de tecido de poços múltiplos e, assim, cuidado deve ser empregue quando MODEIXANDO O utensílios de plástico ou ao pipetar para evitar a dissociação de células aderentes. Além disso, quando utilizando inserções com tamanhos de poros grandes, há uma possibilidade de que o meio de cultura de células se infiltra através da membrana e, por conseguinte, é importante para monitorizar frequentemente o nível de líquido. Finalmente, note que o seguinte protocolo é concebido para células aderentes e requer pequenas modificações, a fim de ser adequado para as células em suspensão.

1. As orientações gerais para a realização de inserção experiências de co-cultura

1. Sementeira tipo de célula # 1 em inserções
   1. Desembrulhar as inserções da sua embalagem.
   2. Coloque as inserções em uma placa de cultura de tecido de poços múltiplos vazios de dimensão adequada. Para fazê-lo, prender a borda superior da inserção utilizando pinças.
   3. Para melhorar o anexo e disseminação de células aderentes, condicionar as inserções com meio de cultura de células antes da semeadura. Para fazer isso, cobrir toda a superfície da membrana de cultura de células com medium utilizando uma micropipeta.
      NOTA: Faça isto para o maior número de inserções, conforme necessário.
   4. Substituir a tampa da placa e incubar durante pelo menos 1 hora ou O / N sob as mesmas condições (normalmente 37 ° C, 5-10% de CO _2).
   5. Quando as inserções são condicionadas, remover todo o meio de cultura de células utilizando uma micropipeta. Descartar o meio utilizado.
   6. Tipo de Semente célula # 1 em meio de cultura celular fresco da mesma maneira como em uma placa com múltiplas cavidades. Para fazê-lo, desenhar um volume apropriado da suspensão de células com uma micropipeta e distribuir o líquido no inserto.
      NOTA: Prepare o maior número de inserções, conforme necessário.
   7. Após semear todas as inserções, agite levemente a placa de esquerda e direita, em seguida, frente e para trás, a fim de distribuir as células uniformemente. Evitar fazer movimentos circulares, como isso vai fazer com que as células que se acumulam no centro das inserções.
   8. Colocar a tampa sobre a placa e incubar, tal como especificado por como por exigências celulares (normalmente 37 ° C, 5-10% de CO _2).
2. Sementeira tipo de célula # 2 em placas de cultura de tecidos com vários poços
   1. tipo de célula semente # 2 em meio de cultura de células frescas de acordo com a Seção 1.
   2. Preparar de muitos poços como necessário para o número de inserções. Balance a placa como no passo 1.1.7) para assegurar que as células estão uniformemente distribuídas nos poços.
   3. Colocar a tampa sobre a placa e incubar sob as mesmas condições (normalmente 37 ° C, 5-10% de CO _2).
3. meio refrescante na inserções
   1. Usando uma micropipeta, remover parte ou a totalidade do meio de cultura celular, em que contêm as inserções tipo de célula # 1. Descartar o meio utilizado.
   2. Desenhar um volume apropriado de meio de cultura de células fresco. Suavemente descansar a ponta sobre a parede interna da inserção e lentamente dispensar o meio de cultura celular.
   3. Colocar a tampa sobre a placa e incuba-se de acordo com o passo 1.1.4.
4. meio refrescante em placas de cultura de tecidos com vários poços
   1. Usando um micropipette, remover parte ou a totalidade do meio de cultura de células nos poços contendo tipo de célula # 2. Descartar o meio utilizado.
   2. Desenhar um volume apropriado de meio de cultura de células fresco. Colocar a ponta na parede interior do poço e lentamente dispensar o meio de cultura celular.
   3. Colocar a tampa sobre a placa e incuba-se de acordo com protocolos de cultura de células previamente estabelecidos.
5. Transferência de inserções contendo tipo de célula # 1 a placas de cultura de tecidos de múltiplos poços contendo tipo de célula # 2.
   NOTA: Execute esta etapa, quando ambos os tipos de células atingiram a fase de crescimento adequado.
   1. Antes de transferir os insertos em poços, fazer quaisquer alterações médias necessárias, como anteriormente descrito nas etapas 1.3 e 1.4)).
      NOTA: Neste ponto, é importante para dispensar os volumes apropriados de meios de comunicação em ambos os compartimentos, tal como especificado por instruções do fabricante da pastilha.
   2. Com uma pinça, segure a extremidade superior de uma inserção contendo células TYpê # 1 e gentilmente colocá-lo no apropriado poço contendo tipo de célula 2 #.
   3. Depois de transferir todas as inserções, verificar a presença de bolhas de ar abaixo da membrana de inserções.
      NOTA: As bolhas de ar evitar um intercâmbio entre a membrana da peça inserta e pode pôr em perigo todo o experimento.
   4. Se bolhas de ar estão presentes, muito delicadamente levantar a inserção do poço usando uma pinça e mergulhar de volta para o meio de cultura celular. As bolhas vão desaparecer. Se eles ainda estão presentes, tente suavemente mergulhando pastilhas de volta para o meio de cultura de células em um ângulo.
      NOTA: Não bata ou mexa inserções para evitar dissociar as células aderentes.
   5. Depois de remover todas as bolhas de ar e a verificação de que os volumes de meios de comunicação em ambos os compartimentos, coloque a tampa sobre a placa e incubar.
6. media refrescantes em um sistema de co-cultura
   NOTA: Embora a membrana permite fácil troca de mídia entre inserção e bem, refrescando o meio é feito emambos os compartimentos desde o tempo necessário para atingir o equilíbrio nos compartimentos superior e inferior por difusão por si só pode ser bastante longo.
   1. meio refrescante em pastilhas contendo tipo de célula # 1 é feito da mesma maneira como no passo 1.3).
   2. Para atualizar meio em poços contendo tipo de célula # 2, deslize suavemente a inserção para o lado para criar um espaço grande o suficiente para acomodar uma ponteira. Refrescar o meio como no passo 1.4).
   3. Verificar a presença de bolhas de ar e verificar os volumes como por etapas 1.5.3), através 1.5.5).

2. Exemplo: medir os efeitos das citocinas secretadas pela microglia N9 LPS-ativados nas células neuronais PC12

NOTA: Os passos seguintes são projetados para balão específico, bem e tamanhos de prato. No entanto, o protocolo pode ser personalizado para quaisquer dimensões plasticware. Para a mídia e composição ver Tabela Materiais.

1. Semeadura e diferenciação de células PC12 em múltiplosse placas de cultura de tecidos
   1. meio de cultura de células PC12 rotina de aquecimento, a diferenciação de PC12 e meio tripsina-EDTA em um banho de água a 37 ° C.
   2. Use células PC12 a 60-80% de confluência de um balão de ² 75 centímetros.
   3. Com uma pipeta de Pasteur a 15 mm, realizar a aspiração de vácuo de todo o meio de cultura celular no balão.
   4. Lave a monocamada de células com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril e remover o líquido com uma pipeta de Pasteur. Tenha cuidado para não dissociar as células nesta etapa.
   5. Cobrir a monocamada de células com 3 ml de tripsina-EDTA e incubar durante 2-3 min a 37 ° C.
   6. Certifique-se de que todas as células são separadas sob um microscópio. Se muito poucas células estão flutuando, incubar por um período mais longo para um máximo de 5 min.
   7. Adicionam-se 10 ml de meio de cultura de células PC12 de rotina, a fim de inactivar a tripsina-EDTA.
   8. Com uma pipeta de 10 ml, triturar suavemente ao se certificar de que a maioria das células são dissociadas do fundo of o balão. Evitar a criação de bolhas de ar na suspensão de células.
   9. Com a mesma 10 ml de pipeta, transferir a suspensão celular num tubo de centrifugação de 50 ml.
   10. Centrifugar por 1 min a 3.200 xg
   11. Descartar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, tendo o cuidado para não perturbar o sedimento.
   12. Adicionam-se 10 ml de meio de cultura de células PC12 rotina com uma pipeta de 10 mL.
       NOTA: Este volume pode ser ajustado se o pellet é extraordinariamente pequeno ou grande.
   13. Tritura-se com a mesma pipeta de 10 ml para homogeneizar o sedimento. As células PC12, muitas vezes se aglutinarem assim, pelo menos 20 pipetando para cima e downare necessário.
       NOTA: Enquanto trituração vigorosa é necessário, evitar a criação de bolhas de ar na suspensão de células.
   14. Em um tubo de 1,5 ml, preparação de uma diluição apropriada da suspensão de células em azul de tripano. Contar as células utilizando um hemocitómetro de acordo com protocolos previamente estabelecidos ^74.
   15. Num tubo separado de 50 ml, dividir a suspensão de célulascom meio de diferenciação de PC12 para se obter uma suspensão de células diluída apropriada para semear poços de uma placa de 24 poços (30000 ¢ / ^cm2, 0,6 ml por poço de acordo com o protocolo do fabricante).
       NOTA: A placa de 24 poços devem ser previamente revestida com colagénio tal como especificado por protocolos previamente estabelecidos ^75.
   16. Distribuir 0,6 ml da suspensão de células por poço usando uma micropipeta.
   17. Quando todos os poços são semeadas, balance a placa como no passo 1.1.7).
   18. Para permitir a diferenciação de células PC12 adequada, incubar as placas de 24 poços durante 7-9 dias a 37 ° C numa atmosfera de _CO2 a 5% húmida em meio de diferenciação de PC12 ^15,16 antes de realizar as experiências de co-cultura.
   19. Realizar as mudanças de meio a cada dois dias, removendo metade do líquido e substituindo-o com um volume igual de meio de diferenciação de PC12 fresco.
2. Sementeira microglia N9 nas inserções e tratamento com LPS
   1. Um dia antes de realizar os experimentos de co-cultura, pré-tratamento de PTFE de 0,4 mm inserções de poros com meio de cultura celular N9 rotina para otimizar a adesão celular, seguindo os passos 1.1.1), através 1.1.4)
   2. meio quente N9 rotina de cultura de células e de tripsina-EDTA em um banho de água a 37 ° C.
   3. Entretanto, pesar aproximadamente 10 mg de LPS em um tubo de 1,5 ml para uso posterior.
      NOTA: Desde LPS é um potente endotoxina pró-inflamatório e exige precauções especiais de segurança, óculos, luvas, e um respirador particulado são fortemente recomendados.
   4. Use células N9 a 80-90% de confluência de um balão de ² 75 centímetros.
   5. Siga os passos 2.1.3) para 2.1.14). Sempre use meio de cultura celular N9 rotina em vez de meio de cultura de células PC12 rotina. Observe também que microglia N9 não se agregam tanto quanto células PC12 fazer, então menos pipetagem cima e para baixo pode ser necessário no passo 2.1.13).
   6. Num tubo separado de 50 ml, dividir a suspensão de células com meio de cultura de células para o N9btain uma suspensão diluída de células apropriada para semear inserções destinadas a reter em placas de 24 poços (60.000 ¢ / cm ^2, 0,05 ml por inserção de acordo com o protocolo do fabricante, para a área de superfície da membrana ver informação do fabricante).
      Nota: Estas inserções já são revestidos com colagénio pelo fabricante e são otimizados para adesão celular.
   7. Distribuir 0,05 ml da suspensão de células por pastilha utilizando uma micropipeta.
   8. Quando todas as inserções são semeadas, balance a placa como no passo 1.1.7).
   9. Efectuar diluições em série de LPS com o meio de tratamento para obter N9 4 ug / mL, 2 ug / ml e 1 ug / ml de soluções de trabalho.
   10. Pipetar 0,05 ml do / ml Solução de trabalho de 4 ug de um conjunto de inserções, a fim de se obter uma diluição final de 2 ug / ml.
   11. Repetir o passo 2.2.10) para as outras duas soluções de trabalho em diferentes conjuntos de inserções, obtendo-se diluições finais de 1 ug / mL e 0,5 ug / ml, respectivamente.
   12. DentroCubate as placas contendo as inserções de 24 h a 37 ° C numa atmosfera de _CO2 a 5% de humidade para permitir a activação da microglia N9 com LPS antes de realizar as experiências de co-cultura.
3. Co-cultura de células neuronais PC12 com microglia N9
   1. Em 7-9 dias de diferenciação de células PC12, ativar as microglia N9 Após 24 horas de incubação com LPS por meio de tratamento N9 quente e meio de tratamento PC12 em um banho de água a 37 ° C.
   2. Realizar uma mudança médio total para microglia N9 como no passo 1.3), a substituição de todo o meio utilizado por 0,1 ml de meio de tratamento N9. Faça isso para cada insert.This é necessário remover todos os vestígios de LPS, deixando microglia N9 única ativadas nas inserções.
   3. Realizar uma mudança médio total para células PC12 neuronais como no passo 1.4). Transferir os insertos em placas de 24 poços como no passo 1.5) .Incubate o N9-PC12 co-culturas durante 24 h ou 48 h a 37 ° C numa atmosfera de _CO2 a 5% de humidade.
   4. Depois de 24h ou 48 h, a colheita do sobrenadante e / ou as células quanto à citotoxicidade, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), transferência de Western ou outros ensaios.

Resultados

O uso de sistemas de co-cultura de inserção é particularmente pertinente no estudo de processos neuroinflamat�ios que mostram relações parácrinos entre diferentes jogadores celulares do CNS. Imunidade no SNC é realizado principalmente por células residentes chamadas microglia que monitoram seu ambiente em seu estado de repouso ramificada (Figura 2A) e são capazes de distúrbios sentindo que poderia incomodar a homeostase muito precioso necessário para a fu...

Discussão

O passo mais crítico de toda a experiência do sistema de co-cultura inserção realmente habita em escolher a inserção correta de usar. O tamanho dos poros e material de membrana tem de ser tida em conta completa, sem deixar de considerar o tipo de células que irão ser semeadas e o objectivo da experiência. Por exemplo, ensaios de quimiotaxia podem utilizar o mesmo tipo de membrana de co-culturas de células para analisar modulações comportamento celular induzida por factores solúveis segregadas na ausência d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	Sigma	R8755	Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Sigma	D6421	Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serum	ATCC	30-2040	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum	MultiCell	80350	Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland	Sigma	N0513	Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924	Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5	Sigma	L2880	Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well plates	BD Falcon	353095	0.4 μm pores
24-well plates	TrueLine	TR5002	Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture medium			Routine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium			-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum			-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation medium			N9 treatment medium
-        99% RPMI medium			-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum			-       1% heat-inactivated fetal bovine serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum