Autores
Entre em contato

Entrar

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.

Resumo

Desvendando os mecanismos moleculares de manifestações da doença é importante compreender patologias e desenvolvimento de sintomas em ciência das plantas. As bactérias têm evoluído diferentes estratégias para manipular seu metabolismo de acolhimento para seu próprio benefício. Esta manipulação bacteriana é muitas vezes associada com o desenvolvimento de sintomas graves ou a morte das plantas afetadas. Determinar as moléculas responsáveis ​​bacterianas específicas para a manipulação de acolhimento tornou-se um importante campo de pesquisa microbiológica. Após a identificação destas moléculas bacterianas, chamados "efectores," é importante para elucidar a sua função. Uma abordagem simples para determinar a função de um efector é identificar o seu parceiro de ligação proteináceo no seu hospedeiro natural através de uma tela de levedura de dois híbridos (Y2H). Normalmente, o anfitrião abriga numerosos parceiros de ligação potenciais que não podem ser previstos suficientemente por qualquer algoritmo em silico. É, portanto, a melhor escolha para perform a tela com o efetor hipotética contra toda uma biblioteca de proteínas do hospedeiro expressas. É especialmente difícil se o agente causador não é cultivável como fitoplasma. Este protocolo fornece instruções passo-a-passo para a purificação de DNA a partir de uma planta infectada-fitoplasma acolhimento lenhosa, a amplificação do effector potencial, bem como a identificação posterior de parceiro de interacção molecular da planta com uma tela Y2H. Apesar de telas y2h são comumente usados, há uma tendência de terceirizar essa técnica para empresas de biotecnologia que oferecem o serviço Y2H a um custo. Este protocolo fornece instruções sobre como executar uma Y2H em qualquer laboratório de biologia molecular decentemente equipados usando técnicas de laboratório padrão.

Introdução

Levedura telas de dois híbridos (y2h) foram desenvolvidos cerca de 27 anos atrás 1 e já foram amplamente utilizado em vários campos para determinar interações específicas proteína-proteína 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . A interacção física de um efector bacteriana com uma proteína alvo do hospedeiro muitas vezes é a condição prévia para a manipulação funcional desta proteína alvo. Analisando essas interações mudou-se para o foco de diversos setores da infecção biologia 12, 13, 14, 15,"> 16, 17, 18. O princípio da tela de Y2H é que a interacção entre duas proteínas leva à reconstituição de um factor de transcrição funcional, que dirige a expressão de genes repórter. O efector conhecido (o" isco ") é fundida na tradução com para o domínio de ligação de DNA (DBD) do factor de transcrição, e os potenciais parceiros de interacção (o "presas") está fundida com o domínio de activação (AD) do respectivo factor de transcrição. uma vez que o parceiro de interacção é desconhecida, uma biblioteca de potenciais interactores é clonado no assim chamado "presa-biblioteca". Normalmente, esta biblioteca é feita por clonagem de ADNc num plasmídeo adequado expressão presa vector que codifica o anúncio que é compatível com a isca-vector codificado DBD. no caso de uma interacção, o factores de transcrição reconstituída induzir a expressão de genes repórter, que geralmente permitem a selecção de crescimento de levedura. oidentificação dos interactores é obtida por sequenciação do plasmídeo presa com iniciadores específicos para o plasmídeo.

As bactérias desenvolveram várias estratégias para manipular e explorar o metabolismo do seu hospedeiro ou para fugir mecanismos de defesa e secretam moléculas efetoras através de diferentes sistemas de secreção bacterianas 19, 20, 21. Determinando os parceiros de ligação destes efectores bacterianas é, assim, o primeiro passo para identificar a via manipulada no hospedeiro. Isto leva a uma melhor compreensão dos mecanismos de patogenicidade específicos.

Y2H telas são realizadas para identificar interacções bacterianas efectoras durante phytoplasmoses, e, muitas vezes, Y2H é uma experiência inicial crucial para a posterior caracterização dos mecanismos moleculares de patogenicidade em investigação phytoplasma 22, 23. No entanto, o metA inscrição hod na maioria das publicações é bastante escassa, e essas técnicas muitas vezes são terceirizadas para empresas de biotecnologia. Para chamar a atenção para a viabilidade deste método, este protocolo fornece informações passo-a-passo para identificar parceiros de interação de uma molécula efectora bacteriana em seu hospedeiro natural.

Apesar da ampla utilização e a abordagem de avanço rápido de telas y2h, não se deve esquecer que certas interações podem não ocorrer no sistema de levedura. Isto é devido ao facto de a célula de levedura é usado como uma espécie de "in vivo vaso de reacção" com certas limitações biológicas. Vários autores têm abordado as vantagens e desvantagens de Y2H e seus derivados 11, 24, 25, 26, 27. Considerações gerais são, por exemplo, que a célula de levedura pode não proporcionar a adequadaa expressão do gene, (pós-) translacional, ou condições translocational para as respectivas proteínas em estudo. Isso pode levar a resultados falso-negativos na tela. Interacções positivas podem por sua vez ser artefactos e pode não ocorrer na situação natural (ou seja, em caso de efectores no hospedeiro apropriado). É, portanto, indispensável para confirmar as interacções do sistema de expressão de levedura heteróloga com um teste de interacção independente num sistema biológico mais intimamente relacionados.

Neste estudo, foram identificados os parceiros de ligação do ATP_00189 efetoras do patógeno de planta não-cultiváveis Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). Os resultados fornecem importantes insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento dos sintomas da proliferação de maçã 28, uma doença que causa grandes perdas econômicas em regiões de cultivo de maçã afetados na Europa 29.

Protocolo

1. Coleta de amostras de raízes e de folhas das árvores da Apple infectados

Nota: ADN agente patogénico específico, pode ser purificada a partir de raízes ou as folhas. A seção a seguir fornece um protocolo para a amostragem de ambos.

  1. Para a preparação de DNA
    1. coleta de amostras e preparação das raízes
      1. Identificar árvores infectadas com "proliferação de maçã" sintomas espec�icos 30, 31 e árvores de controle que são livres de sintomas. Utilizando tesouras de podar limpa, cortar amostras de raízes que têm um diâmetro de 0,5 - 1 cm e um comprimento de cerca de 5 cm. As amostras cortadas de três locais diferentes, distantes do sistema radicular, e colocá-los em sacos plásticos devidamente rotulados.
        1. Manter as amostras em uma caixa de frio, com embalagens térmicas refrigeradas e armazená-los na geladeira a 4 ° C até ao respectivo processamento.
          Nota: arquitetura e estrutura de raiz pode variar no que diz respeito ao estado fisiológico óf a árvore. É importante para provar em três locais diferentes e não tomar rootlets demasiado finos. As amostras podem ser armazenadas durante vários dias a 4 ° C, mas os tempos de armazenamento mais longos, aumentam o risco de moldagem. amostras bolorentas, não pode ser usado para preparação de DNA.
      2. Lavar as amostras de raízes com água para remover o solo. Colocá-los numa placa de Petri estéril e usar um bisturi esterilizado para remover a epiderme de raiz e o córtex.
        1. Limpe o bisturi com um pano limpo, sem fiapos limpar, mergulhá-lo em 70% (v / v) solução de água etanol, e calor esterilizar-lo sobre uma chama aberta (por exemplo, bico de Bunsen). Riscar o floema com o bisturi, cortá-la em pedaços pequenos, e alíquota de 30 - 100 mg do floema picado em um mL tubo estéril 2,0 reação. Armazenar as amostras a -80 ° C durante vários meses.
    2. coleta de amostras e preparação das folhas
      1. Identificar um infectadas e de uma árvore de controle assintomática, umas descrito no passo 1.1.1.1, e pegar dez folhas incólume por árvore. Uma árvore por condição é suficiente.
      2. Lavar as folhas com água e limpar as superfícies por pulverização de 70% (v / v) de etanol. Coloque as folhas numa placa de Petri estéril e dissecar a nervura central (veia central) de cada folha com um bisturi estéril. Remover a epiderme e córtex da nervura central, cortar a nervura central em pedaços pequenos, e alíquota de 100 mg do tecido nervura central para um tubo estéril de reacção de 2.0 ml. Use as amostras imediatamente para a preparação de DNA ou armazenar a -80 ° C durante vários meses.
        Nota: É conveniente a alíquota do material vegetal, em porções de 100 mg e, eventualmente, congelá-los para o armazenamento. Cada alíquota pode ser utilizado directamente para a preparação de ADN. Pesagem material vegetal congelado é complicado, uma vez que o material de planta congelada tende a formar pedaços.

2. brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) à base de DNA Preparação

Nota: ADN pode ser purificado utilizando qualquer método de purificação de ADN baseados em coluna em material vegetal. Nesta seção, um método baseado em CTAB para purificação de DNA é descrito. Purificação de ADN é realizado com base em um protocolo modificado descrito noutro local 32.

  1. Preparar os seguintes tampões:
    1. Tampão CTAB: Dissolve-se 1% w / v de brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB, H R: 364,45 g / mol), trishidroximetilaminometano 100 mM (Tris, H R: 121,14 g / mL), cloreto de sódio 1,4 M (NaCl, H R: 58,44 g / mol), e 20 mM de sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético (NaEDTA, H R: 372,24 g / mol) em água e ajustá-las para um pH de 8,0.
    2. Tampão de N-lauroilsarcosina: Dissolve-se 10% w / v de sal de sódio de N-lauroilsarcosina 33 (M r: 293,38 g / mol), Tris 100 mM, NaEDTA 20 mM e em água e ajustar o pH a 8,0.
    3. Tris-EDTA (TE) Tampão: Dissolver Tris 10 mM e NaEDTA 1 mM em água e autoclave a solução.
    4. Solução de acetato de amónio: Prepara-se uma de etilo 5 M de amónio (M r: 77,0825 g / mol) solução em água e que autoclave a 120 ° C e 1,2 bar durante 20 min.
  2. Misturar 30 - 100 mg de material vegetal fresco ou congelado picado (passo 1.1.2.2.) Com 300 uL de tampão CTAB, 30 uL de tampão de N-lauroilsarcosina, 6 ul de proteinase K (10 ug / uL), e 12 uL de 2-mercaptoetanol 34 (M r: 78,13 g / mol). Agitar por 60 min a 60 ° C. Deixe a mistura arrefecer até à temperatura ambiente antes de continuar.
  3. Adicionar 360 uL de solução de acetato de amónio e misturar vigorosamente. Deixe a solução descansar durante 5 min, e em seguida, centrifuga-lo a 15000 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo e adicionar 720 mL de isopropanol arrefecido com gelo 35. Precipitar o DNA por pelo menos 30 min a -20 ° C.
  4. Centrifugar a mistura a 15.000 xg durante 30 min a 4° C e desprezar o sobrenadante. Lava-se a pelete com 500 mL de gelo frio de 70% de etanol e girá-lo para baixo a 15.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
  5. Descartar o sobrenadante de etanol e mergulhar imediatamente o frasco em uma toalha de papel limpa para remover as gotas residuais. Certifique-se de remover o máximo de líquido possível. Secar o sedimento durante 15-20 min ou durante 2-3 min numa centrífuga concentrador de vácuo. Não excesso de secar o sedimento pelo excesso de aquecimento ou tempos de evaporação estendidos.
  6. Ressuspender o sedimento em 700 ul de tampão TE e, eventualmente, aquecê-lo até 37 ° C para facilitar a dissolução. Adicionam-se 10 ul de ARNase (10 ug / uL) e incubar-lo durante 15 min a 37 ° C, agitação a 300 rpm.
  7. Adicionar 700 ul de clorofórmio: álcool isoamílico 36 24: 1 e misturar bem. Centrifugar a mistura a 20000 xg durante 10 min a 4 ° C e transferir a fase superior do sobrenadante para um novo frasco, limpo.
  8. Precipitar o DNA no sobrenadante adicionando700 ul de 2-propanol 35 (isopropanol, H R: 60,1 g / mol) e incubando durante pelo menos 30 min a -20 ° C. Centrifugar a mistura a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
  9. Lavar o sedimento com 500 ul de etanol a 70% e centrifuga-se a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Seca-se a pelete tal como descrito na etapa 2.5. Dissolve-se que em 50 ul de TE.

3. Detecção Candidatus Phytoplasma DNA mali-específica por PCR

  1. Dilui-se o ADN purificado a partir do material vegetal 1:10 em água isenta de nuclease e executar uma RCP com iniciadores específicos de agentes patogénicos 37.
    1. Verificar a presença de P. ADN específica da mali no material vegetal, utilizando um protocolo de PCR quantitativa com os iniciadores e sondas específicos para P. phytoplasma mali 37. Verifique a ausência de outros membros fitoplasma 16SrX realizando a mesma PCR com as respectivas sondas para Cand. P. prunorum e para Cand. P. pyri DNA 37.
      NOTA: o DNA de uma árvore não-infectados devem ser testados para confirmar a ausência de um agente patogénico neste controlo. Neste passo, é importante que o DNA de outras espécies estreitamente relacionadas fitoplasma está ausente na amostra, uma vez que iria aumentar o risco de amplificar o efector de um fitoplasma outras espécies que P. mali. A infecção mista com outra P. mali fitoplasma intimamente relacionada grupo 16SrX está descartada através da análise da amostra com as respectivas sondas. Uma vez que os resultados esperados deve ser negativo para a outra phytoplasma 16SrX, é importante incluir os controlos positivos apropriados, que indicam a eficácia de PCR.

4. amplificação do gene Potencial efeitos e subclonagem no vetor Y2H Bait

  1. Amplificar o gene atp_00189 phytoplasmal (não compreendendo a parte peptídeo sinal) de P. Mali utilizando os primers 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (para a frente) e 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (reverso), com sítios de restrição para EcoRI e Sall nas extremidades 5 'e a 3', respectivamente. Purifica-se o produto de PCR com um método de purificação de ADN baseados em coluna.
  2. Clonar o fragmento amplificado no vector isco Y2H pLexA-N através de ligação com EcoRI e Sall.
    NOTA: Aqui, com 100 ng de EcoRI e Sall linearizado pLexA-N vector foi combinado com 15 ng do digerido de forma semelhante atp_00189 fragmento amplificado por PCR e 1 U de ligase de T4. A ligação foi realizada em tampão contendo Tris-HCl 40 (pH 7,9 a 25 ° C), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 10 mM (DTT, H R: 154,25 g / mol), e 0,5 mM de trifosfato de adenosina (ATP, H R: 507,18 g / mol) em um volume total de 10,0 mL a 16 ° C durante a noite (14-20 h). Analisar o ADN a partir da árvore não infectados com os mesmos iniciadores para descartar a ligação inespecífica Malus x domestica iniciador </ Em> ADN.
  3. Transform 1 uL da mistura de ligação em células electrocompetentes de E. coli e seleccionar os clones resistentes à canamicina em meio de Luria-Bertani (LB) suplementado com placas de 50 ug / ml de canamicina sulfato de 38.
  4. Purifica-se o ADN de plasmídeo a partir dos clones bacterianos seleccionados com um plasmídeo mini-kit de preparação à base de coluna de acordo com as instruções do fabricante, e verificar a integração bem sucedida e orientação da inserção por sequenciação de 39.

5. Teste de Auto-ativação (Auto-ativação) da proteína efetora Potencial

  1. Prepare os seguintes tampões e meios de crescimento:
    NOTA: A nomenclatura para as placas de levedura hifeniza-selectiva as abreviaturas dos aminoácidos ausentes no respectivo meio com um "-" antes da abreviatura. Por exemplo, SD-Trp-Leu-suas placas contêm todos os aminoácidos, mas Trp, Leu e His.
    1. 10x mix de abandono: Pesar200 mg de monocloridrato de L-arginina (Mr: 210,66 g / mol), 300 mg de L-isoleucina (M r: 131,17 g / mol), 269 mg de L-lisina mono-hidratada (M r: 164,21 g / mol), 200 mg de L-metionina (M r: 149,21 g / mol), 500 mg de L-fenilalanina (M r: 165,19 g / mol), 2 g de L-treonina (M r: 119,12 g / mol), 300 mg de L-tirosina (Mr: 181,19 g / mol), 200 mg de L-uracilo (112,09 g / mol), e 1,5 g de L-valina (H R: 117,15 g / mol). Dissolve-los em 1 L de água bidestilada e a solução autoclave. Manter a solução a 4 ° C.
      NOTA: O respectivo mix de abandono pode ser pré-misturado também comprados.
    2. 10x L-adenina suplemento: Pesar 100 mg de sal de L-adenina hemissulfato (ADE, H R: 184,17 g / mol) e dissolver em 50 mL de água duplamente destilada. Filtro de esterilizar a solução com um filtro de poro de 0,22 um.
    3. 10x L-histidina suplemento: Pesar 100 mg de L-histidina mono-hidrato (o, H R : 209,63 g / mol) em 50 ml de água duplamente destilada e filtra-se esterilizar um filtro com poros de 0,22 mícrons.
    4. 10x L-leucina suplemento: Pesar 500 mg de L-leucina (Leu, H R: 113,17 g / mol) em 50 mL de água duplamente destilada e filtra-se esterilizar um filtro com poros de 0,22 mícrons.
    5. 10x L-triptofano suplemento: Pesar 100 mg de L-triptofano (trp, H R: 204,23 g / mol) em 50 mL de água duplamente destilada e filtra-se esterilizar um filtro com poros de 0,22 mícrons.
    6. SD-Trp-Leu-His-ADE-médio e placas: Dissolve-se 0,67% w / v de base azotada de levedura (sem aminoácidos) e 2% w / v D-glucose mono-hidrato (M r: 198,17 g / mol) em duplo água e autoclave destilada. Para placas de ágar, adiciona-se 2% w / v de ágar (grau microbiológica) antes da autoclavagem.
    7. Para preparar as placas selectivas, adicionar 1x da solução de aminoácidos para o meio-SD-Trp-Leu-Ade sua autoclavado. Ao preparar as placas, certifique-se de que o agar é arrefecida a ~ 50 ° C antes de adicionaros aminoácidos. Manter as soluções de estéril.
    8. Forma YPAD: Dissolve-se 1% w / v de extracto de levedura, 2% w / v de peptona (grau microbiológica), 0,004% w / v de sal de adenina hemissulfato (Mr: 184,17 g / mol), e 2% w / v de mono-hidrato de glucose a água e autoclave bidestilada. Para placas de agar YPAD, adicionar 2% w / v de ágar antes da autoclavagem. Para preparar 2x YPAD, utilizar o dobro das concentrações dos ingredientes mencionados acima.
      Nota: (opcional) Devido à elevada concentração de glucose no meio, o meio torna-se 2x YPAD-escuro acastanhado após a autoclavagem. Como uma alternativa, um 40% (w / v) de solução de glucose pode ser preparada e esterilizada por passagem através de um filtro de 0,22 mícrons. A solução estoque de glicose esterilizada por filtro é, em seguida, adicionado à 2x YPAD autoclavado (sem glicose) sob condições estéreis. Para evitar erros de volume, a 2x YPAD deve ser preparada, mantendo em mente que uma solução de glucose a 10x é subsequentemente adicionado. Isso significa que, por exemplo, em vez de um L omeio F, cerca de 900 ml é preparada (contendo todos os ingredientes excepto a glicose) e autoclavado, e depois 100 mL de uma solução de estoque de glucose é adicionada.
  2. transformação de levedura de lítio de etilo-mediada para o teste de auto-activação
    1. Streak a estirpe Saccharomyces cerevisiae repórter NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ADE2 LYS2: :( LexAOp) 4-HIS3 ura3: :( LexAOp) 8-lacZ ADE2: :( LexAOp) 8-ADE2 GAL4) a partir de um estoque de glicerol congelado numa placa de agar e incubam-lo YPAD durante 48 h a 30 ° C. Escolha colónias desta placa e inocular 50 ml de meio YPAD. Deixe o fermento crescer e medir o OD 600 regularmente para acompanhar o crescimento.
    2. Deixe o fermento crescer a uma OD final de 600 de 0,5-0,8. Agregar as células por centrifugação a 700 xg durante 5 min e ressuspender-los em 2,5 ml de água bidestilada, autoclavado.
    3. Prepare seis alíquotas com 100 ul de suspensão de levedura e adicionar 240 ul de 50% W / v de polietilenoglicol 4000 (PEG, Mr: 3.500-4.000 g / mol), 36 mL de 1 M de lítio di-etilo (LiOAc, H R: 102,02 g / mol), e 25 ul de 2% w / v ADN de esperma de salmão (dissolvida). Prepare todos os reagentes com água bidestilada, estéril.
    4. Rotular os seis frascos contendo a suspensão de levedura a partir de "A" a "F" e adicionar o seguinte ADN vector plasmídico: controlos negativos: (a) 1,5 ug de plasmídeo isca com o efector (pLexA-N-atp00189 28), (b) 1,5 ug de plasmídeo presa vazia pGAD-HA 41, (c) 1,5 ug de vector vazio isca pLexA-N 41, e (d) 1,5 mg de vazio isca vector pLexA-N e 1,5 ug de vazio plasmídeo presa pGAD-HA; controlos positivos: (e) 1,5 mg de-controlo positivo plasmídeo isca DNA pLexA-p53 41 e 1,5 mg de positivo-presa plasmídeo pacto de larget 41; e o teste de auto-ativação: (f) 1,5 mg de ba-lo plasmídeo com o efetor (pLexA-N-atp00189) e 1,5 mg de vazio plasmídeo presa pGAD-HA.
    5. Misturar as reacções vigorosamente e incubar durante 45 min a 42 ° C num banho de água. Sedimentar as células durante 5 min a 700 xg e desprezar o sobrenadante. Ressuspender as células em 250 ul de 0,9% (w / v) de solução de cloreto de sódio (NaCl, H R: 48,44 g / mol) e 50 ul espalhar sobre as placas selectivas seguintes: SD-Trp, SD-Leu, SD-Trp- Leu, SD-Trp-Leu-o, e SD-Trp-Leu-His-ade.
    6. Incubar as placas durante 3 - 4 dias a 30 ° C. Após o primeiro dia de incubação, selar as placas com película de parafina de plástico para evitar que as placas de secar.
    7. Verificar o crescimento de leveduras sobre as placas.

6. Ensaio da Expressão do efector

  1. Testar a expressão do efector por Western blot com um anticorpo 42 contra o Lex-A etiqueta que é acoplado ao terminal N do efector quandoexpresso a partir de pLexA-N.
    Nota: Considere-se que a fundida na tradução com Lex-A etiqueta adiciona cerca de 24 kDa e o peso real da proteína de interesse. Isto é importante quando a identificação do tamanho da proteína em Western blot.

7. A tela Y2H

  1. Streak o pLexA-atp00189 (efetoras) -transformed NMY51 em uma placa SD-trp fresco e deixá-lo crescer para 2 - 3 dias a 30 ° C, até que colónias vermelhas aparecem.
  2. Inocular 3 ml de meio SD-Trp num pequeno frasco de agitação com uma colónia vermelho da placa de agar e incubar durante a noite a 30 ° C com agitação a 120-150 rpm.
  3. Inocular 20 ml de SD-Trp num balão de agitação com 1 mL da cultura durante a noite e deixou-o crescer durante 8 h.
  4. Ajustar a cultura a OD 600 = 0,2 pela adição de meio SD-Trp e inocular 2x 100 mL em frascos de agitação com 10 mL da cultura de arranque cada. Crescer durante a noite com agitação a 30 ° C.
    Nota: Certifique-se de que a levedura não cresce para OD 600> 0,5 e diluir com SD-trp fresco.
  5. Medir a OD 600 e o sedimento de 120 DO600 "unidades". Por exemplo, se uma DO600 de 1,2 é medida, girar para baixo de 100 ml, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 800 ml de pré-aquecida 2x YPAD num balão agitador com uma barra de agitação magnética.
    1. Girar uma alíquota de 2 mL, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em água. Certifique-se de que a DO600 da suspensão de levedura é entre 0,15 e 0,2. Se não, ajuste com 2x YPAD ou adicionar mais fermento da cultura durante a noite.
      Nota: 2x YPAD é castanho escuro e pode afectar os resultados da medição OD. Assim, é necessário voltar a suspender as células de levedura em água antes da determinação da densidade óptica. Como uma alternativa, 2x YPAD pode ser preparada por esterilização glicose separadamente, como descrito na nota passo 5.1.8, o que impede a coloração escura do meio.
  6. Incubar a cultura de levedura permanecendo em um aplicativoropriately dimensionada agitador rotativo (800 ml num frasco agitador de 2 L ou dividir 2 x 400 mL em dois frascos de 1 L shaker) e incubar a 30 ° C, 120-150 rpm. Medir a OD 600 sobre cada 1,5 horas até uma DO 600 de 0,6 foi atingido (leva 4-6 h). No entanto, preparar as soluções descritas no passo seguinte.
  7. transformação mediada por acetato de lítio
    1. Dissolve-se 2% w / v de DNA de esperma de salmão em água e ferver a 500 mL durante 5 min num banho de água a 100 ° C. Colocar o tubo em gelo durante 2 min e repetir o passo de aquecimento. Manter o ADN em gelo até à sua utilização.
    2. Prepare as seguintes combinações:
      1. TE / LiOAC mistura: Misture 3,08 mL de 1 M LiOAC, 3,08 mL de Tris 100 mM / EDTA a 10 mM (pH: 7,5), e 21,84 mL de água duplamente destilada estéril.
      2. PEG / LiOAc mistura: Combinar 4,2 ml de LiOAc 1 M, 4,2 ml de Tris / EDTA 10 mM (pH: 7,5), e 33,6 mL de 50% (w / v) de PEG 4000.
    3. Centrifugar a cultura de levedura de 800-mL (DO600 = 0,6)a 700 xg durante 5 min para sedimentar as células. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ml de água duplamente destilada estéril. Agregar as células mais uma vez a 700 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Nota: Se necessário, a suspensão divisão em vários frascos de centrifugação. Os volumes de líquido em 7.7.3. e 7.7.4. referem-se a todo o sedimento derivado a partir de 800 ml de suspensão.
    4. Ressuspender o sedimento em 16 mL de TE / LiOAc mix (veja o passo 7.7.1.1); girar a 700 xg durante 5 min e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 9,6 ml de TE / LiOAC mistura.
    5. Preparar o seguinte mistura de reacção nos recipientes de polipropileno de reacção de tamanho adequado: 12 frascos com 7 g de pGAD-HA-biblioteca de ADNc vetor, 100 mL de ADN de esperma de salmão 2% (ver passo 7.7), e 2,5 mL de PEG / LiOAc mistura. Adicionar 600 ul de suspensão de células de levedura a partir do passo 7.10 a cada um dos 12 tubos de ensaio e misturar vigorosamente durante 1 min.
    6. Incubar a mistura de reacção durante 45 minutos a 30 ° C num banho de águad misturar vigorosamente a cada 15 minutos. Adicionar 160? L de DMSO a cada frasco e misturar vigorosamente. Incubar a mistura por mais 20 min a 42 ° C.
    7. Agregar as células a 700 xg durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante e ressuspender cada sedimento em 3 ml de 2x YPAD. Piscina (todas as células com um total de 36 ml a partir dos 12 tubos de ensaio) num balão agitador de 100 ml e incubar a levedura durante 90 min a 30 ° C e 120 rpm.
    8. Sedimentar as células durante 5 min a 700 xg e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 4,5 ml de 0,9% (w / v) de NaCl e misturar bem por pipetagem cuidadosa cima e para baixo com uma pipeta serológica de 10 ml. Retirar 50 mL e diluições de dez vezes preparar em NaCl a 0,9% a partir de 1:10 até 1: 1000. Placa 100 uL de cada diluição em placas de petri de 90 mm contendo agar SD-Trp-Leu.
    9. Espalhe o resto da ressuspensão levedura não diluído em 16 x 150 mm de diâmetro pratos de Petri com agar SD-Trp-Leu-His-ade. Adicionar 3-AT ao meio para reduzir a auto-ativação. Incubar a SD-Trp-Leuplacas para três dias e as placas SD-Trp-Leu-His-ade durante quatro dias a 30 ° C.
      NOTA: Os clones que aparecem nas placas selectivas são (potenciais) pares que interagem e realizar a codificação do plasmídeo pGAD-HA para o parceiro isca interagindo.
    10. Determinar a eficiência de transfecção por contagem de colónias de diluições em série das diferentes nas placas de selecção SD-Trp-Leu. Transferir cada clone por pegar e estrias da colônia com uma ponta de pipeta estéril em placas frescas SD-trp-leu-a-ade seletiva. Incubar as placas durante 24 h a 30 ° C. Repetir esta etapa todos os dias até um total de cinco passagens é atingido.

8. Análise dos clones das placas selectivas

  1. Preparar um tubo estéril de reacção de 2 ml com 1 ml de SD-Trp-Leu-His-Ade para cada clone sob uma cobertura estéril. Perfurar um furo em cada tubo com uma agulha quente e cobrir o buraco com uma peça de selante permeável ao gás. Inocular cada frasco com o companheiro colónia fresca rial a partir de um clone (passo 7.17; usar clones após a 5ª passagem) e incuba-se durante 24 h a 30 ° C, agitação a 150 rpm.
    NOTA: É importante a tomar clones a partir de uma placa de fresco, devido levedura feita a partir de placas armazenadas durante vários dias a 4 ° C não crescem suficientemente dentro de 24 h em meio líquido.
  2. Sedimentar as leveduras durante 5 min a 4000 xg e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em tampão de ressuspensão adequado (a partir do respectivo kit miniprep de ADN plasmídico) e transferi-lo para um tubo fresco reacção de 2.0 ml. Adicionar 100 mL de pérolas de vidro lavadas com ácido (425- 600 mícrons de diâmetro) e mistura-se vigorosamente durante 5 min.
  3. Adicionar o respectivo tampão de lise e prosseguir com a purificação de plasmídeo utilizando um kit de mini-preparação de plasmídeo seguindo as instruções do fabricante. Elui-se o ADN de plasmídeo com 50 ul de água.
  4. Utilizar o ADN a partir do passo 8.3 para uma reacção de sequenciação com o iniciador específico do plasmídeo presa, GAL4ADseqref "> 41 5'- ACCACTACAATGGATGATG -3 '.
  5. Verificar a interação por de novo co-transformando 43, 44 a isca eo vetor presa. Seleccione a levedura transformada em placas de seleção-SD-trp-Leu His-ade.

Resultados

Antes da tela Y2H real pode ser realizada a isca deve ser testada para a auto-activação. Isto é conseguido através da transformação do vector de expressão de isca em conjunto com o vector vazio biblioteca presa e verificar o crescimento em placas selectivas.

Para analisar se o ATP_00189 proteína phytoplasmal é auto-activação, o teste de auto-ativação foi realizada como descrito no capítulo 5. O plasmídeo isca está complementando o trp ea presa plasmídeo a auxotrofia leu de S. cerevisiae NMY51 40. Um co-transformação bem sucedida é assim caracterizada por crescimento em placas selectivas e falta Trp Leu. Interação da isca e uma proteína presa leva a uma complementação do seu e ade auxotrofia de NMY51. Se a auto-activação da isca na ausência de uma interacção parece, a levedura cresce em placas selectivas e a sua falta ADE. auto-fortes e fracosactivação pode ocorrer. auto-activação forte da isca é caracterizada por um crescimento da levedura co-transformadas em placas de selecção Trp-Leu-His-ade empobrecido. auto-activação fraco leva ao crescimento em Trp-Leu-His mas não em placas de selecção Trp-Leu-His-ade empobrecido. controlos positivos adequados são indispensáveis ​​para a interpretação dos resultados do ensaio de auto-ativação. Um resumo dos resultados esperados do ensaio de auto-activação e a sua interpretação é fornecida na Tabela 1 e visualizado na Figura 1.

figure-results-1637
Figura 1: Exemplo de Isca testes de auto-ativação de uma isca antes de executar uma tela Y2H. S. cerevisiae NMY51 foi co-transformada com interagindo isca (Plex-p53) e presa (PACT-larget) como um controlo positivo (painel esquerdo: ac), uma fraca auto-ativação, mais uma presa vazia libravector ry (painel do meio: df) e uma isca não é auto-ativação, mais um vector de biblioteca presa vazio (painel direito: gi). A levedura co-transformadas foram cultivadas em placas de SD falta trp e leu (painel superior: a, d, g), Trp, Leu e seu (painel do meio: b, E, H) e Trp, Leu, His e ade (inferior painel: C, F, I). Selecção no meio sem trp e leu é um controlo positivo para a co-transformação bem sucedida, tal como o vector isco complementa a auxotrofia trp e o vector presa a auxotrofia de NMY51 Leu (crescimento em SD-Trp-Leu). Em caso de uma interação entre a isca e presa ou uma auto-ativação da isca, a expressão repórter de NMY51 está ligado e complementa o dele e auxotrofia ade (crescimento em SD-trp-leu-a-ade). Uma fraco de auto-activação é caracterizado por um crescimento em SD-Trp-Leu-suas placas (painel do meio, DF). auto-ativação fraca de uma isca deve ser diminuída prévia para analisar a iscaem uma tela Y2H, por exemplo, adicionando 3-AT para a mídia seletiva. esgotamento de aminoácidos são indicados com "-", no respectivo nome do papel. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

pLexA-N-atp00189 Nenhum colónias nenhum crescimento nenhum crescimento nenhum crescimento nenhum crescimento
Nenhum pGAD-HA nenhum crescimento colónias nenhum crescimento nenhum crescimento nenhum crescimento
pLexA-N Nenhum colónias nenhum crescimento nenhum crescimento nenhum crescimento nenhum crescimento
pLexA-N pGAD-HA colónias colónias colónias nenhum crescimento nenhum crescimento
pLexA-p53 pacto de larget colónias colónias colónias colónias colónias
pLexA-N-atp00189 pGAD-HA colónias colónias colónias nenhum crescimento nenhum crescimento

Tabela 1: Resultados esperados em um ensaio de auto-ativação isca. A transformação de S. cerevisiae NMY51 produz no crescimento diferencial em meios selectivos com base nas características de isca co-transformado e presa. O crescimento em placas selectivas foi avaliada mediante a transformação de diferentes combinações de vectores (AF) após 72 h de incubação a 30 ° C. auto-activação fraco é caracterizado pelo crescimento de levedura em SD-Trp-Leu-His e auto-activação forte por crescimento em SD-Trp-Leu-His-ade plat selecçãoes na ausência de um parceiro de interação. O pLexA-N phytoplasmal codificado efectora ATP_00189 não exibem auto-activação, que se caracteriza pela incapacidade do vector isco transformado NMY51 para crescer na ausência da sua e ade.

Dependendo do isco, uma tela Y2H pode obter numerosos clones de levedura que crescem em placas selectivas. Todos os clones devem ser analisados ​​e verificados para possíveis redundâncias. Mesmo se uma biblioteca de cDNA normalizada foi usado, é muito provável que um interactor é representado em muitos clones diferentes. Dependendo da técnica de clonagem de biblioteca, é também possível que apenas os fragmentos do gene completo, são inseridos em vectores de algumas presas. Assim, é aconselhável para amplificar de novo (a partir de ADNc) e subclonar o gene de comprimento completo do interactor e para testar a interacção de uma análise Y2H um-para-um (Figura 2).

figure-results-6202
Figura 2: Exemplo de uma interação entre Bait and Prey Em um experimento Y2H. Uma tela de levedura de dois híbridos (Y2H) foi realizado e os plasmídeos dos clones positivos foram purificados interactors. O vector presa foi sequenciado e foram identificados os Malus x domestica parceiros de interacção hospedeiro MdTCP24 e MdTCP25. Como um controlo negativo MdTCP34 (para os quais não foi identificado interactor no rastreio da biblioteca Y2H) foi subclonado em paralelo. Os genes de comprimento total foram amplificados a partir de ADNc de maçã, subclonado no vector de presa (co-cistronically expressando o domínio AD activação) e de novo co-transformada com o vector isco expressando o ATP_00189 efectora bacteriana acoplado ao domínio de ligação ao ADN (BD). Este valor é retirado a partir de 28. Por favor clique aqui para ver uma maiorversão desta figura.

Discussão

Na tela de Y2H, a proteína efectora potencial é co-expressa com diferentes proteínas que interagem hipotéticas (passo 7). Cada clone de levedura crescendo contém a isca, mas um (potencialmente) interagente diferente. As proteínas que interagem são codificados numa biblioteca de ADNc que foi clonada em plasmídeos de presa. A isca ea presa plasmídeos cada código de co-cistronically para uma parte de um factor de transcrição de levedura. No caso de uma interacção física entre o isco (efector) e um interactor codificada pelo plasmídeo presa, as duas partes do factor de transcrição (o domínio de ligação de ADN e o domínio de activação) são unidos, e a expressão do gene repórter é induzida. A levedura é capaz de crescer em placas de selecção SD histidine- e empobrecido-adenina. O tipo de biblioteca de ADNc de presa é dependente do efector rastreados e devem ser escolhidos em conformidade. O vector isco e presa, assim como a estirpe de levedura, devem ser compatíveis. Nesta tela, o domínio ea domai activação Gal4 de ligação a DNA LexAN foram utilizados como as unidades do factor de transcrição de levedura compatíveis. A biblioteca de cDNA podem ser construídos individualmente, feito à medida, ou obtidos comercialmente. A preparação da biblioteca presa cDNA não faz parte do presente protocolo. Neste protocolo, uma biblioteca de cDNA normalizada auto-construídas a partir do ARN das folhas domestica x Malus foi usada e clonado em pGAD-HA 41. O efector (isca) -expressing estirpe de levedura foi transformada com a biblioteca de presa, e os clones foram seleccionados em placas de selecção SD histidine- e empobrecido-adenina. Para extrair ADN de plasmídeo a partir das colónias de levedura, um plasmídeo de DNA Mini Kit à base de coluna para as bactérias é recomendada em combinação com um passo de ruptura mecânica utilizando esférulas de vidro para melhorar a lise de levedura (passo 8). Neste purificação do plasmídeo, a isca e o vector presa serão purificados simultaneamente em concentrações relativamente baixas. No entanto, a quantidade de DNA de plasmídeo é suficiente para identificar o parceiro de interacção através de sequenciação witHout propagação plasmídeo antes (passo 8.4). Como alternativa, o ADN purificado no passo 8.4 pode ser transformado em competentes de E. coli e com a resistência aos antibióticos seleccionados mediada por vector de presa (por exemplo, ampicilina no caso de o pGAD-HA). A E. coli seleccionada colónias transportar apenas o plasmídeo biblioteca pGAD-HA, e a purificação do plasmídeo de alto rendimento podem ser realizadas com estes clones.

A transformação bem-sucedida de construções pLexA-N e pGAD-HA complementa o triptofano e leucina auxotrofia de NMY51. Uma interacção entre o efector e uma proteína (codificada no pGAD-HA) conduz à activação do sistema repórter em estirpes NMY51. No caso de auto-activação, NMY51 transformada com o efector expressando pLexA-N em combinação com o vector de biblioteca vazio pGAD-HA cresce em placas selectivas falta Trp-Leu-His-ade, devido à activação indesejada do sistema repórter NMY51 40. A auto-ativação pode ser wEAK e pode ocorrer na ausência de Trp-Leu-His, ou a activação pode ser forte e caracteriza-se por crescimento em placas de Leu-Trp-His-ade 41. Auto-ativação pode causar um fundo maciço de clones falso-positivos na tela Y2H real. Para evitar isso, deve ser realizado um teste de auto-activação com a isca, em que o vector que expressa efectora é co-transformada com o vector vazio biblioteca. Nesta configuração experimental, a expressão do gene repórter não deve ser induzido. Se o auto-activação (isto é, crescimento em placas selectivas) é visível no teste, o meio pode ser suplementado com diferentes concentrações de 3-amino-1,2,4-triazole 45 (3-AT). 3-AT é um inibidor da desidratase imidazoleglycerol-fosfato (HIS3), uma enzima importante na biossíntese de histidina 46. A suplementação com 3-AT pode reduzir os efeitos fracos de auto-activação durante 47 Y2H telas,48. Diferentes concentrações de 3-AT deve ser testado. Neste protocolo, 1 - foram utilizados 40 mM 3-AT. A concentração mais baixa que leva à repressão da auto-ativação deve ser posteriormente utilizado na tela de Y2H. As placas selectivas do ensaio de auto-activação só pode ser avaliada, se as placas de SD-Trp-Leu do co-transformação contêm um número suficiente de clones. Como uma indicação ≥ 500 colónias por 90 mm (diâmetro) placa de Petri são suficientes. Para determinar a eficiência de transfecção exacta, recomenda-se para preparar diluições em série de levedura co-transformadas e espalhá-los em placas de SD-Trp-Leu.

Para reduzir a auto-activação, o efector pode ser clonado pLexA-C, um vector de expressão de isca que funde a etiqueta de LexA para o C-terminal da proteína. A orientação do Lex-A tag pode atenuar auto-ativação 24. No entanto, isso não é possível em todos os casos para reduzir ou abolir a auto-activação. A formação decolónias vermelhas ou avermelhadas indica uma interação fraca ou falso-positivo. O gene repórter de ADE2 NMY51 só é activada quando se trata de uma interacção proteína-proteína, o que por sua vez bloqueia a acumulação de um corante vermelho nesta estirpe de levedura 40. Na ausência de interacção, NMY51 são avermelhada, enquanto que as colónias possuindo interactores fortes são brancos. A observação da cor das colónias nas placas de selecção proporciona, assim, uma outra sugestão importante para avaliar se as respectivas colónias são interactores ou verdadeiro-falso-positivos.

É, eventualmente necessário adaptar ou modificar certas configurações de ensaio no que respeita à natureza do isco e as características de interacção. Até agora, um certo número de melhoramentos e técnicas de derivados do Y2H comum foram estabelecidas para permitir a análise de interacções entre proteínas bastante difíceis em diferentes sistemas hospedeiros. A revisão por Stynen et al. 49 endereços de umnd descreve diferentes aspectos da Y2H, suas melhorias e adaptações, e, portanto, fornece informações úteis sobre como escolher o ensaio de interação adequada.

telas y2h e técnicas derivados tornaram-se amplamente utilizado em diferentes campos de pesquisa, onde é necessária a identificação de interações proteína binários. Mesmo se os controles críticos sejam executadas, tais como testes de auto-ativação da isca e um-para-um re-transformações das proteínas que interagem identificados, a Y2H é propenso a produzir falsos resultados 26, 50, 51. A levedura como um modelo não é adequado para todos os estudos de interacção. Levedura não constitui necessariamente um ambiente celular que suporte a modificação pós-tradução adequada e dobrável para todas as proteínas 24. Além disso, na configuração Y2H, as proteínas são sobre-expressos, e a sua expressão não é controleliderados por seu promotor natural. O Y2H obriga os parceiros de interacção proteicos para o núcleo, o qual não é necessariamente o seu destino subcelular natural. As circunstâncias celulares nativas da interação, portanto, não pode ser refletida pela levedura e pode levar a resultados falso-negativos ou falso-positivos. A maior parte são baseados em Y2H complementação levedura auxotrofia como princípio selectivo. Esta selecção nutricional caracteriza-se por sensibilidade elevada, mas à custa da diminuição da selectividade em comparação com outros (por exemplo, repórter cromogénico) ensaios 49. Se o auto-activação unreducible (ver acima) ou outras limitações ocorrer durante um certo efectora, o Y2H não é um ensaio apropriado 25. Na Tabela 1 e na Figura 1, os resultados esperados do teste de auto-activação são dadas. A ausência de interacções real (isto é, os falsos negativos) pode ser causado pela toxicidade da proteína, a proteína de translação incorrectaprocessamento, o impedimento estereoquímico da interacção, parceiros de interacção sub-representados na biblioteca de presa, a localização da membrana da isca, em falta ou componentes necessários para a interacção 24.

Recomenda-se de novo amplificar o gene de comprimento total da proteína que interage identificados a partir de ADNc, subclonar-lo em pGAD-HA, e realizar um ensaio de interacção de um-para-um, transformando o gerado pGAD-HA arquétipo na isca que expressam estirpe NMY51. Isto é necessário uma vez que a observada interactor presente na biblioteca de presa pode ser apenas um fragmento de uma proteína maior. No entanto, a informação para o respectivo gene completo somente é acessível se considerável de dados de sequência genômica e transcriptomic está disponível. O protocolo de transformação para o ensaio de auto-activação descrito aqui pode ser aplicado para um tal ensaio de um-para-um, e a interacção entre a isca e interactor deve ser reprodutível.

Interações identificados em uma tela Y2H deve sempre ser confirmado por uma outra técnica independente. Esta técnica independente deve estar mais perto do cenário natural da interação proteína-proteína real. No caso do ATP_00189 phytoplasmal efetoras, a interação com os fatores de transcrição TCP de Malus x domestica foi verificada in planta com complementação fluorescente bimolecular (BiFC) em Nicotiana benthamiana protoplastos 28 (não faz parte deste protocolo). O ATP_00189 proteínas efetoras foi derivado da planta patógeno P. mali. Em BiFC planta foi assim escolhido para verificar as interações ATP_00189 com os fatores de transcrição x Malus domestica anteriormente identificada na Y2H 28. BiFC é um ensaio de interacção proteína-proteína que não requer a translocação subcelular das proteínas que interagem para o núcleo, a fim de activar o sistema repórter 52. Além disso, as in planta de expressão e de máquinas modificação imita o ambiente da interação natural entre o efetoras bacteriana planta em sua planta hospedeira. No entanto, uma tela global, utilizando BiFC não é viável.

Existem várias etapas no protocolo que deve ser cuidadosamente abordada. Ao amplificar o gene de interesse (Passo 4), é importante excluir a possibilidade de os iniciadores se ligam a DNA da planta. Assim, o ADN a partir de plantas não-infectadas deve ser incluído como um controlo negativo. A sequência do gene de interesse não tem de conter os locais de restrição EcoRI e Sall que são usados ​​para a clonagem direccional do inserto. Se a sequência não conter estes locais, diferentes enzimas de restrição para a clonagem deve ser escolhido. transformação de levedura é um método central durante este protocolo. A eficiência de transfecção depende da competência das células de levedura, a sua viabilidade, o estado de crescimento, e a qualidade do Reag transfecçãoent 53, 54. Para o protocolo proposto, é altamente recomendado o uso de leveduras a partir de placas frescos não mais de duas semanas (mantida a 4 ° C) ao realizar as transformações. Muitas vezes, o crescimento de leveduras transformadas é retardada quando as culturas líquidas selectivos são inoculados com as colónias de placas de agar de idade. É também útil utilizar uma cultura de arranque de líquido como um inoculo para as experiências reais e não usar a levedura directamente a partir da placa. Baixa eficiência quando transfecção da presa em levedura expressando isca pode levar à sub-representação de certas proteínas da presa (potenciais interatores) e pode, assim, deforme toda a tela. Neste protocolo, a eficiência de transfecção de levedura de ~ 150.000 ufc / g de ADN transfectado no Y2H funcionou bem.

Conhecer as falhas e os inconvenientes da técnica Y2H e interpretar os resultados de forma crítica e adequada é indispensável para desenhar o correct conclusões. ensaios Y2H e os seus derivados têm sido utilizadas há muitos anos e têm sido objecto de muitas melhorias e adaptações no que respeita às diferentes características de isco, a localização subcelular da interacção, os parceiros de ligação esperados, e outros factores que possam ser necessários para a interacção (ver Y3H 55, 56, 57). Recentemente, telas Y2H baseadas em matrizes que têm sido desenvolvidos para permitir a análise automatizada, de alto rendimento de numerosas iscos contra milhões de presas 58. O futuro provavelmente reside nas abordagens de automatização e de alto rendimento para este ensaio para permitir a elucidação das vias de sinalização complexas e interactoma em diferentes áreas de investigação.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, e Florian Senoner do Centro de Pesquisa Laimburg e Mirelle Borges Dias Schnetzer de Dualsystems Biotech AG para apoio técnico e Julia Strobl pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi realizado como parte do projeto APPL2.0 e foi parcialmente financiado pela Província Autónoma de Bozen / Bolzano, Itália e Apple Consórcio Sul tirolesa.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)ApplichemA6284for DNA preparation
Trishydroxymethylaminomethane (Tris)ApplichemA2264for media and buffer
Sodiumchloride (NaCl)ApplichemA2942for media and buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)ApplichemA2937for media and buffer
N-Lauroylsarcosin sodium saltApplichemA7402for DNA preparation
ammonium acetate Sigma-Aldrich (Fluka)9688for DNA preparation
2-mercaptoethanolApplichemA1108for DNA preparation
Isopropanol (2-Propanol)ApplichemA3928for DNA preparation
EthanolSigma-Aldrich (Fluka)51976for DNA preparation
RNAseApplichemA2760for DNA preparation
Chloroform:Isoamyl 24:1ApplichemA1935for DNA preparation
Proofreading Polymerase (e.g. iProof)Bio-Rad203433for PCR
EcoRIThermo ScientificER0271for cloning
SalIThermo ScientificER0641for cloning
Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)Qiagen28104for cloning
Kanamycin SulfateApplichemA1493for microbiological selection
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)Sigma-AldrichA8056for self-activation assay
L-Arginine Monohydrochloride ApplichemA3680for yeast culture
L-Isoleucine ApplichemA3642for yeast culture
L-lysine Monohydrate ApplichemA3448for yeast culture
L-Methionine ApplichemA3897for yeast culture
L-Phenylalanine ApplichemA3464for yeast culture
L-Threonine ApplichemA3946for yeast culture
L-Tyrosine ApplichemA3401for yeast culture
L-UracileApplichemA0667for yeast culture
L-Valine ApplichemA3406for yeast culture
L-Adenine Hemisulfate Salt ApplichemA1596for yeast culture
0.22 µm Pore FilterSartorius16541for sterile filtration
L-Histidine MonohydrochlorideApplichemA3719for yeast culture
L-Leucine ApplichemA3496for yeast culture
L-Tryptophane ApplichemA3410for yeast culture
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich51483for yeast culture
D-Glucose Monohydrate ApplichemA1349for yeast culture
AgarFisher ScientificBP2641-1for yeast and bacteria culture
PeptoneApplichemA2208for yeast culture
Polyethylene Glycol 4000 (PEG)ApplichemA1249for yeast transformation
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)ApplichemA3478for yeast transformation
Salmon Sperm DNA ApplichemA2159for yeast transformation
Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)Millipore06-719for Western blot
Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)Sigma-AldrichPLN350for plasmid purification from yeast and bacteria
Acid Washed Glass BeadsSigma-AldrichG8772for plasmid purification from yeast
Ampicillin Sodium SaltApplichemA0839for microbiological selection
Yeast ExtractApplichemA1552for yeast culture
Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)EppendorfZ368245 (Sigma)for DNA preparation
Bait vector (e.g. pLexA-N)DualsystemsP01004for Y2H
Prey vector (e.g. pGAD-HA)DualsystemsP01004for Y2H
Control prey vector (e.g. pLexA-p53)DualsystemsP01004for Y2H
Control bait vector (e.g. pACT-largeT)DualsystemsP01004for Y2H
Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)InvitrogenC640003for cloning
Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)DualsystemsP01004for Y2H
Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)Sigma-AldrichP7793-1EAfor yeast and bacteria culture
Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)Greiner676 051for yeast culture
PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)Bio-Rad1861096for PCR
quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)Bio-Rad1855195for quantitative PCR
Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)Eppendorf5417 Rgeneral lab equipment
Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)Eppendorf5804 Rgeneral lab equipment
Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)5Prime2500010for PCR and DNA works
ScalpellSwann-Morton0301for DNA preparation
Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone))VWR-International514-0073 (European Catalogue number)for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 90 mm Greiner Bio-One633180for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 150 mm Greiner Bio-One639161for yeast culture
Photometer (e.g. BioPhotometer)Eppendorf550507804for yeast culture
Photometer CuvettesBrand759015for yeast culture
Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)MemmertWB7for yeast transformation
Western Blot EquipmentBio-Raddiversefor protein detection
dNTPs5Prime2201210for cloning
Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)Sigma AldrichZ232793, Z232858, Z232866for yeast and bacteria culture
Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)GFL3031for yeast and bacteria culture
IncubatorBinderKB 53 (E3.1)for yeast and bacteria culture
Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)OmniwashIF 825general lab equipment
0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)Eppendorf0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)general lab equipment
Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 µl)Eppendorfdiversegeneral lab equipment
SpreaderSigma-AldrichSPR-L-S01for yeast and bacteria culture
Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)IKA3617000general lab equipment
T4-LigaseThermo FisherEL0011for cloning
Fridge (4°C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)Liebherr81.767.580.4general lab equipment
Freezer (-20°C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)LiebherrG5216general lab equipment
Graduated Cylinder (e.g. Brand)Sigma AldrichZ327352; Z327417; Z327441  general lab equipment
Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)Thermo FisherS55701for yeast and bacteria culture
Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)Integra-Biosciences155000general lab equipment
Cuvettes for Electroporation (1 mm)Molecular Bio Products5510-11for bacteria transformation
Electroporator (e.g. Eporator)Eppendorf4309000019for bacteria transformation
Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)Bio-Rad1708280general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)VWR-International 525-0403 (European Catalogue number)general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)BD Falcon352096general lab equipment
Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)Thermo ScientificP2325for ligation
adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))Ambion AM8110G (distributed by Thermo Scientific)for ligation
Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)Sigma-AldrichY2021 Sigma for yeast culture (ready-made mix)

Referências

  1. Fields, S., Song, O. -. K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Dombrosky-Ferlan, P. -. M., Corey, S. -. J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
  3. Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
  4. Lee, H. -. J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
  5. Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
  6. Kumar, A., Godwin, J. -. W., Gates, P. -. B., Garza-Garcia, A. -. A., Brockes, J. -. P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
  7. Park, S. -. Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
  9. Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
  10. Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
  11. Young, K. -. H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
  12. Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
  13. Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
  14. McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
  15. Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
  16. Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22 (2013).
  17. Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
  18. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
  19. Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -. J. -. M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
  20. Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
  21. Tseng, T. -. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
  22. MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835 (2014).
  23. Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
  24. van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
  25. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  26. Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
  27. Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
  28. Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors - a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
  29. Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
  30. Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
  31. Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
  32. Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423 (2002).
  33. Applichem. . N-Lauroylsarcosine sodium salt. , (2015).
  34. Applichem. . 2-Mercaptoethanol. , (2015).
  35. Applichem. . 2-Propanol. , (2015).
  36. Applichem. . Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , (2015).
  37. Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
  38. Applichem. . Kanamycin sulfate. , (2015).
  39. Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
  40. Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , 1917-1952 (2008).
  41. . Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit - Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
  42. Kurien, B. -. T., Scofield, R. -. H. . Protein Blotting and Detection. , (2009).
  43. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  44. . . Yeast Transformation and Cloning. , (2016).
  45. Sigma-Aldrich. . 3-Amino-1,2,4-triazole. , (2016).
  46. Ames, B. -. N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
  47. Joung, J. -. K., Ramm, E. -. I., Pabo, C. -. O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
  48. Brennan, M. -. B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
  49. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  50. Hengen, P. -. H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
  51. Vidalain, P. -. O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
  52. Pattanaik, S., Werkman, J. -. R., Yuan, L., Yuan, L., Perry, E. S. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 185-193 (2011).
  53. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
  54. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  55. Bernstein, D. -. S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
  56. Stumpf, C. -. R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
  57. Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
  58. Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Infec oEdi o 119levedura de dois h bridosY2Hbact riasfitoplasmaauto ativa oefetorasintera o prote na prote na

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados