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Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para medir a força das interações entre uma superfície inorgânica bem definida e tanto peptídeos ou aminoácidos por única molécula de medidas de espectroscopia de força utilizando um microscópio de força atômica (AFM). As informações obtidas a partir da medição é importante para entender melhor a interfase material de peptídeo-inorgânico.

Resumo

As interacções entre as proteínas ou péptidos e materiais inorgânicos levar a vários processos interessantes. Por exemplo, combinando proteínas com minerais conduz à formação de materiais compósitos com propriedades únicas. Além disso, o processo de incrustação biológica indesejável é iniciada pela adsorção de biomoléculas, principalmente proteínas, nas superfícies. Esta camada orgânica é uma camada de adesão de bactérias e que lhes permite interagir com a superfície. Compreender as forças fundamentais que governam as interações na interface orgânica-inorgânica, é importante para muitas áreas de pesquisa e poderia levar à concepção de novos materiais para aplicações ópticas, mecânicas e biomédicas. Este artigo demonstra uma técnica de espectroscopia de força única molécula que utiliza um AFM para medir a força de aderência entre ambos péptidos ou aminoácidos e superfícies inorgânicas bem definidas. Esta técnica envolve um protocolo para a fixação da biomolécula a AFMponta através de um ligante flexível covalente e única molécula de medidas de espectroscopia de força por parte microscópio de força atômica. Além disso, uma análise dessas medidas está incluída.

Introdução

A interacção entre as proteínas e minerais inorgânicos conduz à construção de materiais compósitos com propriedades distintivas. Isto inclui materiais com elevada resistência mecânica ou as propriedades ópticas únicas. 1, 2, por exemplo, a combinação da proteína de colagénio com a hidroxiapatite mineral, quer gera ossos moles ou duras para diferentes funcionalidades. 3 péptidos curtos, também podem ligar-se materiais inorgânicos com alta especificidade. 4, 5, 6 A especificidade destes péptidos foi usado para a criação de novos materiais magnéticos e electrónicos, 7, 8, 9 fabricar materiais nanoestruturados, crescimento de cristais, 10 e sintetizar nanopartículas. 11 Para entender o mecanismo subjacente interações entre peptídeos ou proteínas e materiais inorgânicos, portanto, nos permitem projetar novos materiais compósitos com melhores propriedades de adsorção. Além disso, uma vez que a interfase de implantes com uma resposta imunitária é mediada por proteínas, uma melhor compreensão das interacções de proteínas com materiais inorgânicos vai melhorar a nossa capacidade para conceber implantes. Outra área importante, que envolve proteínas que interagem com superfícies inorgânicas é a fabricação de materiais anti-incrustações. 12, 13, 14, 15 A incrustação biológica é um processo em que organismos indesejáveis anexar a uma superfície. Ele tem muitas implicações prejudiciais sobre nossas vidas. Por exemplo, biofouling de bactérias sobre dispositivos médicos leva a infecções hospitalares. Biofouling de organismos marinhos em barcos e navios de grande porte aumenta o o consumo de combustível. 12, 16, 17, 18

-Molécula única força espectroscopia (SMFS), usando um AFM, pode medir directamente as interacções entre um aminoácido ou um péptido com um substrato. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 Outros métodos, como a exibição de fagos, 27, 28 microbalança de cristal de quartzo (QCM) 29 ou ressonância de plasma de superfície (SPR) 29, 30, 31, 32,ref "> 33 medida as interações de peptídeos e proteínas para superfícies inorgânicas em massa. 34, 35, 36 Isto significa que os resultados obtidos por estes métodos referem-se a conjuntos de moléculas ou agregados. Em SMFS, uma ou poucas moléculas são fixadas à ponta de AFM e as suas interacções com o substrato desejado é medido. Esta abordagem pode ser expandido para estudar o dobramento de proteínas, puxando a proteína a partir da superfície. Além disso, ele pode ser usado para medir as interacções entre células e proteínas e a ligação dos anticorpos para os seus ligandos. 37, 38, 39, 40 Este artigo descreve detalhadamente como anexar tanto peptídeos ou aminoácidos para a ponta do AFM usando química silanol. Além disso, o documento explica como realizar medições de força e como analisar aresultados.

Protocolo

1. Sugestão Modificação

  1. Compra de nitreto de silício (Si 3 N 4) cantilevers de AFM com pontas de silício (raio cantilever nominal de ~ 2 nm).
  2. Limpar cada cantilever AFM por imersão em etanol anidro durante 20 min. Seca-se à temperatura ambiente. Em seguida, tratar as consolas por expondo-os a O2 do plasma durante 5 min.
  3. Suspender as pontas limpas acima (3 cm) contendo uma solução metiltrietoxisilano e 3- (aminopropil) silano em uma proporção de 15: 1 (v / v) em um exsicador sob uma atmosfera inerte (azoto ou árgon) e ligar o exsicador até uma bomba de vácuo. Vácuo durante 2 horas para formar uma monocamada destes dois tipos de compostos de silano misturadas.
  4. Use um suporte de ponta metálica (fabricada para este processo) para colocar as dicas em uma placa quente. Em seguida, secar as pontas durante 10 minutos a 70 ° C sob condições atmosféricas. Antes do uso, limpe a placa quente, titular metálico e pinças usando etanol.
  5. Arrefecer as dicas no quarto temperatura, e depois mergulhar as pontas em uma solução de Fluorenilmetiloxicarbonilo-PEG-N-hidroxi-succinimida (Fmoc-PEG-NHS, PM 5000 Da) a uma concentração de 5 mM em clorofórmio contendo 0,5% (v / v) de trietilamina durante 1 h a temperatura do quarto.
  6. Mergulhe as pontas em clorofórmio durante 5 minutos e, em seguida, mergulhá-lo em dimetilformamida (DMF) durante mais 5 minutos. A fim de desproteger o grupo Fmoc de as moléculas de PEG ligadas, mergulhar as pontas em piperidina a 20% (v / v) em DMF durante 30 min. Mergulhar as pontas em DMF, durante 4 minutos e, em seguida, em N-metil-2-pirrolidona (NMP) para adicional de 4 minutos. Repita o sequencial mergulhar três vezes.
  7. Para o acoplamento de aminoácidos, imergir as pontas em uma solução contendo N-terminal de amino ácido protegido (AA) / di-isopropiletilamina (DIPEA) / 2- (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametilurónio hexafluophosphate (HBTU), numa proporção molar de 1: 1: 1 com uma concentração total de 30 mM em 5 mL de NMP durante 1,5 h.
  8. Para o acoplamento de péptidos, mergulhe as pontas em uma solução cont 5 mLaining 40 mg do péptido protegido (terminal N e cadeias laterais, por exemplo, Fmoc-Gln (Trt) -Pro-Ala-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Arg (PBF) -Tyr (tBu) -COOH). , 15 mg de 2- (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametilurio hexafluorofosfato (HBTU), e 5 ml de DIPEA em NMP durante 2 h.
  9. Mergulhe as pontas em NMP durante 4 min. Em seguida, para proteger a mandrilagem livre / não reagido NH2 pelo grupo acetilo, mergulhar as pontas durante 30 min numa mistura de anidrido acético / DIPEA a uma razão molar de 4: 1 e uma concentração total de 0,65 M em NMP.
  10. Para o acoplamento de péptido, realizar duas etapas adicionais.
    1. A fim de desproteger as cadeias laterais do péptido, imergir as pontas em uma solução contendo 95% de TFA, 2,5% de tri-isopropilsilano e 2,5% de água durante 1 h, e, em seguida, lava-se com clorofórmio e DMF.
    2. De modo a remover o grupo Fmoc do péptido, imergir as pontas em piperidina a 20% (v / v) em DMF durante 30 min.
  11. Sequencialmente mergulhar o péptido / amino ácido-funcionalizard dicas para quatro minutos cada em DMF (para péptidos) ou NMP (para os aminoácidos), clorofórmio, 50% de etanol e água. Por fim, seque a ponta no ar.

2. Preparação de Superfície

  1. Prepare mica. Clivar os substratos (9,9 mm de diâmetro) antes de cada utilização, usando fita adesiva. Em seguida, lavar as superfícies com água destilada tripla (TPB).
  2. Prepare TiO 2 -Revestido silício.
    1. Cortar o wafer de silício (100) em 2 cm quadrados usando uma caneta de diamante.
    2. Colocar o substrato num tubo de ensaio de 15 ml cheio com acetona e sonicar durante cinco minutos num banho de ultra-sons. Em seguida, colocar esta superfície de um tubo de ensaio de 15 ml cheio com isopropanol e sonicar durante 5 minutos. Secar o substrato utilizando nitrogênio.
    3. Dissolve-se o agente tensioactivo (por exemplo, BYK-348) em etanol para preparar uma solução a 5% (peso / volume). Em seguida, adicionar 0,02 ml da solução de agente tensioactivo a uma dispersão de 2 2 ml de 30% de TiO.
    4. A partir da solução resultante, gota-cast 0.2 mL em um substrato de Si limpa.
    5. Recozer estas superfícies fundidas-gota a 250 ° C durante 2 h em ar. 41

3. única molécula de medidas de força Espectroscopia

  1. Anexar a superfície desejada a um suporte metálico de AFM com cola de dois componentes comercialmente disponíveis. Colocar o suporte da metálico no suporte do copo da AFM, que tem a forma de uma pequena placa de Petri. Preencha este suporte com tampão Tris (pH 50 mM = 7,4) ou qualquer meio desejado. Em seguida, coloque o titular no palco AFM baixo do suporte da ponta.
  2. Calibrar os braços de suporte de AFM com constantes de mola que variam de 10 a 30 pN / nm, utilizando o método de flutuação térmica 26 (incluído no software AFM) com uma incerteza absoluta de cerca de 10%.
  3. Medir a força da interacção por se aproximar do aminoácido ou ponta funcionalizada-péptido para o substrato até que esteja em contacto com o substrato com uma compressãoforça de ~ 200 pN e, em seguida, imediatamente retrair a ponta a várias velocidades, de 0,1 a 0,8 ^ m / s, para uma distância de ~ 200 nm.

Análise 4. Dados

  1. Converter os valores de deformação (V) para forçar multiplicando a sensibilidade fotodíodo (V / m) e utilizando a constante da mola determinado experimentalmente. 42 Isto é feito automaticamente pelo software AFM.
    1. Para obter curvas FD com um eventos única molécula, ficha várias centenas de curvas (800-1,500). Obter dois picos numa curva de uma única molécula de: o primeiro pico indica interacções não específicas entre a ponta e a superfície e o segundo corresponde ao pico da interacção específica da molécula com a superfície. Quando, a curva FD conter mais do que estes dois picos, descartá-las a partir do cálculo da força mais provável.
      NOTA: Apenas eventos de adesão individuais são tidas em conta (de 10 a 30% das curvas). 43
  2. Para calcular a taxa de carregamento aparente, ajuste de pelo menos 50 força vs. curvas distância com a corrente sem-fim-like (WLC) modelo 44 pouco antes da ruptura para obter um conjunto de taxas de carregamento, que são então utilizados para a preparação de histogramas as taxas de carga aparente. Derivar as forças unbinding entre os péptidos ácidos aminados e / superfície do salto em força depois da separação do raio de acção do substrato.

Resultados

A Figura 1 apresenta o procedimento de modificação de ponta. No primeiro passo, um tratamento com plasma modifica a superfície da ponta de nitreto de silício. A ponta apresenta grupos OH. Estes grupos serão, em seguida, reagir com os silanos. No final deste passo, a superfície da ponta vai ser coberta por grupos -NH2 livres. Estas aminas livres vai então reagir com Fmoc-PEG-NHS, um ligante covalente. O grupo Fmoc do ligante é removido por PEG pipyridin...

Discussão

Os passos 1.3, 1.4 e 1.7 no protocolo deve ser realizado com cuidado extenso e de uma forma muito suave. No passo 1.3, a ponta não deve estar em contacto com a mistura de silano e o processo de silanização deve ser realizada numa atmosfera inerte (de humidade livre). 45 Isto é feito a fim de evitar a formação de camadas múltiplas e porque as moléculas de silano prontamente sofrer hidrólise na presença de humidade. 45

No passo 1.4, a t...

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tipsBruker (Camarilo, CA, USA)MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm 
Methyltriethoxysilane Acros Organics (New Jersey, USA)For Silaylation of the AFM tip 
3-(Aminopropyl) triethoxysilaneSigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)Used for tip modification 
TriisopropylsilaneSigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)Used for tip modification
N-EthyldiisopropylamineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip modification
TriethylamineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip modification
PiperidineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip modification
Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide  (Fmoc-PEG-NHS)Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)Used as the covalent flexible linker  (MW = 5000 Da)
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)Alfa Aser (Heysham, England)Used as a coupling reagent. 
N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)Acros Organics (New Jersey, USA)Used as Solvent in Tip modification procedure
DMF (dimethylformamide)Merck (Darmstadt, Germany)Used as Solvent in Tip modification procedure
Trifluoro acetic acid (TFA)Merck (Darmstadt, Germany)
Acetic anhydrideMerck (Darmstadt, Germany)
PeptidesGL Biochem (Shanghai, China).
Phenylalanine and Tyrosine Biochem (Darmstadt, Germany) 
30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)(30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)
Mica substratesTED PELLA, INC. (Redding, California, USA)9.9 mm diameter

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