JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Аннотация

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

Введение

Изучение тканей, органов или систем в пробирке является попыткой упростить очень сложные отношения , существующие между несколькими сотовыми подтипов , которые включают многоклеточные организмы. Действительно, в пробирке исследования позволяют получить детальное представление о популяции отдельных клеток. Есть два основных преимущества проведения в лабораторных экспериментах: 1) уменьшение клеточных взаимодействий, и 2) способность легко манипулировать клеточной среде. Таким образом, эти два преимущества позволили ученым предсказать поведение конкретных типов клеток в живом организме , что приводит к способности регулировать результаты внешних влияний в целых организмах. В этом смысле, в пробирке культуры клеток часто работает в качестве моста , соединяющего фундаментальных и прикладных наук о жизни. Тем не менее, есть и несколько недостатков работы в лабораторных условиях , наиболее важным из них в том , что определенная оговорка может пребывать в физиологическомаль значимость наблюдаемых фенотипов. В самом деле, когда один тип клеток выращивают в сосуде, культура теряет, в разной степени, его межклеточные соединения с другими типами клеток, его вклад в гуморальной среде из ткани и организма происхождения, а также якорей в пределах ткани, что позволило ему поддерживать определенную трехмерную структуру, иногда решающее значение для функции клеток.

Вопрос о межклеточных отношений была решена развитием смешанных методов культуры. В этом способе две или более клеточных популяций выращивают вместе в той же культурального сосуда. Тем не менее, эти смешанные культуры несут важные неудобства. С одной стороны, некоторые клеточные подтипы физически не взаимодействуют друг с другом в ткани происхождения и полагаться только на паракриновых связи понесенных секретируемых растворимых факторов и соседних рецепторов. Это случай для нескольких воспалительных процессов, которые зависят от проксимального сигнализации цитокина. В смешанном Cultures, физические взаимодействия неизбежны и сделать невозможным изучение паракринной связи в отсутствие межклеточных контактов, которые могут дать измененные результаты. С другой стороны, достижение клеточно-специфической интерпретации внутри смешанной популяции становится невозможным без использования жестких методов разделения, которые могут существенно повлиять на результаты.

Для решения этих важных вопросов, использование кондиционированной среды была разработана в качестве метода, позволяющего для разобщенным культур и изучения паракринной сигнализации. Этот метод требует передачи супернатанта одного типа клеток, так назвали кондиционированной среды, в лунки, содержащие другую популяцию клеток. Тем не менее, существенным недостатком является то, что короткоживущие молекулы не достаточно долго, в кондиционированной среде, чтобы быть переданы в лунки второго популяции клеток. Даже долгоживущие молекулы будут сильно разбавленный с течением времени за счет диффузии. Кроме того, обе ячейкинаселения участвуют только в одном направлении паракринному коммуникации, а не в активной двунаправленной связи. Это приводит к отсутствию сигналов обратной связи , которая имеет жизненно важное значение в воссоздании точных многоклеточные отношения , как они существуют в естественных условиях.

Как следствие , и движимый необходимостью лучше имитировать оригинал в условиях естественных условиях в клеточной среде в пробирке, несколько методов достижения в области клеточных культур были достигнуты на протяжении многих лет. Одним из наиболее значительных достижений было использование проницаемых штативов с микропористых мембран для compartmentalizing клеточных культур, используемых в первый раз по Grobstein в 1953 году 1. Такие проницаемые опоры были адаптированы на протяжении многих лет для размещения многочисленных типов клеток , и которые будут использоваться в нескольких различных приложений. В настоящее время, эти опоры существуют в виде полых вставок, которые предназначены для отдыха в скважинах из тканевой культуры пластины многоямного или в CircuLAR блюда. В системе со-культуры, вставка содержит один тип клеток , тогда как колодец или блюдо содержит другой клеточной популяции, что позволяет изучать вклад двух различных популяций клеток на их гуморального среды (рисунок 1). В результате, клеточная полярность (базолатеральная против апикальной секреции или приема сигнала) сохраняется, таким образом, присвоение Systems вставки сокультуре важное преимущество перед смешанных культур и кондиционированную среду методов. Несколько типов мембранных материалов доступны, наиболее распространенными из которых являются полиэстер (PET), поликарбонат (PC) или коллаген покрытием из политетрафторэтилена (PTFE), и они существуют в различных размеров пор в диапазоне от 0,4 мкм до 12,0 мкм. Эти разновидности материалов и размеров пор предлагают спектр вставок воздействует переменным функции, имеющие отношение к оптическим свойствам, толщины мембраны и присоединение клеток, которые делают их практичными на различных уровнях для следующих видов применения, не ограничиваясь ими:
-studyingклеточной дифференцировки, эмбриональное развитие, метастазирование опухолей и заживлении ран путем хемотоксических анализов через проницаемые мембраны;
-evaluating проникновения наркотиков путем оценки их переноса через эпителиальные или эндотелиальные монослои культивировали на проницаемые опорах, и;
-performing клеточные сокультурах для анализа модуляций поведение клеток, индуцированные секретируемых растворимых факторов, в отсутствии межклеточного контакта.

Цель данной статьи состоит в том, чтобы описать общие методические указания для выполнения третьей функции указанной выше, то есть оценить клеточные изменения, опосредованные секретируемых растворимых факторов при отсутствии межклеточного контакта, используя систему вставки совместного культивирования. Несколько различных направления исследований, систем использования вставки совместно культуры для того, чтобы ответить на вопросы, относящиеся к действию секретируемых растворимых факторов на популяции клеток. Действительно, паракринная сигнализации, который модулирует клеточный поведение на различных уровнях уместен во всех тканяхи систем, что делает вставки системы совместного культивирования незаменим для обеспечения прогресса в этих областях. С другой стороны, использование вставок может подтвердить, что преобразование сигналов является прямым контактом межклеточной и не секретируемых факторов. Одним из наиболее важных областей применения вставок в исследованиях воспаления 2-14 , где эффект секретируемых цитокинов оценивается в различных клеточных игроков иммунитета. В частности, исследование воспаления в центральной нервной системе (ЦНС) значительно выгоду от исследований вставки совместно культуры, которые позволили более четкому определению различных паракринной роли нейронов и микроглии в вождении нейровоспаления 15-21. Эти системы были разработаны также изучить противовоспалительный потенциал молекул , который зависит от их способности снижать или ингибировать секрецию провоспалительных факторов 22-26. Исследования , относящиеся к раку 27-31, в частности , механизмы , лежащие в основе ангиогенез 32-34 и inflammatiна 35-42 в онкогенеза, также извлекает выгоду из систем вставки совместного культивирования. Кроме того, растворимые факторы имеют первостепенное значение в процессах , которые управляют дифференцировка и несколько исследований использовали вставки , чтобы ответить на вопросы в этой конкретной области 43-50. В ЦНС, видя , как нервная ткань имеет очень ограниченный потенциал обновления, изучение neurotrophism и нейропротекции является фундаментальным и широко обеспечивается за счет использования стволовых клеток в системах совместного культивирования 51-56. Кроме того, вставки также используются в качестве различных областях , как нефрологии 57,58, эндотелиальных взаимодействий и ангиогенеза 59-62, 63-65 апоптоз сигнализации, воспаление ожирения и метаболического синдрома 22,23,66-67, внутреннего уха защиты волосковых клеток 68,69, и даже в вирулентности гриба 70,71 и 72,73 паразитологии.

В данной статье общие методические указания для того, чтобы создать experimлор ввиду оценки клеточных изменений, опосредованных секретируемых растворимых факторов, с использованием системы вставки сокультивирования. В частности, мы сосредоточим наше внимание на нервных клеток со-культур и их использования в учебном процессе нейрогенный. С учетом весьма обширный спектр экспериментов, которые вставляет позволяют пилоту, это невыносимо, чтобы охватить все аспекты этого метода клеточной культуры. В качестве примера, конкретный протокол для измерения эффектов цитокинов, секретируемых липополисахарида (LPS) -активированную N9 микроглии на нейрональных клетках РС12 будут подробно, предлагая конкретное понимание методологии вставки сокультуры.

протокол

Примечание: В каждом из следующих шагов должны быть выполнены в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха, как требуется для культуры клеток млекопитающих. Кроме того, общие принципы для оптимального выращивания стерильной клетки применяются, например., Отбрасывая Подсказок в любое время они могут привести к перекрестному загрязнению, уменьшая количество времени клетки подвергаются воздействию воздуха при выполнении целые смены носителя, должным образом, но аккуратно помешивая все клеточные суспензии, чтобы обеспечить их гомогенное пипетирования и т.д. Кроме того, вставки являются своего рода, которые требуют Пластик специальной обработки. Во-первых, всякий раз, когда вставки манипулируют, не касаясь хрупкой мембраны, которая легко рвется и, следовательно, может поставить под угрозу эксперимент. Кроме того, он не подходит для выполнения вакуум-аспирации среды культуры клеток, так как существует риск перфорации мембраны или диссоциирует прилипшие клетки. Затем вставки провисать в культуре ткани пластины многоямного и, таким образом, осторожность должна быть использована, когда моВинг в или когда из пластмассы пипеткой, чтобы избежать отделяя прилипшие клетки. Кроме того, при использовании пластин с большими размерами пор, существует вероятность того, что среда для культивирования клеток просачивается через мембрану и, следовательно, важно, чтобы часто контролировать уровень жидкости. Наконец, следует отметить, что следующий протокол предназначен для адгезивных клеток и требует незначительных модификаций для того, чтобы быть пригодным для суспензии клеток.

1. Общие рекомендации по проведению экспериментов вставки совместного культивирования

  1. Посев тип клеток # 1 в вкладышами
    1. Берем вставки из упаковки.
    2. Поместите вставки в пустой многоямного тканевой культуральной пластины нужного размера. Чтобы сделать это, сцепление верхний край вставки с помощью пинцета.
    3. Для того, чтобы улучшить прикрепление и распространение адгезивных клеток, состояние вставки с клеточной культуральной среды перед посевом. Для этого, покрывают всю поверхность мембраны с клеточной культуры mediuм с помощью микропипетки.
      Примечание: Делайте это столько вставок по мере необходимости.
    4. Установите крышку на тарелку и инкубировать в течение по меньшей мере 1 ч , или O / N в тех же условиях (обычно 37 ° C, 5-10% СО 2).
    5. Когда вкладыши кондиционируют, удалить все клеточной культуральной среды с использованием микропипетки. Утилизировать отработанное среду.
    6. Семенной тип клеток # 1 в свежей среде для культивирования клеток таким же образом, как в многоямного пластине. Для этого нарисуйте соответствующий объем клеточной суспензии с помощью микропипетки и дозирования жидкости во вставке.
      Примечание: Готовят много вставок по мере необходимости.
    7. После засева все вставки, осторожно встряхните пластину влево и вправо, а затем назад и вперед для того, чтобы равномерно распределить клетки. Избегайте круговых движений, так как это приведет к тому, клетки накапливаются в центре вставок.
    8. Поместите крышку на тарелку и инкубировать, как определено в соответствии с требованиями сотовой связи (обычно 37 ° С, 5-10% СО 2).
  2. Посев тип клеток # 2 в многоямный культуре ткани пластин
    1. Семенной тип клеток # 2 в свежей среде для культивирования клеток в соответствии с разделом 1.
    2. Подготовьте столько скважин в соответствии с требованиями для числа вставок. Рок пластины, как на этапе 1.1.7), чтобы гарантировать, что клетки равномерно распределены в скважинах.
    3. Поместите крышку на тарелку и инкубировать при тех же самых условиях (обычно 37 ° C, 5-10% СО 2).
  3. Освежающий средних вставок
    1. С помощью микропипетки, удалить часть или всю среду для культивирования клеток, во вставках, содержащих типа клеток # 1. Утилизировать отработанное среду.
    2. Draw соответствующий объем свежей среды для культивирования клеток. Осторожно отдохнуть кончик на внутренней стенке вставки и медленно дозировать среду для культивирования клеток.
    3. Поместите крышку на тарелку и инкубировать в соответствии с шагом 1.1.4.
  4. Освежающий среда в многоямный культуре ткани пластин
    1. Использование micropiPette, удалить часть или всю среду для культивирования клеток в лунках, содержащих типа клеток # 2. Утилизировать отработанное среду.
    2. Draw соответствующий объем свежей среды для культивирования клеток. Подведите наконечник на внутренней стенке колодца и медленно дозировать среду для культивирования клеток.
    3. Поместите крышку на тарелку и инкубировать в соответствии с ранее установленными протоколами клеточных культур.
  5. Перенос вставок, содержащих тип клеток # 1 в культуральных планшетах, содержащих луночные типа клеток # 2.
    Примечание: Выполните этот шаг, когда оба типа клеток достигли соответствующего этапа роста.
    1. До переноса вставки в лунки, внесите необходимые изменения средних, как описано выше в пунктах 1.3) и 1.4).
      Примечание: В этот момент очень важно распределить соответствующие объемы информации в обоих отсеках, как указано в инструкции производителя вставить в.
    2. С помощью пинцета, захватывают верхний край вставки, содержащей Т-клетокYpe # 1 и аккуратно поместите его в соответствующем лунку, содержащую тип клеток 2 #.
    3. После переноса всех вставок, проверить на наличие пузырьков воздуха под мембраной вставок.
      Примечание: Воздушные пузырьки предотвращают любой обмен через мембрану вставки и может поставить под угрозу весь эксперимент.
    4. Если воздушные пузырьки присутствуют, очень осторожно поднимите вставку из скважины с использованием пинцета и погрузить обратно в среду для культивирования клеток. Пузырьки исчезнет. Если они все еще присутствуют, попробуйте пологие вставки обратно в среду для культивирования клеток под углом.
      Примечание: Не стучите или размешать вставки, чтобы избежать отделяя прилипшие клетки.
    5. После удаления всех пузырьков воздуха и проверяя, что объемы средств массовой информации в обоих отсеках, поместите крышку на тарелку и инкубировать.
  6. Освежающие средства массовой информации в системе сокультуры
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, мембрана легко позволяет обмен медиа между вставкой и хорошо, освежающий среды осуществляется вобе камеры с того времени, необходимого для достижения равновесия в верхних и нижних отсеков путем диффузии в одиночку может быть довольно долго.
    1. Освежающие среда в вставок, содержащих типа клеток # 1 выполняется таким же образом, как на шаге 1.3).
    2. Для обновления среды в лунках, содержащих тип клеток # 2, аккуратно сдвиньте вставку в сторону, чтобы создать пространство, достаточно широкий, чтобы приспособить кончик пипетки. Обновите среду как на стадии 1.4).
    3. Проверьте наличие пузырьков воздуха и проверки тома, как в соответствии с пунктами 1.5.3) через 1.5.5).

2. Пример: измерения эффектов цитокинов , секретируемых ЛПС-активированных N9 микроглии на нейрональных клетках PC12

Примечание: Следующие шаги предназначены для конкретной колбы, ну и блюдо размеров. Тем не менее, протокол может быть настроен для любых размеров из пластмассы. Для получения информации и композиции см Материалы табл.

  1. Посев и дифференциации клеток РС12 в мультилуночные планшеты для культур тканей
    1. Теплый рутина РС12 среда для культивирования клеток, дифференцировка РС12 среда и трипсин-ЭДТА в водяной бане при 37 ° C.
    2. Используйте РС12 клетки при 60-80% слияния от 75 см 2 колбу.
    3. С 15 мм пипеткой Пастера, выполняют вакуум-аспирации всей клеточной культуральной среды в колбе.
    4. Осторожно полоскать клеточный монослой с 5 мл стерильного фосфатно-буферного раствора и удалить жидкость с помощью пипетки Пастера. Будьте осторожны, чтобы не диссоциируют клетки на этом этапе.
    5. Накройте клеточный монослой 3 мл трипсин-ЭДТА и инкубировать в течение 2-3 мин при температуре 37 ° С.
    6. Убедитесь, что все клетки отделяют под микроскопом. Если очень мало клеток плывут, инкубировать в течение более длительного периода в течение не более 5 мин.
    7. Добавьте 10 мл обычной культуральной среды клеток РС12 с целью инактивации трипсина-EDTA.
    8. С 10 мл пипетки, осторожно растирают в то время, убедившись, что большинство клеток диссоциируют от дна Oе колбы. Избегайте создания пузырьков воздуха в суспензии клеток.
    9. С помощью той же 10 мл пипетки, передачи клеточной суспензии в центрифужную пробирку на 50 мл.
    10. Центрифуга в течение 1 мин при 3200 XG
    11. Удалите супернатант с помощью пипетки Пастера, заботясь, чтобы не нарушить осадок.
    12. Добавьте 10 мл рутинного РС12 среды для культивирования клеток с 10 мл пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем может быть скорректирована, если осадок необычно маленький или большой.
    13. Растирают с тем же 10 мл пипетки для гомогенизации осадок. РС12 клетки часто слипаются так, по крайней мере, 20 пипеткой и downare необходимо.
      Примечание: В то время как энергичные растирания необходимо, во избежание образования пузырьков воздуха в суспензии клеток.
    14. В 1,5 мл пробирку, готовят соответствующее разбавление суспензии клеток в трипановым синим. Граф клеток с использованием гемоцитометра в соответствии с ранее установленными протоколами 74.
    15. В отдельную 50 мл пробирку, разделить клеточную суспензиюс PC12 дифференциации среды для получения разбавленного клеточной суспензии , подходящие для высева скважин из 24-луночного планшета (30000 ¢ / см 2, 0,6 мл на лунку в соответствии с протоколом производителя).
      Примечание: Пластина 24-скважина должна быть предварительно покрыты коллагена , как определено ранее установленными протоколами 75.
    16. Распределить 0,6 мл клеточной суспензии на лунку с помощью микропипетки.
    17. Когда все лунки высевают, раскачивать пластинку как на этапе 1.1.7).
    18. Для того, чтобы позволить правильной дифференциации РС12 клеток, инкубировать 24-луночных планшетах в течение 7-9 дней при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в атмосфере влажного PC12 дифференцировки среды 15,16 перед проведением экспериментов с совместным культивированием.
    19. Выполнение среды изменяется каждый день, удаляя половину жидкости и заменить ее с равным объемом свежей РС12 дифференциации среды.
  2. Посев N9 микроглии во вставках и лечения с LPS
    1. За один день до проведения экспериментов совместного культивирования, предварительно обработать ПТФЭ 0,4 мкм порами вставки с обычной N9 среды для культивирования клеток с целью оптимизации присоединения клеток, следующие шаги 1.1.1) через 1.1.4)
    2. Теплый рутина среда для культивирования клеток Н9 и трипсин-ЭДТА в водяной бане при 37 ° C.
    3. В то же время, весит примерно 10 мг LPS в 1,5 мл трубки для последующего использования.
      Примечание: Так как LPS является мощным провоспалительных эндотоксина и требует особых мер предосторожности, очки, перчатки и респиратор в виде частиц настоятельно рекомендуется.
    4. Используйте клетки N9 на 80-90% слияния от 75 см 2 колбу.
    5. Выполните шаги 2.1.3) до 2.1.14). Всегда используйте обычную N9 среда для культивирования клеток вместо рутинной культуральной среды РС12 клеток. Также отметим, что N9 микроглии не слипаются столько, сколько делают РС12 клетки, поэтому меньше пипетированием вверх и вниз могут быть необходимы на этапе 2.1.13).
    6. В отдельную 50 мл пробирку, разделить клеточную суспензию с N9 клеточной культуральной среды к оbtain разбавленной суспензии клеток , пригодных для высева вставок , предназначенных для хранения в 24-луночные планшеты (60000 ¢ / см 2, 0,05 мл на вставку в соответствии с протоколом производителя, по площади поверхности мембраны см информацию производителя).
      Примечание: Эти вставки уже покрывают коллагеном производителем и оптимизированы для клеточной адгезии.
    7. Распределить 0,05 мл суспензии клеток на вставку с помощью микропипетки.
    8. Когда все вставки высевают, рок-пластинку как на этапе 1.1.7).
    9. Выполните серийные разведения с использованием LPS N9 среды обработки для получения 4 мкг / мл, 2 мкг / мл и / мл рабочих растворов 1 мкг.
    10. Пипетка 0,05 мл 4 мкг / мл рабочего раствора в одном множество вставок в того, чтобы получить окончательное разбавление 2 мкг / мл.
    11. Повторите шаг 2.2.10) для двух других рабочих растворов в различных комплектов вкладышей, получая конечные разведения 1 мкг / мл и 0,5 мкг / мл соответственно.
    12. Вcubate пластины , содержащие вставки в течение 24 ч при 37 ° С в 5% CO 2 во влажной атмосфере , чтобы позволить N9 активацию микроглии с LPS перед проведением экспериментов с совместным культивированием.
  3. Совместное культивирование нервных клеток РС12 с N9 микроглии
    1. На 7-9 дней дифференциации РС12 клеток, активации микроглии N9 через 24 часа инкубации с LPS теплой N9 обрабатывающей среды и среды обработки РС12 в водяной бане при 37 ° C.
    2. Произвести полную среднюю изменения для N9 микроглии, как в шаге 1.3), заменив всю используемую среду на 0,1 мл среды обработки N9. Сделайте это для каждого insert.This необходимо удалить все следы LPS, оставив только активированные микроглии N9 в вставок.
    3. Произвести полную среднюю изменения для нейрональных клеток РС12 как на этапе 1.4). Перенесите вставки в 24-луночных планшетах , как на стадии 1.5) .Incubate с Н9-РС12 совместное культивирование в течение 24 ч или 48 ч при 37 ° С в 5% CO 2 во влажной атмосфере.
    4. После того, как 24ч или 48 ч, собирают супернатант и / или клетки на цитотоксичность, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), Вестерн-блот или другие анализы.

Результаты

Использование вставных систем совместного культивирования особенно актуально при изучении нейровоспалительных процессов, которые наглядно демонстрируют паракринной взаимосвязи между различными сотовыми игроками центральной нервной системы. Иммунитет в ЦНС осущ...

Обсуждение

Самым важным шагом любой системы эксперимента вставка сокультуры на самом деле живет в выборе правильной вставки для использования. Размер пор и материал мембраны должен быть принят во внимание тщательной, не забывая учитывать тип клеток, которые будут посеяны и цель эксперимента. На?...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

This work was funded by a Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada grant to MGM. JR is a NSERC-Vanier student fellow.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI-1640 mediumSigmaR8755Warm in 37 °C water bath before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 HamSigmaD6421Warm in 37 °C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine
Horse serumATCC30-2040Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serumMultiCell80350Warm in 37 °C water bath before use
Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary glandSigmaN0513Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1–1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924Warm in 37 °C water bath before use
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5SigmaL2880Toxic
Cell culture inserts for use with 24-well platesBD Falcon3530950.4 μm pores
24-well platesTrueLineTR5002Coat with collagen before use
Routine PC12 cell culture mediumRoutine N9 cell culture medium
-       85% RPMI medium-       90% DMEM-F12 medium
-       10% heat-inactivated horse serum-       10% heat-inactivated horse serum
-       5% heat-inactivated fetal bovine serum
PC12 differentiation mediumN9 treatment medium
-        99% RPMI medium-       99% DMEM-F12 medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum-       1% heat-inactivated fetal bovine serum
-        50 ng/mL nerve growth factor
PC12 treatment medium
-        99% RPMI medium
-        1% heat-inactivated fetal bovine serum

Ссылки

  1. Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
  2. Hoffman, R. A. Intraepithelial lymphocytes coinduce nitric oxide synthase in intestinalepithelial cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 278 (6), G886-G894 (2000).
  3. Zhang, W. C., et al. Regulatory T cells protect fine particulate matter-induced inflammatory responses in human umbilical vein endothelial cells. Mediators Inflamm. 2014, 869148 (2014).
  4. Vasileiadou, K., et al. alpha1-Acid glycoprotein production in rat dorsal air pouch in response to inflammatory stimuli, dexamethasone and honey bee venom. Exp. Mol. Pathol. 89 (1), 63-71 (2010).
  5. Talayev, V. Y., et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T cell stimulating ability of dendritics cells in vitro. Clin. Exp. Immunol. 162 (1), 91-99 (2010).
  6. Elishmereni, M., et al. Physical interactions between mast cells and eosinophils: a novel mechanism enhancing eosinophil survival in vitro. Allergy. 66 (3), 376-385 (2011).
  7. Ishihara, Y., et al. Regulation of immunoglobulin G2 production by prostaglandin E(2) and platelet-activating factor. Infect. Immun. 68 (3), 1563-1568 (2000).
  8. Kranzer, K., Bauer, M., Lipford, G. B., Heeg, K., Wagner, H., Lang, R. CpG-oligodeoxynucleotides enhance T-cell receptor-triggered interferon- gamma production and up-regulation of CD69 via induction of antigen- presenting cell-derived interferon type I and interleukin-12. Immunology. 99 (2), 170-178 (2000).
  9. Vendetti, S., Chai, J. G., Dyson, J., Simpson, E., Lombardi, G., Lechler, R. Anergic T cells inhibit the antigen-presenting function of dendritic cells. J. Immunol. 165 (3), 1175-1181 (2000).
  10. Haller, D., Bode, C., Hammes, W. P., Pfeifer, A. M., Schiffrin, E. J., Blum, S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  11. Dono, M., et al. In vitro stimulation of human tonsillar subepithelial B cells: requirement for interaction with activated T cells. Eur. J. Immunol. 31 (3), 752-756 (2001).
  12. Yu, Y., et al. Enhancement of human cord blood CD34+ cell-derived NK cell cytotoxicity by dendritic cells. J. Immunol. 166 (3), 1590-1600 (2001).
  13. Watanabe, T., Tokuyama, S., Yasuda, M., Sasaki, T., Yamamoto, T. Changes of tissue factor-dependent coagulant activity mediated by adhesion between polymorphonuclear leukocytes and endothelial cells. Jpn J. Pharmacol. 86 (4), 399-404 (2001).
  14. Krampera, M., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 101 (9), 3722-3729 (2003).
  15. Bournival, J., Plouffe, M., Renaud, J., Provencher, C., Martinoli, M. G. Quercetin and sesamin protect dopaminergic cells from MPP+-induced neuroinflammation in a microglial (N9)-neuronal (PC12) coculture system. Oxid. Med. Cell. Longev. 2012, 921941 (2012).
  16. Bureau, G., Longpré, F., Martinoli, M. G. Resveratrol and quercetin, two natural polyphenols, reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation. J. Neurosci. Res. 86 (2), 403-410 (2008).
  17. Zhu, L., Bi, W., Lu, D., Zhang, C., Shu, X., Lu, D. Luteolin inhibits SH-SY5Y cell apoptosis through suppression of the nuclear transcription factor-κB, mitogen-activated protein kinase and protein kinase B pathways in lipopolysaccharide-stimulated cocultured BV2 cells. Exp. Ther. Med. 7 (5), 1065-1070 (2014).
  18. Luo, X., et al. BV2 enhanced the neurotrophic functions of mesenchymal stem cells after being stimulated with injured PC12. Neuroimmunomodulation. 16 (1), 28-34 (2009).
  19. Polazzi, E., Gianni, T., Contestabile, A. Microglial cells protect cerebellar granule neurons from apoptosis: evidence for reciprocal signaling. Glia. 36 (3), 271-280 (2001).
  20. Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem. 76 (3), 846-854 (2001).
  21. Zujovic, V., Taupin, V. Use of cocultured cell systems to elucidate chemokine-dependent neuronal/microglial interactions: control of microglial activation. Methods. 29 (4), 345-350 (2003).
  22. Iwashita, M., et al. Valsartan, independently of AT1 receptor or PPARγ, suppresses LPS-induced macrophage activation and improves insulin resistance in cocultured adipocytes. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (3), E286-E296 (2012).
  23. Oliver, E., et al. Docosahexaenoic acid attenuates macrophage-induced inflammation and improves insulin sensitivity in adipocytes-specific differential effects between LC n-3 PUFA. J. Nutr. Biochem. 23 (9), 1192-1200 (2012).
  24. Tang, S. Y., Cheah, I. K., Wang, H., Halliwell, B. Notopterygium forbesii Boiss extract and its active constituent phenethyl ferulate attenuate pro-inflammatory responses to lipopolysaccharide in RAW 264.7 macrophages. A "protective" role for oxidative stress. Chem. Res. Toxicol. 22 (8), 1473-1482 (2009).
  25. De Boer, A. A., Monk, J. M., Robinson, L. E. Docosahexaenoic acid decreases pro-inflammatory mediators in an in vitro murine adipocyte macrophage co-culture model. PLoS One. 9 (1), e85037 (2014).
  26. Li, Y., Liu, L., Barger, S. W., Mrak, R. E., Griffin, W. S. Vitamin E suppression of microglial activation is neuroprotective. J. Neurosci. Res. 66 (2), 163-170 (2001).
  27. Brizuela, L., et al. Osteoblast-derived sphingosine 1-phosphate to induce proliferation and confer resistance to therapeutics to bone metastasis-derived prostate cancer cells. Mol. Oncol. 8 (7), 1181-1195 (2014).
  28. Yuan, L., Chan, G. C., Fung, K. L., Chim, C. S. RANKL expression in myeloma cells is regulated by a network involving RANKL promoter methylation, DNMT1, microRNA and TNFα in the microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 1834-1838 (2014).
  29. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (21), 12072-12077 (2001).
  30. Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E., Jacobs, I. J., Dafou, D., Gayther, S. A. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12 (4), 317-325 (2010).
  31. Liu, J., et al. BCR-ABL mutants spread resistance to non-mutated cells through a paracrine mechanism. Leukemia. 22 (4), 791-799 (2008).
  32. Giuliani, N., et al. Proangiogenic properties of human myeloma cells: production of angiopoietin-1 and its potential relationship to myeloma-induced angiogenesis. Blood. 102 (2), 638-645 (2003).
  33. Gupta, D., et al. Adherence of multiple myeloma cells to bone marrow stromal cells upregulates vascular endothelial growth factor secretion: therapeutic applications. Leukemia. 15 (12), 1950-1961 (2001).
  34. Anderson, I. C., Mari, S. E., Broderick, R. J., Mari, B. P., Shipp, M. A. The angiogenic factor interleukin 8 is induced in non-small cell lung cancer/pulmonary fibroblast cocultures. Cancer Res. 60 (2), 269-272 (2000).
  35. Hoechst, B., et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces C4(+)CD25(+)Foxp3(+) T cells. Gastroenterology. 135 (1), 234-243 (2008).
  36. Karadag, A., Oyajobi, B. O., Apperley, J. F., Russell, R. G., Croucher, P. I. Human myeloma cells promote the production of interleukin 6 by primary human osteoblasts. Br. J. Haematol. 108 (2), 383-390 (2000).
  37. Garrido, S. M., Appelbaum, F. R., Willman, C. L., Banker, D. E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug- induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp. Hematol. 29 (4), 448-457 (2001).
  38. Heissig, B., Pasternak, G., Horner, S., Schwerdtfeger, R., Rossol, S., Hehlmann, R. CD14+ peripheral blood mononuclear cells from chronic myeloid leukemia and normal donors are inhibitory to short- and long-term cultured colony-forming cells. Leuk. Res. 24 (3), 217-231 (2000).
  39. Moore, M. B., Kurago, Z. B., Fullenkamp, C. A., Lutz, C. T. Squamous cell carcinoma cells differentially stimulate NK cell effector functions: the role of IL-18. Cancer Immunol Immunother. 52 (2), 107-115 (2003).
  40. Giuliana, N., et al. Human myeloma cells stimulate the receptor activator of nuclear factor- kappa B ligand (RANKL) in T lymphocytes: a potential role in multiple myeloma bone disease. Blood. 100 (13), 4615-4621 (2002).
  41. Ye, Z., Haley, S., Gee, A. P., Henslee-Downey, P. J., Lamb, L. S. In vitro interactions between gamma deltaT cells, DC, and CD4+ T cells; implications for the immunotherapy of leukemia. Cytotherapy. 4 (3), 293-304 (2002).
  42. Zhang, X. M., Xu, Q. Metastatic melanoma cells escape from immunosurveillance through the novel mechanism of releasing nitric oxide to induce dysfunction of immunocytes. Melanoma Res. 11 (6), 559-567 (2001).
  43. Zhang, M., et al. The differentiation of human adipose-derived stem cells towards a urothelium-like phenotype in vitro and the dynamic temporal changes of related cytokines by both paracrine and autocrine signal regulation. PLoS One. 9 (4), e95583 (2014).
  44. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  45. Krassowska, A., et al. Promotion of haematopoietic activity in embryonic stem cells by the aorta-gonad-mesonephros microenvironment. Exp. Cell. Res. 312 (18), 3595-3603 (2006).
  46. Darcy, K. M., et al. Mammary fibroblasts stimulate growth, alveolar morphogenesis, and functional differentiation of normal rat mammary epithelial cells. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36 (9), 578-592 (2000).
  47. Spector, J. A. Co-culture of osteoblasts with immature dural cells causes an increased rate and degree of osteoblast differentiation. Plast. Reconstr. Surg. 109 (2), 631-642 (2002).
  48. Khanolkar, A., Fu, Z., Underwood, L. J., Bondurant, K. L., Rochford, R., Cannon, M. J. CD4+ T cell-induced differentiation of EBV-transformed lymphoblastoid cells is associated with diminished recognition by EBV-specific CD8+ cytotoxic T cells. J. Immunol. 170 (6), 3187-3194 (2003).
  49. Fritsch, C. Epimorphin expression in intestinal myofibroblasts induces epithelial morphogenesis. J. Clin. Invest. 110 (11), 1629-1641 (2002).
  50. Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohumra, E. Morphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain Res. 1029 (1), 114-119 (2004).
  51. Llado, J., Haenggeli, C., Maragakis, N., Snyder, E., Rothstein, J. Neural stem cells protect against glutamate-induced excitotoxicitiy and promote survival of injured motor neurons through the secretion of neurotrophic factors. Mol. Cell. Neurosci. 27 (3), 322-331 (2004).
  52. Fong, S. P., et al. Trophism of neural progenitor cells to embryonic stem cells: Neural induction and transplantation in a mouse ischemic stroke model. J. Neurosci. Res. 85 (9), 1851-1862 (2007).
  53. Gordon-Keylock, S. A., et al. Induction of hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells by an AGM-derived stromal cell line is not further enhanced by overexpression of HOXB4. Stem Cells. 19 (11), 1687-1698 (2010).
  54. Yang, T., Tsang, K. S., Poon, W. S., Ng, H. K. Neurotrophism of bone marrow stromal cells to embryonic stem cells: noncontact induction and transplantation to a mouse ischemic stroke model. Cell transplant. 18 (4), 391-404 (2009).
  55. Kim, J. Y., et al. Umbilical cord blood mesenchymal stem cells protect amyloid-β42 neurotoxicity via paracrine. World J. Stem Cells. 4 (11), 110-116 (2012).
  56. Mauri, M., et al. Mesenchymal stem cells enhance GABAergic transmission in co-cultured hippocampal neurons. Mol. Cell Neurosci. 49 (4), 395-405 (2012).
  57. Ichikawa, J., et al. Increased crystal-cell interaction in vitro under co-culture of renal tubular cells and adipocytes by in vitro co-culture paracrine systems simulating metabolic syndrome. Urolithiasis. 42 (1), 17-28 (2014).
  58. Zuo, L., et al. A Paracrine mechanism involving renal tubular cells, adipocytes and macrophages promotes kidney stone formation in a simulated metabolic syndrome environment. J. Urol. 191 (6), 1906-1912 (2014).
  59. Fan, W., Zheng, J. J., McLaughlin, B. J. An in vitro model of the back of the eye for studying retinal pigment epithelial-choroidal endothelial interactions. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 38 (4), 228-234 (2002).
  60. Mierke, C. T., Ballmaier, M., Werner, U., Manns, M. P., Welte, K., Bischoff, S. C. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. J. Exp. Med. 192 (6), 801-811 (2000).
  61. Beckner, M. E., Jagannathan, S., Peterson, V. A. Extracellular angio-associated migratory cell protein plays a positive role in angiogenesis and is regulated by astrocytes in coculture. Microvasc. Res. 63 (3), 259-269 (2002).
  62. Damon, D. H. VSM growth is stimulated in sympathetic neuron/VSM cocultures: role of TGF-beta2 and endothelin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278 (2), H404-H411 (2000).
  63. Anna De Berardinis, M., Ciotti, M. T., Amadoro, G., Galli, C., Calissano, P. Transfer of the apoptotic message in sister cultures of cerebellar neurons. Neuroreport. 12 (10), 2137-2140 (2001).
  64. Lange-Sperandio, B., Fulda, S., Vandewalle, A., Chevalier, R. L. Macrophages induce apoptosis in proximal tubule cells. Pediatr. Nephrol. 18 (4), 335-341 (2003).
  65. Vjetrovic, J., Shankaranarayanan, P., Mendoza-Parra, M. A., Gronemeyer, H. Senescence-secreted factors activate Myc and sensitize pretransformed cells to TRAIL-induced apoptosis. Aging Cell. 13 (3), 487-496 (2014).
  66. Fujiya, A., et al. The role of S100B in the interaction between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 371-379 (2014).
  67. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  68. Yoshida, A., Kitajiri, S., Nakagawa, T., Hashido, K., Inaoka, T., Ito, J. Adipose tissue-derived stromal cells protect hair cells from aminoglycoside. Laryngoscope. 121 (6), 1281-1286 (2011).
  69. May, L. A., et al. Inner ear supporting cells protect hair cells by secreting HSP70. J. Clin. Invest. 123 (8), 3577-3587 (2013).
  70. Jarosz, L. M., Deng, D. M., vander Mei, H. C., Crielaard, W., Krom, B. P. Streptococcus mutans competence-stimulating peptide inhibits Candida albicans hypha formation. Eukaryot Cell. 8 (11), 1658-1664 (2009).
  71. Dagenais, T. R., Giles, S. S., Aimanianda, V., Latgé, J. P., Hull, C. M., Keller, N. P. Aspergillus fumigatus LaeA-mediated phagocytosis is associated with a decreased hydrophobin layer. Infect. Immun. 78 (2), 823-829 (2010).
  72. Spiliotis, M., Lechner, S., Tappe, D., Scheller, C., Krohne, G., Brehm, K. Transient transfection of Echinococcus multilocularis primary cells and complete in vitro regeneration of metacestode vesicles. Int. J. Parasitol. 38 (8-9), 1025-1039 (2008).
  73. Scholzen, A., Mittag, D., Rogerson, S. J., Cooke, B. M., Plebanski, M. Plasmodium falciparum-mediated induction of human CD25Foxp3 CD4 T cells is independent of direct TCR stimulation and requires IL-2, IL-10 and TGFbeta. PLoS Pathog. 5 (8), e1000543 (2009).
  74. Fedoroff, S., Richardson, A. Quantification of Cells in Culture. Protocols for Neural Cell Culture. , 333-335 (2001).
  75. Fedoroff, S., Richardson, A. Primary Cultures of Sympathetic Ganglia. Protocols for Neural Cell Culture. , 88-89 (2001).
  76. Kreutzberg, G. W. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 19 (8), 312-318 (1996).
  77. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat. Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  78. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  79. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  80. Qureshi, S. T., Larivière, L., Leveque, G., Clermont, S., Moore, K. J., Gros, P., Malo, D. Endotoxin-tolerant mice have mutations in Toll-like receptor 4 (Tlr4). J. Exp. Med. 189, 615-625 (1999).
  81. Sabroe, I., Jones, E. C., Usher, L. R., Whyte, M. K., Dower, S. K. Toll-like receptor (TLR)2 and TLR4 in human peripheral blood granulocytes: a critical role for monocytes in leukocyte lipopolysaccharide responses. J. Immunol. 168, 4701-4710 (2002).
  82. Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Bio. 4 (5), 278-286 (2008).
  83. Spencer, K. H., Kim, M. Y., Hughes, C. C., Hui, E. E. A screen for short-range paracrine interactions. Integr. Biol. (Camb). 6 (4), 382-387 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

113CoTranswellPC12N9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены