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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui vi presentiamo un protocollo per misurare la forza di interazione fra una superficie inorganica ben definita e sia peptidi o aminoacidi mediante spettroscopia forza singola molecola utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM). Le informazioni ottenute dalla misurazione è importante per capire meglio la interfase materiale peptide-inorganico.

Abstract

Le interazioni tra proteine ​​o peptidi e materiali inorganici portano a diversi processi interessanti. Per esempio, combinando proteine ​​con minerali porta alla formazione di materiali compositi con proprietà uniche. Inoltre, il processo indesiderabile di biofouling è iniziata dal adsorbimento di biomolecole, principalmente proteine ​​su superfici. Questo strato organico è uno strato di adesione per i batteri e permette loro di interagire con la superficie. La comprensione delle forze fondamentali che governano le interazioni all'interfaccia organico-inorganico è quindi importante per molti settori della ricerca e potrebbe portare alla progettazione di nuovi materiali per applicazioni ottiche, meccaniche e biomediche. Questo documento illustra una tecnica di spettroscopia di forza singola molecola che utilizza un AFM per misurare la forza di adesione tra entrambi peptidi o amminoacidi e superfici inorganiche ben definiti. Questa tecnica comporta un protocollo per fissare la biomolecola alla AFMpunta attraverso un covalente linker flessibile e misure di spettroscopia di forza singola molecola al microscopio a forza atomica. Inoltre, l'analisi di queste misure è incluso.

Introduzione

L'interazione tra proteine ​​e minerali inorganici porta alla costruzione di materiali compositi con caratteristiche distintive. Questo comprende materiali ad elevata resistenza meccanica e proprietà ottiche uniche. 1, 2, ad esempio, la combinazione del collagene proteina con l'idrossiapatite minerale genera sia ossa molli o duri per diverse funzionalità. 3 peptidi brevi possono anche legare materiali inorganici con elevata specificità. 4, 5, 6 La specificità di questi peptidi sono stati utilizzati per la progettazione di nuovi materiali magnetici ed elettronici, 7, 8, 9 fabbricare materiali nanostrutturati, crescita di cristalli, 10 e sintetizzare le nanoparticelle. 11 Comprendere il meccanismo alla base delle interazioni tra i peptidi o proteine e materiali inorganici sarà quindi permetterà di progettare nuovi materiali compositi con migliorate proprietà di adsorbimento. Inoltre, poiché l'interfase di impianti con una risposta immunitaria è mediata da proteine, una migliore comprensione delle interazioni di proteine ​​con materiali inorganici migliorerà la nostra capacità di progettare impianti. Un'altra area importante che coinvolge le proteine ​​interagenti con superfici inorganiche è la fabbricazione di materiali antivegetative. 12, 13, 14, 15 Biofouling è un processo indesiderabile in cui gli organismi attribuiscono ad una superficie. Esso ha molte implicazioni negative sulle nostre vite. Ad esempio, biofouling di batteri sui dispositivi medici porta a infezioni nosocomiali. Biofouling di organismi marini su barche e grandi navi aumenta la consumo di carburante. 12, 16, 17, 18

Singola molecola di forza spettroscopia (SMFS), utilizzando un AFM, può misurare direttamente le interazioni tra un amminoacido o peptide con un substrato. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 Altri metodi come phage display, 27, 28 quarzo microbilancia cristallo (QCM) 29 o risonanza plasmonica di superficie (SPR) 29, 30, 31, 32,ref "> 33 misura le interazioni di peptidi e proteine su superfici inorganiche alla rinfusa. 34, 35, 36 Ciò significa che i risultati ottenuti con questi metodi si riferiscono a gruppi di molecole o aggregati. In SMFS, una o poche molecole sono fissati alla punta AFM e le loro interazioni con il substrato desiderato viene misurata. Questo approccio può essere esteso per studiare ripiegamento proteico tirando la proteina dalla superficie. Inoltre, può essere utilizzato per misurare le interazioni tra le cellule e proteine ​​e il legame di anticorpi ai loro ligandi. 37, 38, 39, 40 Questo documento descrive in dettaglio come collegare sia peptidi o amminoacidi fino alla punta AFM con silanolo chimica. Inoltre, il documento spiega come eseguire misurazioni di forza e come analizzare larisultati.

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Protocollo

1. Tip modifica

  1. Acquisto nitruro di silicio (Si 3 N 4) cantilever AFM con punte di silicio (raggio sbalzo nominale di ~ 2 nm).
  2. Pulire ogni cantilever AFM mediante immersione in etanolo anidro per 20 min. Lavaggio a temperatura ambiente. Poi trattare il cantilever esponendoli a O 2 plasma per 5 min.
  3. Sospendere le punte pulite sopra (3 cm) una soluzione contenente metiltrietossisilano e 3- (amminopropil) triethoxysilane in un rapporto di 15: 1 (v / v) in un essiccatore sotto atmosfera inerte (azoto o argon) e collegare l'essiccatore a una pompa a vuoto. Vuoto per 2 ore per formare un monostrato di questi due tipi di composti silanici misti.
  4. Usare un supporto punta metallica (fabbricato per questo processo) per posizionare le punte su un piatto caldo. Poi asciugare le punte per 10 minuti a 70 ° C in condizioni atmosferiche. Prima dell'uso, pulire la piastra calda, supporto metallico e pinzette con etanolo.
  5. Raffreddare le punte a Temperatura, e poi immergere le punte in una soluzione di Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-idrossisuccinimmide (Fmoc-PEG-NHS, MW 5000 Da) ad una concentrazione di 5 mM in cloroformio contenente 0,5% (v / v) trietilammina per 1 ha temperatura ambiente.
  6. Immergere le punte in cloroformio per 5 minuti e poi immergerlo in dimetilformammide (DMF) per ulteriori 5 min. Per deproteggere il gruppo Fmoc delle molecole di PEG allegate, immergere le punte a 20% piperidina (v / v) in DMF per 30 min. Immergere le punte in DMF per 4 min e poi in N-metil-2-pirrolidone (NMP) per ulteriori 4 min. Ripetere la sequenza immersione per tre volte.
  7. Per l'accoppiamento di aminoacidi, immergere le punte in una soluzione contenente acido N-terminale protetto amino (AA) / diisopropiletilammina (DIPEA) / 2- (1H-benzotriazolo-1-il) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluophosphate (HBTU), in un rapporto molare di 1: 1: 1 ad una concentrazione totale di 30 mM in 5 mL NMP per 1,5 h.
  8. Per l'accoppiamento peptide, immergere le punte in una soluzione cont 5 mLaining 40 mg del peptide protetto (catene terminali e laterali N, ad esempio Fmoc-Gln (Trt) -Pro-Ala-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Arg (PBF) -Tyr (tBu) -COOH.) , 15 mg 2- (1H-benzotriazolo-1-il) -1,1,3,3-tetramethyluronium esafluorofosfato (HBTU), e 5 mL di DIPEA in NMP per 2 h.
  9. Immergere le punte in NMP per 4 min. Poi, per proteggere l'alesatura libera / non reagito NH 2 dal gruppo acetile, immergere le punte per 30 min in una miscela di anidride acetica / DIPEA in un rapporto molare 4: 1 e una concentrazione totale di 0,65 M in NMP.
  10. Per l'accoppiamento peptide, effettuare due passaggi aggiuntivi.
    1. Per deproteggere catene laterali del peptide, immergere le punte in una soluzione contenente 95% TFA 2,5% triisopropylsilane, e acqua 2,5% per 1 h, quindi lavare con cloroformio e DMF.
    2. Per rimuovere il gruppo Fmoc del peptide, immergere i puntali nel 20% piperidina (v / v) in DMF per 30 min.
  11. Sequenziale immergere il peptide / amino acid-funzionalizzarepunte d per quattro minuti ciascuno in DMF (peptidi) o NMP (per amminoacidi), cloroformio, etanolo al 50% e acqua. Infine asciugare la punta in aria.

Preparazione 2. Superficie

  1. Preparare mica. Cleave i substrati (diametro 9,9 millimetri) prima di ogni uso utilizzando nastro adesivo. Quindi, lavare le superfici con acqua distillata tripla (TDW).
  2. Preparare TiO2 silicio Rivestiti.
    1. Tagliare il wafer di silicio (100) in 2 cm di lato con una penna di diamante.
    2. Posizionare il substrato in una provetta da 15 ml di prova riempito con acetone e sonicare per cinque minuti in un bagno ad ultrasuoni. Poi, collocare questa superficie in una provetta da 15 mL di prova riempito con isopropanolo e sonicare per 5 min. Asciugare il substrato con azoto.
    3. Sciogliere il tensioattivo (per esempio, Byk-348) in etanolo per preparare una soluzione al 5% (peso / volume). Quindi, aggiungere 0,02 ml della soluzione di tensioattivo a 2 mL di 30% TiO 2 dispersione.
    4. Dalla soluzione risultante, drop-cast 0.2 mL su un substrato di Si pulita.
    5. Anneal queste superfici goccia pressofuso a 250 ° C per 2 ore in aria. 41

3. singola molecola Forza Spettroscopia Misure

  1. Fissare la superficie desiderata ad un supporto metallico del AFM valutata utilizzando colla a due componenti. Posizionare il supporto metallico in supporto di vetro della AFM, che è conformata come una piccola capsula di Petri. Riempire questo supporto con tampone Tris (50 mm pH = 7.4) o qualsiasi mezzo desiderato. Poi, posizionare il supporto sul palco AFM sotto il supporto punta.
  2. Calibrare i cantilever AFM con costante elastica che variano da 10 a 30 pN / nm utilizzando il metodo termico fluttuazione 26 (incluso nel software AFM) con una incertezza assoluta di circa il 10%.
  3. Misurare la forza dell'interazione avvicinando l'amminoacido o peptide tip-funzionalizzati al substrato fino a quando è a contatto con il substrato con una compressioneforza di ~ 200 pN e quindi ritrarre subito la punta a varie velocità, da 0,1 a 0,8 micron / s, per una distanza di ~ 200 nm.

Analisi 4. I dati

  1. Convertire i valori di deflessione (V) per forzare moltiplicando la sensibilità fotodiodo (V / m) e con la costante della molla determinata sperimentalmente. 42 Questo viene fatto automaticamente dal software AFM.
    1. Per ottenere curve FD con una singola molecola eventi, registrare diverse centinaia di curve (800-1,500). Ottenere due picchi in una curva singola molecola: il primo picco indica interazioni aspecifiche tra la punta e la superficie e la seconda corrisponde picco alla specifica interazione della molecola con la superficie. Quando la curva FD contiene più di questi due picchi, disfarsene dal calcolo della forza più probabile.
      NOTA: eventi solo singoli adesione si tenga conto (dal 10 al 30% delle curve). 43
  2. Per calcolare il tasso di carico apparente, in forma almeno il 50 forza contro curve a distanza con la catena vermiforme (WLC) modello 44 appena prima la rottura di ottenere una serie di tassi di carico, che vengono poi utilizzati per la preparazione di istogrammi i tassi di carico apparenti. Derivare le forze non impegnativa tra le / gli aminoacidi peptidi e la superficie del salto in vigore dopo la separazione del cantilever dal substrato.

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Risultati

La figura 1 mostra la procedura di modifica punta. Nella prima fase, un trattamento al plasma cambia la superficie della punta nitruro di silicio. La punta presenta gruppi OH. Questi gruppi poi reagire con i silani. Al termine di questa fase, la superficie della punta sarà coperto da free gruppi -NH 2. Queste ammine libere saranno poi reagire con Fmoc -PEG-NHS, un linker covalente. Il gruppo Fmoc del linker PEG viene rimosso mediante pipyridine, un reagente r...

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Discussione

I passi 1.3, 1.4 e 1.7 nel protocollo devono essere effettuate con una vasta cura e in modo molto delicato. Nel passo 1.3, la punta non deve essere in contatto con la miscela silano e il processo di silanizzazione deve essere effettuata in atmosfera inerte (umidità libera). 45 Questo viene fatto al fine di prevenire la formazione di strati e perché le molecole di silano facilmente subiscono idrolisi in presenza di umidità. 45

Nel passo 1.4, ...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tipsBruker (Camarilo, CA, USA)MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm 
Methyltriethoxysilane Acros Organics (New Jersey, USA)For Silaylation of the AFM tip 
3-(Aminopropyl) triethoxysilaneSigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)For Silaylation of the AFM tip
TriisopropylsilaneSigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)Used for peptide deprotection
N-EthyldiisopropylamineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip modification
TriethylamineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip modification
PiperidineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip Fmoc deprotection
Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide  (Fmoc-PEG-NHS)Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)Used as the covalent flexible linker  (MW = 5,000 Da)
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)Alfa Aser (Heysham, England)Used as a coupling reagent. 
N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)Acros Organics (New Jersey, USA)Used as Solvent in Tip modification procedure
DMF (dimethylformamide)Merck (Darmstadt, Germany)Used as Solvent in Tip modification procedure
ChloroformBio-Lab (Jerusalem, Israel)Used as Solvent in Tip modification procedure
Ethanol (Anhydrous)Gadot (Netanya, Israel)Used as Solvent in Tip modification procedure
Trifluoro acetic acid (TFA)Merck (Darmstadt, Germany)
Acetic anhydrideMerck (Darmstadt, Germany)
PeptidesGL Biochem (Shanghai, China).
Phenylalanine and Tyrosine Biochem (Darmstadt, Germany) 
30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)(30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Used for TiO2 substrate preparation
Mica substratesTED PELLA, INC. (Redding, California, USA)9.9 mm diameter

Riferimenti

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