Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

요약

여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.

초록

면역 시 냅 스는 T 세포와 항 원 제시 세포 (Apc) 간의 통신의 영역입니다. T 세포 표면 수용 체와 안정적인 바인딩을 확신 하 고 교류 신호를 면역 냅으로 단백질 분극. 클래식 confocal, TIRF, 또는 슈퍼 해상도 현미경 면역 시 냅 스 연구에 사용 되었습니다. 때문에 이러한 방법을 사용 하려면 수동 이미지 수집 및 시간이 걸리는 정량화, 드문 이벤트의 영상 도전 이다. 여기, 우리 세포의 수천 수만의 형태소 분석을 가능 하 게 워크플로 설명 합니다. 면역 시 냅 스는 Apc로 팬 백혈구 준비에 기본 인간 T 세포와 황색 포도상구균 enterotoxin B 셉 로드 들의 삶 문의 세포 사이 유도. 이미지 수집 이미징 cytometry 라고도 흐름에 현미경 검사 법, 교류 cytometer 및 형광 현미경의 기능을 결합 하 여 수행 됩니다. T 세포/APC 커플 식별 하 고 분석 하는 면역 시 냅 스에 대 한 완전 한 제어 전략은 제공 됩니다. 면역 분석 unpurified 팬-백혈구 준비에 synapses 하며 따라서 작은 양의 혈액이이 허용 (즉,, 1 mL), 환자에서 샘플에 적용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 여러 샘플 준비, 측정, 고 병렬로 분석.

서문

T 세포는 적응 면역 시스템의 주요 규제 하 고 중요 한 조직 적합성 복합물 (MHC)의 맥락에서 제시 하는 항 원 펩 티 드를 통해 활성화 됩니다. 전체 T 세포 활성화 필요 2 개의 신호, 항 원 특정 T 세포 수용 체 (TCR)를 통해 능력 신호 / CD3 복합물 및 액세서리 수용 체를 통해 costimulatory 신호. 두 신호는 항 원 제시와 T 세포의 직접적인 상호 작용을 통해 생성 된 세포 (Apc). 성숙한 APCs MHC 펩 티 드 복합물을 통해 T 세포 활성화에 대 한 적성 신호를 제공 하 고 그들은 costimulatory ligands 표현 (예:, CD80 또는 CD86) T 세포 활성화¹의 진행을 보장 하기 위해서. Costimulation의 1 개의 중요 한 기능 말라 골격^2,,34의 재배치입니다. 대뇌 피 질의 F 걸 T 세포 휴식에서 상대적으로 정적입니다. 항 원-베어링 APCs 통해 T 세포 자극 말라 골격의 심오한 재배치에 지도 한다. 말라 역학 (즉,, 빠른 걸 합/depolymerization 원) T 세포를 만드는 단백질 이나 세포, 예를 들어 전송 하는 데 사용 되는 힘을 사용 합니다. 또한, 말라 골격은 T 세포 및 면역 시 냅 스 라고 하는 APCs 사이 특별 한 연락처 영역을 개발 하기 위한 중요 합니다. 면역 시 냅 스를 말라 골격의 중요성 때문에 그것은 T 세포^5,6,,78 의 말라 골격에 변화를 측정 하는 방법을 개발 하기 위해 필수적인 되고있다 ^{, 9}.

말라 cytoskeletal 원조에 의하여 표면 수용 체와 신호 전달 단백질 supramolecular 활성화 클러스터 (SMACs) 면역 시 냅 스 내에서 차별 됩니다. 면역 시 냅 스의 안정성은 말라 골격의 신축성을 증가 하는 F-말라 번들에 수용 체의 바인딩을 의해 보장 됩니다. 면역 시 냅 스 형성은 적응형 면역 반응의 생성에 대 한 중요 한 것을 보였다. Vivo에서 결함이 있는 면역 시 냅 스 대형의 해로운 효과 했다 깨 달 았에서 Wiskott 올드 리치 증후군 (WAS), 어떤 걸 중 합에는 질병을 고통 받아 환자에서 면역 시 냅 스 형성을 방해 하는 수반, 그리고¹⁰ . 환자는 습 진, 심한 재발 성 감염, 자가 면역 질환, 그리고 정면을에서 고통을 수 있습니다 했다. 이 발견에도 불구 하 고 그것은 현재 알 수 없습니다 면역 결함 또는 자가 면역 질환으로 고통 받는 환자와 건강 한 개인의 T 세포에서 면역 시 냅 스 형성 다릅니다 여부.

형광 현미경 검사 법, confocal 포함, TIRF, 및 최고 해결책 현미경 검사 법, 면역 시 냅 스^11,12,,1314의 아키텍처를 밝히기 위해 사용 되었다. 이러한 시스템의 높은 해상도 라이브 셀 이미징 수행 가능성 말라 골격과 면역 시 냅 스에 표면 또는 세포내 단백질에 대 한 정확한, spatio 시간적 정보 수집 수 있습니다. 그러나 많은 결과, 몇 수십 T 세포의 분석에 근거한 다. 또한, 이러한 유형의 형광 현미경 검사 법에 대 한 T 세포를 정화 해야 합니다. 그러나, 많은 연구 질문에 대 한 unpurified 셀 보다는 가능한 가장 높은 해상도의 사용은 매우 중요. 이것은 환자에서 T 세포는 분석 때문에 헌 혈 된 혈액의 양을 제한 하 고 동시에 많은 샘플을 처리할 필요가 있을 수 있습니다 하는 경우 이다.

우리 인간의 시스템^15,,1617면역 시 냅 스에 걸 골격의 분석을 허용 하는 현미경 방법을 설립 했다. 이러한 메서드는 흐름에 현미경¹⁸라고도 cytometry 이미징 기반으로 합니다. Multispectral 흐름 cytometry 및 형광 현미경 사이의 하이브리드, cytometry 이미징 장점이 그것의 형태학 매개 변수 및 다른 유형의 세포 인구에서 팬 백혈구 등에서 단백질 지역화 분석에 주변 혈액입니다. 우리는 우리가 시간과 비용이 많이 드는 정화 단계¹⁷의 필요 없이 전체 혈액 샘플에서 인간 T 세포의 T-셀/APC 어원이 같은 말에 F-말라를 계량 수 있습니다 하는 방법 소개. 여기에 제시 된 기술은 면역 시 냅 스에 F 걸의 정량화를 혈액 샘플에서 전체 워크플로 구성 되어 있습니다.

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프로토콜

1입니다. 팬 백혈구의 준비

1. Heparinized 주사기에 건강 한 기증자 (또는 환자)에서 말 초 혈액의 1 mL를 그립니다. 헌 혈에 대 한 책임 윤리 위원회에 의해 승인 되었는지 확인 합니다.
2. 믹스 1 mL의 인간 주변 혈액을 30 mL 50 mL 튜브에 ACK 세포의 용 해 버퍼 (150mm NH₄Cl, 1 mM KHCO₃, 그리고 0.1 m m EDTA, pH 7.0)와 고 실 온에서 8 분 동안 품 어.
3. PBS와 6 분 Aspirate는 상쾌한에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기 튜브와 ACK 세포의 용 해 버퍼의 30 mL에 펠 릿을 resuspend.
4. 1.2와 1.3 단계를 반복 하는 상쾌한 분명 하다. 마지막으로, PBS, 실 온에서 6 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기에에서 셀을 세척 하 고 문화 매체 (RPMI1640 + 10 %FCS) 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 60 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.

2. 로드 들의 삶 문의 세 브와 셀

1. 1.5 x 10 2 개의 15 mL 송 골 매 관 관 당⁶ 들의 삶 문의 셀을 준비 합니다. 셀 (300 x g 6 분 실 온에서) 아래로 회전 시키십시오 그리고 삭제는 상쾌한.
2. 잔여 중간에 셀 resuspend (약 50-100 µ L), 1.9 µ µ (1.9 G) L 추가 셉, 그리고 15 분 추가 5 mL의 문화 매체에 대 한 실 온에서 품 어, 셀 (300 x g 실 온에서 6 분), 아래로 회전 및 문화 매체 (RPMI에에서 펠 릿 resuspend 1640 + 10 %FCS) 1 x 10⁶ 셀/mL의 조밀도에.

3. 면역 시 냅 스 및 프로토콜을 얼룩이 지기의 유도

1. FACS 튜브로 셉 로드 들의 삶 문의 셀의 준비 및 다른 FACS 튜브로 역된 들의 삶 문의 셀의 준비의 500 µ L의 500 µ L 플라스틱 각 튜브와 셀 (실 온에서 10 분 동안 300 x g) 아래로 회전 팬 백혈구의 650 µ L를 추가 합니다. 삭제는 상쾌한 고 문화 매체 (RPMI1640 + 10 %FCS)의 150 µ L에 펠 릿을 resuspend. 37 ° C (일반적으로 45 분)에서 품 어.
2. 부드럽게 소용돌이 셀 (10 s 1000 rpm에서) 셀을 해결 하기 위해 소용돌이 동안 paraformaldehyde (1.5%)의 1.5 mL를 추가. 1 mL의 PBS + 1 %BSA 추가 하 여 고정을 중지 합니다. 작은 셀 (300 x g 실내 온도 물의 resuspension PBS + 10 분 동안 실내 온도에 잠복기 후 1 %BSA 1 mL에 셀 펠 릿에서 10 분.
3. 펠 렛 (300 x g 실 온에서 10 분 동안) 및 세포를 permeabilize PBS + 1 %BSA + 실 온에서 15 분 동안 0.1% 사포닌 100 µ L 셀 resuspend (96-잘 플레이트, U 모양).
4. PBS + 1 %BSA + 0.1% 사포닌 원심 (300 x g 실 온에서 10 분)와 셀을 세척 하 고 PBS + 1 %BSA + 0.1% 사포닌 fluorophore 분류 항 체 또는 화합물 (CD3-PE-TxRed (1:30), 포함 된 50 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend Phalloidin-AF647 (1:150), 그리고 DAPI (1:3, 000)).
5. 품 어 30 분 세척에 대 한 어둠 속에서 실 온에서 셀 셀 3 회 PBS + 1 %BSA + 0.1% 사포닌의 1 mL을 추가 하 여. 실 온에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심. Re-resuspend 이미징 cytometry에 대 한 PBS의 60 µ L에 셀.

4. 이미지 수집 교류 Cytometer를 사용 하 여

참고: 다음 이미지 수집 절차 및 데이터 분석 이미징 cytometry imagestream (IS100), 영감, 그리고 아이디어와 같은 소프트웨어를 사용 하 여 기반으로 합니다. 그러나, 다른 흐름 cytometers 및 분석 소프트웨어 또한 사용할 수 있습니다.

1. 영상 교류 cytometer에 연결 된 컴퓨터에 분석 소프트웨어 열고 초기화 응용 악기 메뉴의를 클릭 합니다. 구슬 그렇게 할 것인지 묻는 메시지가 나타나면 올바른 포트에 적용 됩니다.
2. 파일 메뉴에서 기본 서식 파일을 로드 하 고 실행/설치를 클릭 하십시오. 구슬 보기 드롭다운 메뉴에서 선택 합니다.
3. 지정 된 값이 200 강도 설정를 클릭 하 여 필드 밝은 조명 기를 조정 합니다.
4. 보정을 실행 하 고 모든 시작을 클릭 하 여 지원 탭에서 루틴을 테스트.
5. 플러시/잠금/부하에 클릭 하 고 그렇게 하 라는 메시지가 나타나면 왼쪽된 포트에 샘플을 적용. 교류 cytometer 세포를 로드 한 후 셀 분류자 열고 값을 다음과 같이 조정: 각 채널, 피크 강도 낮은 제한 50 채널 2 (DAPI) 및 채널 5 (CD3-Pe-TxR), 50에서 지역 더 낮은 제한에 대 한 1,022에서 피크 강도 상한값 채널 1 (사이드 분산형), 및 1, 500에 상한.
6. 405는 레이저 전원을 변경 nm (15 mW), 488 nm (200 mW), 그리고 647 nm (90 mW) 설정 탭에서.
7. 보기 드롭다운 메뉴 셀 분류자 및 레이저 전원 조정 평가 셀 구슬 사이 전환 합니다.
   참고: 모든 셀 및 셀 커플 셀 보기 발견 되 고 그 세포 덩어리, 파편, 및 포화 픽셀 이미지에서에서 있다 파편 보기 셀 분류자 및 여기 레이저 능력을 변경 하 여 다는 것을 확인 하십시오.
8. 설치 탭 클릭 실행/설치 취득 하려면 샘플 이름 및 이미지 (15000-25000 샘플에 대 한)와 보상 컨트롤에 대 한 500를 정의 합니다.

5. 데이터 분석

1. 데이터 분석 컴퓨터에 raw 이미지 파일 (.rif)를 전송 및 분석 소프트웨어를 엽니다.
2. 보상 드롭다운의 지침에 따라 보상 매트릭스를 생성 합니다. Comp_Date.ctm로 보상 매트릭스를 저장 합니다.
3. 샘플 raw 이미지 파일 (.rif)를 열고 보상된 이미지 파일 (.cif) 및 기본 데이터 분석 파일 (.daf)을 생산 하 고 나타나는 창에서 comp_Date.ctm를 적용 합니다.
4. 보상된 이미지 파일을 엽니다. 이미지 색상 모드로 변환 하 고 이미지 갤러리 속성 도구 모음에서 최적의 표시 색상을 얻기 위해 조회 테이블을 조정 합니다. 복합 이미지 갤러리 속성 도구 모음 탭을 사용 하 여 RGB 병합 이미지를 가져옵니다.
5. 분석에서 마스크 관리자를 엽니다. T 세포와 면역 시 냅 스를 다음과 같이 정의 하는 마스크를 만듭니다.
   1. T-셀 마스크를 선택: "(작성 (Threshold_Ch05, 60)." 계곡 마스크를 선택: "Valley(Ch02,3)" T-세포 시 냅 스 마스크를 선택: "T-셀 마스크와 밸리 (M02, Ch02, 3)."
6. 분석에서 기능 관리자를 엽니다. 다음과 같은 기능을 계산:
   1. T 세포의 총 CD3 식 선택 "Intensity_T-cells_Ch5." T 세포에서 F-말라의 총 금액에 대 한 선택 "Intensity_T-cells_Ch6." CD3 식 면역 시 냅 스에, "Intensity_T-셀 synapse_Ch5." 선택 F-말라 면역 시 냅 스에, 양을 선택 "Intensity_T-셀 synapse_Ch6."
   2. T-셀 영역을 계산 하려면 선택 "Area_T-셀." T 세포 면역 시 냅 스 영역을 계산 하려면 "Area_T-셀 시 냅" 선택
7. 기능 관리자에서 방정식을 사용 하 여 F-말라와 면역 시 냅 스에서 CD3 농축을 확인 합니다.
   
8. 히스토그램을 사용 하 여 다음과 같은 제어 전략을 적용 하 고 점 (대 한 더 자세한 내용은, 참조 참조 17 및 19) 분석 영역에서 플롯:
   1. 히스토그램; "그라데이션 RMS_M2_Ch2"을 그려서 초점 아웃 셀 삭제 15에서 임계값을 설정 합니다.
   2. 점 작의에서 CD3 강도 대 SSC를 플롯 합니다. CD3 양성 이벤트에 대 한 게이트를 설정 합니다.
   3. M02의 "화면 비율" 플롯 (DAPI 얼룩) M02 영역 대 (Dapi 얼룩). T-셀 singlets 및 셀 게이트 따라 커플. 사실 셀 커플^17,19위에서 설명한 대로 냅 마스크 영역을 사용 하 여 수정 합니다.
   4. F-말라 singlets T-세포와 T 세포 T-셀/APC 커플의 금액과 면역 시 냅 스에 F 걸의 %를 확인 합니다.

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결과

여기서 설명 하는 방법의 주요 목표는 단백질 농축의 정량화 (예:, F-말라) 사이 면역 시 냅 스에서 대리 Apc (셀 들의 삶 문의)와 낮은 볼륨 (1 mL) 인간의 혈액 샘플에서 가져온 unpurified 팬 백혈구에 T 세포. 그림 1 의 스크린샷은이 방법의 중요 한 제어 전략에 대 한 개요를 제공합니다. 그것은 왼쪽 및 오른쪽 (그림 1)의 분석 영역에 이미지 갤러...

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토론

여기에 제시 된 워크플로 (ex vivo) 인간 T 세포와 APCs 사이 면역 시 냅 스의 정량화를 수 있습니다. 특히, 팬-백혈구 적혈구 lysed 불가결 T 세포 정화 단계를 만드는 T-셀 원본으로 사용 되었다. B-세포 림프 종 세포 라인 들의 삶 문의 대리 APCs 역임 했습니다. 면역 시 냅 스의 T-세포의 혈액 기증자 사이 비교 수 있기 때문이 맺는 중요 한 이점이 다. 또한, 헌 Dc 거의 주변 인간의 혈액에서 직접 사용할 수 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
>Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 mL
FCS	Pan Biotech#3302-P101102
Polystyrene Round Bottom Tube	Falcon	#352054	5 mL
Kulturflasche	Thermo Scientific	#178883
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8662
Bovine Serum Albumin	Roth	#8076.3
Saponin	Sigma	S7900
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	#16005
FACS Wash Saponin		PBS 1% BSA 0.15 Saponin
ReaktiosgefaB	Sarstedt	72.699.002	0.5 mL
Speed Bead	Amnis	#400041
Minishaker MS1	IKA Works	MS1
Mikrotiterplatte	Greiner Bio One	#650101	96U
Enterotoxin SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	1:3000
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	1:30
Phalloidin-AF647	Molecular Probes	A22287	1:150
IS100	Amnis		Imaging flow cytometer
IDEAS	Amnis		Software
INSPIRE	Amnis		Software