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Resumo

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo para a análise qualitativa e quantitativa das sinapses imunes entre primárias células T humanas e células apresentadoras de antígeno. O método baseia-se na imagem citometria de fluxo, que permite a aquisição e a avaliação de várias imagens de milhares de células dentro de um período relativamente curto de tempo.

Resumo

A sinapse imunológica é a área de comunicação entre as células T e células apresentadoras de antígeno (APCs). Células T polarizar a receptores de superfície e proteínas para a sinapse imunológica para assegurar uma ligação estável e troca o sinal. Microscopia confocal, TIRF ou super-resolução clássica têm sido utilizados para estudar a sinapse imunológica. Uma vez que esses métodos exigem a aquisição de imagem manual e quantificação demorada, a imagem de eventos raros é um desafio. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho que permite a análise morfológica de dezenas de milhares de células. Imune as sinapses são induzidas entre as células T humanas primárias em preparações de panleucócitos e as células Raji B SEB-carregado de enterotoxina Staphylococcus aureus como APCs. Aquisição de imagens é realizada com imaging citometria de fluxo, também chamada de microscopia em fluxo, que combina características de um citômetro de fluxo e um microscópio de fluorescência. Uma estratégia completa associada para identificar a célula T/APC casais e analisando as sinapses imunes é fornecida. Como esse fluxo de trabalho permite a análise de imune sinapses nos preparativos do panleucócitos impuro e, portanto, requer apenas um pequeno volume de sangue (ou seja,, 1 mL), pode ser aplicado a amostras de pacientes. Importante, várias amostras podem ser preparadas, medidas e analisadas em paralelo.

Introdução

As células T são importantes reguladores do sistema imune adaptativo e são ativadas através de peptídeos antigênicos que são apresentados no contexto dos complexos de histocompatibilidade (MHC). Ativação de células T completa requer dois sinais, o sinal de competência através do receptor de células T antígeno-específicos (TCR) / CD3 complexo e o sinal de co-estimulação via receptores acessórios. Ambos os sinais são gerados através da interação direta de células T com apresentadoras células (APCs). APCs maduros fornecem o sinal de competência para a ativação de células T através dos complexos peptídeo-MHC, e expressam a co-estimulação ligantes (por exemplo,, CD80 ou CD86) para garantir a progressão da ativação de células T1. Uma função importante de costimulation é o rearranjo do citoesqueleto de actina2,3,4. A F-Actina cortical é relativamente estática no repouso de células T. Estimulação de células T através do antígeno-rolamento APCs leva a uma profunda reorganização do citoesqueleto de actina. Dinâmica de actina (ou seja,, actina rápida polimerização/despolimerização círculos) permite que as células T criar as forças que são usadas para o transporte de proteínas ou organelas, por exemplo. Além disso, o citoesqueleto de actina é importante para o desenvolvimento de uma zona especial de contato entre as células T e APCs, chamados de sinapse imunológica. Devido à importância do citoesqueleto de actina para o sinapse imunológica, tornou-se essencial desenvolver métodos para quantificar alterações do citoesqueleto de actina de T células5,6,7,8 , 9.

Através da ajuda do citoesqueleto de actina, receptores de superfície e proteínas de sinalização são segregadas em clusters de activação supramoleculares (SMACs) dentro da sinapse imunológica. A estabilidade da sinapse imunológica é assegurada pela ligação dos receptores para pacotes de F-Actina que aumentam a elasticidade do citoesqueleto de actina. Formação de sinapse imunológica foi mostrada para ser crítico para a geração das respostas imune adaptativas. Os efeitos nocivos de uma formação de sinapse imune defeituoso em vivo primeiro foram realizados em pacientes que sofrem de Wiskott Aldrich síndrome (WAS), uma doença na qual polimerização da actina e, concomitantemente, a formação de sinapse imunológica são perturbados10 . FOI de pacientes podem sofrer de eczema, infecções recorrentes graves, doenças auto-imunes e melanomas. Apesar desta constatação, atualmente não se sabe se a formação de sinapse imunológica diferente nas células T de indivíduos saudáveis e pacientes que sofrem de defeitos imunes ou doenças auto-imunes.

Microscopia de fluorescência, incluindo confocal, TIRF e microscopia de super-resolução, foram usados para descobrir a arquitectura do sinapse imunológica11,12,13,14. A alta resolução desses sistemas e a possibilidade de realização de imagem latente da viver-pilha permite a recolha de informações exatas, espaço-temporais sobre o citoesqueleto de actina e proteínas intracelulares ou superfície na sinapse imunológica. Muitos resultados, no entanto, baseiam-se na análise de apenas algumas dezenas de células T. Além disso, as células T devem ser purificadas para estes tipos de microscopia de fluorescência. No entanto, para muitas perguntas de pesquisa, o uso de células impuro, ao invés da resolução mais alta possível é de extrema importância. É relevante se as células T de pacientes são analisadas, desde que a quantidade de sangue doado é limitada e pode haver a necessidade de processar muitas amostras em paralelo.

Nós estabelecemos métodos microscópicos que permitem a análise do citoesqueleto de actina na sinapse imunológica no sistema humano15,16,17. Estes métodos baseiam-se na imagem de citometria de fluxo, também chamada de fluxo em microscopia18. Como um híbrido entre multiespectrais fluxo cytometry e fluorescência microscopia, citometria de fluxo de imagem tem seus pontos fortes na análise de parâmetros morfológicos e a localização da proteína em populações de células heterogêneas, tais como panleucócitos do sangue periférico. Introduzimos uma metodologia que nos permite quantificar a F-Actina em conjugados de T-celular/APC de células T humanas de amostras de sangue total, sem a necessidade de etapas de purificação demorada e dispendiosa17. A técnica aqui apresentada compreende o fluxo de trabalho inteiro, de obter a amostra de sangue para a quantificação de F-Actina na sinapse imunológica.

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Protocolo

1. preparação do Panleucócitos

  1. Empate 1 mL de sangue periférico de um doador saudável (ou paciente) em uma seringa heparinizada. Certifique-se de ter a aprovação pelo Comitê de ética responsável para a doação de sangue.
  2. Misturar 1 mL de periférico humano com 30 mL de tampão de Lise ACK (150mm NH4Cl, 1mm KHCO3e 0,1 mM EDTA, pH 7,0) em um tubo de 50 mL de sangue e incubar durante 8 min à temperatura ambiente.
  3. Encha os tubos com PBS e centrifugar x 300 g por 6 min. Aspire o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 30 mL de tampão de Lise ACK.
  4. Repita as etapas de 1.2 e 1.3 até que o sobrenadante é claro. Finalmente, lave as células em PBS, centrifugar x g por 6 min à temperatura ambiente e ressuspender as células em 2 mL de meio de cultura (RPMI1640 + 10% FCS). Incube as células a 37 ° C por 60 min.

2. carregamento do Raji células com SEB

  1. Prepare dois tubos Falcon de 15ml com 1,5 x 106 células Raji por tubo. Gire para baixo as células (300 x g durante 6 min à temperatura ambiente) e descartar o sobrenadante.
  2. Ressuspender as células em meio residual (aproximadamente 50-100 µ l), adicionar 1,9 µ l (1,9 µ g) SEB e incubar a temperatura ambiente por 15 min. adicionar 5 mL de meio de cultura, spin para baixo as células (300 x g durante 6 min à temperatura ambiente) e resuspenda o pellet em meio de cultura (RPMI 1640 + 10% FCS) com uma densidade de 1 x 106 células/mL.

3. indução de sinapses imunes e mancha o protocolo

  1. Pipete 500 µ l da preparação de células Raji SEB-carregado em um tubo de FACS e 500 µ l da preparação de descarregado células Raji em outro tubo de FACS. Adicione 650 µ l de panleucócitos a cada tubo e spin-down as células (300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente). Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 150 µ l de meio de cultura (RPMI1640 + 10% FCS). Incube a 37 ° C (normalmente por 45 min).
  2. Vórtice suavemente as células (10 s a 1.000 rpm) e adicione 1,5 mL de paraformaldeído (1,5%) durante o vórtice para consertar as células. Pare a fixação adicionando 1 mL de PBS + 1% de BSA. Sedimento das células (x g durante 10 minutos a temperatura ambiente e ressuspensão o centrifugado em 1 mL de PBS + 1% de BSA após incubação à temperatura ambiente por 10 min.
  3. (300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente) de pelotas e ressuspender as células em 100 µ l de PBS + 1% de BSA + 0,1% saponina durante 15 minutos à temperatura ambiente para permeabilize as células (placa de 96 poços, em forma de U).
  4. Lavar as células em PBS + 1% de BSA + 0,1% saponina com centrifugação (300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente) e ressuspender as células em 50 µ l de PBS + 1% de BSA + 0,1% saponina contendo anticorpos fluoróforo-rotulados ou compostos (CD3-PE-TxRed (01:30), Phalloidin-AF647 (1:150) e DAPI (1:3, 000)).
  5. Incube as celulas em temperatura ambiente no escuro por 30 min. lavar as células 3 vezes, adicionando 1 mL de PBS + 1% de BSA + 0,1% saponina. Centrifugar a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Re-Ressuspender as células em 60 µ l de PBS por citometria de fluxo de imagem.

4. imagem aquisição usando um citômetro de fluxo

Nota: A seguinte imagem aquisição procedimento e análise de dados baseiam-se na imagem de citometria de fluxo, usando o software como imagestream (IS100), INSPIRE e ideias. No entanto, outro software de cytometers e análise de fluxo também pode ser usado.

  1. Abra o software de análise no computador conectado para o citômetro de fluxo de imagens e clique em inicializar Fluidics do menu instrumento. Aplicam-se os grânulos na porta direita, quando solicitado a fazê-lo.
  2. Carregar o modelo padrão do menu arquivo e clique em executar/Setup. Escolha grânulos no menu suspenso de vista.
  3. Ajuste o iluminador brilhante-campo clicando na intensidade de definir se o valor indicado for inferior a 200.
  4. Executar a calibração e teste de rotina na aba Assist clicando em Iniciar todos.
  5. Clique em carga/descarga/Lock e aplicar as amostras na porta à esquerda, quando solicitado a fazê-lo. Depois de carregar as células no citômetro de fluxo, abra o classificador de célula e ajustar os valores da seguinte forma: limite superior intensidade de pico em 1.022 para cada canal, pico intensidade limite inferior aos 50 para canal 2 (DAPI) e canal 5 (TxR-CD3-Pe), limite inferior de área em 50 para canal 1 (dispersão de lado) e o limite superior em 1.500.
  6. Mudar a potência do laser de excitação a 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) e 647 nm (90 mW) no guia de instalação.
  7. Alterne o dropdown menu Exibir entre células e grânulos para avaliar os ajustes de potência de célula classificador e laser.
    Nota: Certifique-se de que todas as células e célula casais encontram-se a exibição de célula e que aglomerados de células, detritos e imagens com pixels saturados são encontradas na exibição de detritos, alterando os classificadores de célula e/ou os poderes do laser de excitação.
  8. Defina o nome da amostra e a quantidade de imagens para adquirir (15.000-25.000 para amostras) e 500 para controles de compensação na guia configuração, clique em executar/Setup para iniciar a aquisição.

5. análise de dados

  1. Transferir os arquivos de imagem raw (.rif) para o computador de análise de dados e abrir o software de análise.
  2. Produzir uma matriz de compensação, seguindo as instruções da lista pendente de compensação. Salve a matriz de compensação como comp_Date.ctm.
  3. Abrir um arquivo de imagem raw de amostra (.rif) e aplique o comp_Date.ctm na janela que aparece produzir arquivos de imagem de compensado (ID_de_Componente) e o arquivo de análise de dados de padrão (.daf).
  4. Abra o arquivo de imagem de compensado. Converter as imagens para o modo de cor e ajustar as tabelas de pesquisa para obter óptimas cores visíveis na barra de propriedades da Galeria de imagem. Obter uma imagem RGB-mesclado usando a guia composta de barra de ferramentas Propriedades da Galeria de imagem.
  5. Abra o Gerenciador de máscara na lista suspensa análise. Crie máscaras para definir as células T e a sinapse imunológica, como segue:
    1. Selecione a máscara de células T: "(preenchimento (Threshold_Ch05, 60)." Selecione a máscara vale: "Valley(Ch02,3)." Selecione a célula T sinapse máscara: "máscara de células T e vale (M02, Ch02, 3)."
  6. Abra o Gerenciador de recurso na lista suspensa análise. Calcule as seguintes características:
    1. Para a total expressão de CD3 em células T, selecione "Intensity_T-cells_Ch5." O montante total de F-Actina nas células T, selecione "Intensity_T-cells_Ch6." Para a expressão de CD3 na sinapse imunológica, selecione "Intensity_T-celular synapse_Ch5." Para a quantidade de F-Actina na sinapse imunológica, selecione "Intensity_T-celular synapse_Ch6."
    2. Para calcular a área de células T, selecione "Area_T-células." Para calcular a área de sinapse imunológica de célula T, selecione "sinapse da célula Area_T."
  7. Determine a F-Actina e CD3 enriquecimento na sinapse imune usando a equação no Gerenciador de recurso:
    figure-protocol-7611
  8. Aplicar a seguinte estratégia associada usando histogramas e ponto parcelas da área de análise (para maiores detalhes, veja referências 17 e 19):
    1. Descarte de células fora de foco plotando a RMS_M2_Ch2"gradiente" em um histograma; Defina o limite aos 15 anos.
    2. Sinopse o CCD versus CD3 intensidade em uma trama de ponto. Defina um portão em eventos CD3-positivo.
    3. Sinopse o "Aspect ratio" de M02 (mancha DAPI) contra a área de M02 (Dapi mancha). Portão em camisolas de células T e células de casais em conformidade. Corrigi para casais de verdadeiras células usando a área da máscara de sinapse, conforme descrito anteriormente,17,19.
    4. Determine a quantidade de F-Actina em camisolas de células T e células T de casais T-celular/APC e a porcentagem de F-Actina na sinapse imunológica.

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Resultados

Dos principais objetivos do método descrito aqui é a quantificação do enriquecimento de proteína (por exemplo,, F-Actina) na sinapse imunológica entre APCs (células Raji) e células T em panleucócitos impuro, tomadas de amostras de sangue humano de baixo volume (1ml) de aluguel. A captura de tela na Figura 1 dá uma visão geral da estratégia associada da crítica desse método. Ele mostra a Galeria de imagens na esquerda e a área de análise à direita...

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Discussão

O fluxo de trabalho apresentado aqui permite a quantificação de imunes sinapses entre as células T humanas (ex vivo) e APCs. Notavelmente, eritrócitos-lysed panleucócitos foram usados como fontes de células T, tornando as etapas de purificação de células T dispensável. A linhagem de células de linfoma de célula B Ribeiro serviu como substituto APCs. Isto traz vantagens significativas, uma vez que permite comparações entre doadores de sangue do lado da sinapse imunológica de célula T. Além disso, a DCs au...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

O trabalho foi financiado pelo Conselho de pesquisa alemã (DFG) com subsídios não. SFB-938-M e SA 393/3-4.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
>Multifuge 3 SRHeraeus
RPMI 1640LifeTechnologies#11875085500 mL
FCSPan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom TubeFalcon#3520545 mL
KulturflascheThermo Scientific#178883
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigmaD8662
Bovine Serum AlbuminRoth#8076.3
SaponinSigmaS7900
ParaformaldehydeSigma Aldrich#16005
FACS Wash SaponinPBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaBSarstedt72.699.0020.5 mL
Speed BeadAmnis#400041
Minishaker MS1IKA Works MS1
MikrotiterplatteGreiner Bio One#65010196U
Enterotoxin SEBSigma AldrichS4881
DAPISigma AldrichD95421:3000
CD3-PeTxRInvitrogenMHCD03171:30
Phalloidin-AF647Molecular ProbesA222871:150
IS100AmnisImaging flow cytometer
IDEASAmnisSoftware
INSPIREAmnisSoftware

Referências

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  2. Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
  3. Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
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  7. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
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