Rato pulmão Slices para Visualize células vivas pulmonar dendríticas precisão de corte

Resumo

Descreve-se um método para a geração de corte de precisão pulmonar fatias (PCLS) e imunocoloração-los para visualizar a localização de vários tipos de células imunitárias no pulmão. Nosso protocolo pode ser estendido para visualizar a localização e função de muitos tipos diferentes de células sob uma variedade de condições.

Resumo

A inalação de alérgenos e agentes patogénicos elicia várias alterações em uma variedade de tipos de células imunitárias no pulmão. Citometria de fluxo é uma técnica poderosa para a análise quantitativa das proteínas da superfície celular em células do sistema imunológico, mas não fornece nenhuma informação sobre os padrões de localização e de migração destas células dentro do pulmão. Do mesmo modo, ensaios de quimiotaxia pode ser realizada para estudar o potencial das células para responder a factores quimiotáticos in vitro, mas estes ensaios não reproduzem o ambiente complexo do pulmão intacta. Em contraste com estas técnicas acima mencionadas, a localização de tipos de células individuais dentro do pulmão pode ser facilmente visualizado através da geração de precisão de corte fatias de pulmão (PCLS), manchando-os com anticorpos comercialmente disponíveis, marcados por fluorescência, e visualizando as secções por microscopia confocal. PCLS pode ser utilizado tanto para viver e fixa o tecido pulmonar, e as fatias pode abranger áreas tão grandes como uma secção transversal de um lobo inteiro. Nós temos utilizado este protocolo para visualizar com sucesso o local de uma ampla variedade de tipos de células no pulmão, incluindo tipos distintos de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células T e células B, assim como células estruturais tais como linfático, endotelial e células epiteliais. A habilidade de visualizar as interacções celulares, tais como aquelas entre as células dendríticas e as células T, no tecido pulmonar vivo, tridimensional, pode revelar como células se movem no interior do pulmão e interagir uns com os outros no estado estacionário e durante a inflamação. Assim, quando usado em combinação com outros procedimentos, tais como citometria de fluxo e PCR quantitativa, PCLS pode contribuir para uma compreensão abrangente de eventos celulares que fundamentam as doenças alérgicas e inflamatórias do pulmão.

Introdução

Após a inalação de estímulos pró-inflamatórios, tais como lipopolissacáridos (LPS), há um movimento coordenado de células imunes para, dentro de, e do pulmão. Por exemplo, os neutrófilos são rapidamente recrutados para o parênquima pulmonar e das vias aéreas. Além disso, algumas células apresentadoras de antigénios profissionais conhecidos como células dendríticas convencionais (CDCs) sofrem um padrão de migração relativamente complexo ^{1, 2.} CDCs podem ser identificados por citometria de fluxo, com base, em parte, a sua exposição do marcador de superfície, CD11c. Subconjuntos distintos de DCs pode ser distinguida pela expressão de superfície diferencial de CD103 e CD11b ^3. Após a aquisição de antigénio inalado, algumas CDCs sair do pulmão e migram através dos vasos linfáticos de drenagem pulmonares Nódulos Linfáticos (LNs) onde apresentam péptidos de antigénio-específica de células T ^4. Este é um evento precoce crítico na iniciação de r imune adaptativaesponses. Por razões desconhecidas, no entanto, nem todos os CDCs que adquirem antígenos inalados deixar o pulmão, e muitas destas células permanecem nesse órgão durante vários meses ^{5, 6.} Esta observação pode ser parcialmente explicado pela ascendência desenvolvimento destas células porque CD11c ⁺ células sem o receptor de quimiocina, CCR7 derivadas de monitos, são incapazes de migrar para LNs regionais ^{7, 8.} Parece provável que o potencial de migração de CDCs também é determinado, pelo menos em parte, pela sua posição anatômica dentro do pulmão. No entanto, a localização exacta destas diferentes populações de CDCs no pulmão não está completamente caracterizada. Um melhor conhecimento de localização de células imunitárias no interior do pulmão, e das moléculas que dirigem-lo, é necessário para uma melhor compreensão de como o sistema imune do pulmão torna-se activado.

PCLS estão sendo cada vez maiorly usado como uma abordagem ex vivo para visualizar posicionamento celular e interacções célula-célula, enquanto mantém a integridade estrutural da arquitectura pulmonar ^{9, 10.} PCLS têm sido usadas para estudar os pulmões de muitas espécies, incluindo ratos, gado, macacos, ovelhas, cavalos e seres humanos ^11. Uma importante vantagem desta técnica é que cerca de 20 fatias pode ser preparado a partir de um único lóbulo do pulmão do rato, reduzindo assim o número de animais necessários para as experiências individuais. Virtualmente todos os tipos de células imunitárias, incluindo as DCs, macrófagos, neutrófilos e células T, estão presentes em PCLS e manter as suas estruturas normais.

PCLS também pode ser utilizado para estudar a sinalização de cálcio e a contractilidade de células das vias respiratórias e do músculo liso após o tratamento com ¹² ou acetilcolina metacolina ^13. Nesta abordagem, apenas uma pequena porção do pulmão é umalyzed microscopicamente, mas um estudo relatou que as medições de contracção das vias aéreas em PCLS variar apenas cerca de 10% a partir de fatia a fatia, e esta variação é comparável à observada usando testes da função pulmonar em animais intactos ^14. Outros investigadores têm utilizado PCLS como uma abordagem ex vivo para estudar alterações na expressão de citoquinas e marcadores de superfície celular após incubação com LPS ^15. PCLS também têm sido utilizados num modelo ex vivo de vasoconstrição pulmonar hipóxica em pequenas artérias intra-acinares. Estes vasos estão localizados na parte do pulmão que não pode ser alcançado utilizando outros processos, incluindo gravações de segmentos ou análise de vasos arteriais subpleurais ¹⁶ dissecados. O nosso laboratório tem usado principalmente PCLS para visualizar a localização de células imunitárias em tecidos de pulmão vivo no estado estacionário e na sequência de um estímulo inflamatório in vivo. Os procedimentos que desenvolvemos para isso são as seguintes.

Protocolo

procedimentos experimentais animais descritos no presente documento foram aprovados pelo Comité de Cuidados e NIEHS animal Uso (IACUC).

1. Preparação do pulmão

1. ratos de casa entre 6 e 12 semanas de idade em condições específicos isentos de agentes patogénicos, de acordo com as orientações fornecidas pelos Comitês de Cuidado e Uso Institucional animais.
   NOTA: Imaged ratos pode ser ingênuo, ou tratados, dependendo dos interesses específicos de cada pesquisador. Aqui, nós descrevemos a localização celular imune em ratinhos ncios e em ratos tratados com 100? G de ovalbumina (OVA) e 0,1 ug de lipopolissacárido (LPS), utilizando tampão fosfato salino (PBS) como veículo em um volume total de 50 uL. Para infundir oropharyngeally OVA / LPS para as vias aéreas, os animais foram anestesiados com inalação de isoflurano e verticalmente suspensas pelos seus dentes com uma banda de borracha. A língua foi gentilmente apreendido com uma pinça e segurou para um lado para evitar engolir, e 50 & #181; L da solução de OVA / LPS depositada na parte posterior da cavidade oral, como previamente descrito ^17.
2. Eutanásia do ratinho com injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (100 mg / kg), e fixar o animal a uma base de poliestireno.
3. Abrir a cavidade abdominal com uma tesoura, cortando a pele e peritônio do meio do abdômen até a mandíbula. Puxe os intestinos de lado com fórceps ou a borda maçante da tesoura e cortar a vena cava inferior para drenar o sangue para fora dos pulmões. Perfurar o diafragma com a ponta afiada da tesoura para permitir a expansão da caixa torácica, tomando cuidado para não cortar os pulmões.
4. glândulas salivares claras e outro tecido para longe da traqueia, agarrando o tecido e manualmente puxando-o para longe da traqueia subjacente com uma pinça. Fazer uma pequena incisão na traquéia na face anterior da banda mais espessa da cartilagem usando uma pinça fina ou tesouras, tomando cuidado para não cortar todo o caminho que o trachea. A incisão será apenas suficientemente grande para permitir que uma agulha de 20 G a passar através.
5. Deslize de 1,5 polegada, 20 L de agulha para uma secção de tubo de polietileno, deixando cerca de 1 cm de tubo para além da extremidade da agulha. Cortar o tubo com um ângulo de aproximadamente 45 ° para chanfrar a extremidade, colocar a agulha para uma seringa de 1 mL, e carregar a seringa por desenho 0,8 mL de água morna (40 ° C) 2% de baixo ponto de fusão de agarose-se através da agulha.
6. Coloque a extremidade do tubo para a incisão da traqueia e lentamente injectar a agarose para dentro dos pulmões. Sem mover a agulha ou seringa, a seringa fita adesiva à base de poliestireno para assegurar que a agulha permanece na traqueia.
   NOTA: Após a injeção, os pulmões serão maiores e inflado dentro do peito. Os lobos direito expandir primeiro, depois o lobo esquerdo. Se apenas um lóbulo expande, a agulha foi inserida muito profundamente (passado o brônquio), e será necessário retirá-lo um pouco antes de continuar. Esta parte doprocedimento precisa ser feito de forma relativamente rápida, antes da agarose começa a solidificar.
7. Colocar o rato, com a base e a seringa ainda inserido na traqueia, num quarto frio ou um refrigerador por pelo menos 10 min. Se necessário, o animal pode ser mantido lá por várias horas, mesmo se proceder à migração de células de imagem por microscopia de vídeo.
8. Uma vez que o rato é frio, cuidadosamente excisar os pulmões inflado-agarose com uma tesoura, e colocá-los num prato 3 cm, com PBS gelado. Manter em gelo.
9. Escolha do lóbulo desejado para corte de tecidos (por exemplo, o lobo superior direito). Certifique-se a parte interior do pulmão (onde ele se conecta a traqueia) está virado para baixo no prato.
   NOTA: O lóbulo usada e a sua orientação no êmbolo irá determinar o tamanho de vasos e vias aéreas que serão visíveis. A orientação aqui descrita é ideal para a visualização de grandes vias aéreas, e parênquima. Os ratos têm um grande lóbulo esquerdo e quatro lobos menores à direita. Paraimagiologia PCLS seguinte introdução de alérgenos para os pulmões através da orofaringe ou aspiração intranasal, o lobo superior direito está normalmente em corte, em parte, porque é um tamanho conveniente, mas também porque os agentes inalados dispersar uniformemente dentro dele. No entanto, outros lobos, especialmente o lobo esquerdo, também pode ser estudado. Ao comparar estirpes de ratinho ou tratamentos, é importante para comparar o mesmo lobo.

2. Lung Slicing

NOTA: fazer fatias utilizando um cortador de automatizado, de metal arrefecimento bloco, e êmbolo da seringa metálica, de acordo com as instruções do fabricante.

1. Colocar uma pequena gota de todos os fins, não-funcionamento supercola gel sobre o êmbolo e espalhar a cola em um movimento circular, tendo o cuidado de não permitir que a cola de contacto com os lados da seringa de metal. Se a cola toca os lados da seringa, que vai colar a seringa e o êmbolo juntos.
2. Imediatamente depois de cobrir o êmbolo com cola, o agarrar suavementelóbulo excisado com uma pinça com o lado da traqueia para baixo, DAB-lo sobre um tecido para remover o excesso de líquido, e cuidadosamente colocá-lo na parte superior do êmbolo. Aparar qualquer tecido extra que se estende para além do bordo do êmbolo.
3. Mover o êmbolo para baixo de modo que os lados da seringa de metal, e mover-se ao longo do tecido, criando um poço com o pulmão colado na parte inferior, não mais do que alguns centímetros de profundidade. Fita em torno do fundo da seringa de metal para manter esta posição no lugar.
4. Cuidadosamente verter 2% de agarose de baixa de fusão a 40 ° C no poço de modo que apenas cobre a parte superior do lóbulo.
5. Cercar a seringa de metal, com o bloco de arrefecimento arrefecido com gelo e arrefecer o lóbulo e agarose para 1-2 min.
   NOTA: Um arrefecimento de tempo mais curto do que a agarose em torno do tecido poderia conduzir à desintegração da agarose durante o corte, o que pode resultar num corte PCLS desigualmente.
6. Carregar a seringa espécime para o fatiador automatizado e encher o tanque tampão com PBS gelado. Alinhe a a etapa de accionamento do motor, com a seringa de amostra e remover o pedaço de fita adesiva a partir do fundo. Rode o interruptor para a posição de avanço rápido (FF) até que a unidade de motor passo apenas toca a parte de trás do êmbolo.
7. Alinhar a lâmina fresco com a seringa espécime. Conjunto espessura do tecido, contínua / única fatia, oscilação e velocidade no fatiador. Por exemplo, a espessura do tecido: 150? M, de corte contínua (cont.), Oscilação: 9, e a velocidade: 3 - 4. Pressione início. As configurações acima necessitar de ser ajustada com as especificações slicer automatizados específicos.
8. Usando uma espátula fina ou pincel, recolher o PCLS um de cada vez enquanto caem para o tanque tampão e colocá-los em uma placa de 24 pos contendo PBS gelado.
   NOTA: É importante manter as fatias, a fim de manter a consistência entre os experimentos. Embora cada pulmão é diferente, dependendo da idade, sexo e peso, a 10 ^de fatia, por exemplo, geralmente origina similarmente dimensionados vias aéreas.

ove_title "> 3. Coloração de anticorpos

1. Conceber um painel de anticorpos marcados por fluorescência com base no tipo de cula de interesse, tendo em conta o potencial sobreposição espectral fluorescente e as capacidades de detecção do microscópio.
   NOTA: Como um exemplo, um painel para a detecção subconjunto de DC é como se segue: CD11c / alfa X integrina - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitação: 405 nm, pico de emissão: 605 nm), CD324 / E-caderina - Alexa 488 (AF488 ) (Excitação: 488 nm, do pico de emissão: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - Ficoeritrina (PE) (Excitação: 561 nm, do pico de emissão: 578 nm), CD103 / alfa E integrina - aloficocianina (APC) (Excitação: 633 nm , do pico de emissão: 660 nm). Fluorescência ferramentas espectador espectrais (ver Lista de Materiais) são úteis para projetar painéis.
2. Realizar uma mistura de anticorpos que contêm os anticorpos desejados.
   1. Para imagiologia PCLS estático, adicionar 800 de tamp de colorao, 100 uL Fc blocker, 50 uL de soro normal de rato, e 50 uL de soro normal de rato a uma mL microcentrifu 1,5gação tubo para um volume total de 1 mL. Para imagem de células vivas, utilizar 800 uL de meio de Leibovitz (1x) contendo 10% de FBS (Leibovitz-10) em vez de tampão de coloração.
   2. Adicionar anticorpos para ajustar uma concentração final desejada de cada anticorpo. Transferir a solução de anticorpo a um prato de 3 centímetros, e manter-se no escuro até estar pronto para usar.
      NOTA: As concentrações finais têm de ser optimizada para cada indivíduo anticorpo (geralmente 1-5 ug / ml).
3. Escolher um PCLS com uma área anatómica de interesse, tais como grandes vias respiratórias ou periferia do pulmão, e colocar no prato 3-cm contendo uma solução de anticorpo mL.
4. PCLS mancha no escuro, em gelo, de balanço lentamente durante 30 ou 60 min.
5. Para imagens PCLS estático, vá para a seção 4. Para imagens de células vivas, avance para a secção 5.

4. estática de imagem de PCLS

1. Após 60 min de incubação de PCLS com anticorpos, remover a solução de anticorpo a partir do prato e enxaguar tque corta duas vezes com 1 mL de PBS gelado.
2. Pipetar 50 mL de PBS para um 3 cm rodada prato de vidro de fundo. Usando uma espátula ou pincel, transferir os PCLS coradas para a gota, manipulando suavemente a fatia até que seja plana e se espalhar. Remover o PBS com uma pipeta. A fatia deve situar-se o mais plano possível. Os procedimentos acima referidos necessitam de ser realizadas rapidamente para evitar a fotodegradação.
3. Colocar uma gota de meio de montagem à temperatura ambiente para a fatia e suavemente gota uma lamela de vidro para dentro do poço da placa. Manter PCLS no escuro a 4 ° C durante até uma hora antes de imagem.
4. Ao visualizar em um microscópio confocal, use um objetivo 20X (ver Lista de Materiais). Use a ferramenta "telha" para localizar e marcar as bordas do tecido na configuração "casco convexo". Isso ajudará a reduzir o tempo da varredura telha.
5. Durante o ajuste do intervalo z-pilha, verificar em várias áreas da fatia, especialmente ao longo das extremidades, que as gamas conjuntosão adequados.
   NOTA: O z-range provavelmente terá de ser maior do que a espessura do tecido em si, porque é muito difícil obter o tecido para colocar completamente plana. Por exemplo, com um PCLS espessura de 150 um, na gama de z-pilha vai provavelmente precisar de ser ajustada para 200-250? M para acomodar obstáculos e curvas no fatia. Dependendo do intervalo de z-pilha e o tamanho do tecido, cada varrimento de pulmão total levará entre 7-12 h com uma objectiva 20X. Cada pulmão é único e as definições devem ser ajustadas para cada experimento.

5. Imagens de células vivas de PCLS

1. Após 30 min de incubação de PCLS com anticorpos, remover a solução de anticorpo a partir do prato e enxaguar as fatias duas vezes com 1 ml de solução fria Leibovitz-10.
2. Pipetar 50 mL fresco Leibovitz-10 em um slot de uma lamela câmaras (8 slots). Usar uma espátula para transferir os PCLS para a forma, manipulando-a suavemente até que a fatia é plana e se espalhar. Os procedimentos acima referidosprecisam ser realizadas rapidamente para evitar a fotodegradação.
3. Remover o meio 50 ul usando uma pipeta. A fatia é para ser deitada tão plana quanto possível.
   NOTA: É aceitável, se as bordas da fatia são viradas para cima verticalmente contra a parede da câmara. Além disso, se disponível, um peso de metal platina pode ser utilizado para o ancorar a fatia antes de prosseguir para o próximo passo. Ver a Lista de Materiais ligado para um exemplo de fio de platina que pode ser cortado e dobrado em pequenos pesos.
4. Numa 4 ° C quarto frio, misturar 100 ul de crescimento reduzida-fator, fenol matriz extracelular livre de vermelho com 100 uL Leibovitz-10. Utilize pontas de pipeta pré-resfriada para isso, ou a matriz extracelular vai solidificar na ponta.
   NOTA: O rácio da matriz e média (1: 1) cria um gel suficientemente denso para manter os PCLS para baixo em condições de cultura de tecidos.
5. Pipeta suavemente a matriz para misturar, e pipeta com cuidado em cima dos PCLS, certificando-se que o gel vai em cima da lung de fatia, e que a fatia não flutuar no topo do gel. O gel deve funcionar como um peso, ancorando as PCLS para baixo para o fundo da placa.
6. transferir cuidadosamente as câmaras lamela para uma incubadora a 37 ° C e deixar a matriz para solidificar ~ 5 min.
7. Transferir todo o lamela septadas para a fase pré-aquecido de um microscópio confocal. Manter a câmara a 37 ° C ao longo de imagiologia. Fornecimento de CO ₂ não é necessário durante a incubação de células quando se utiliza meio de Leibovitz.
8. Definir o intervalo de gama-z pilha e telha com base no intervalo desejado entre os quadros. Ao visualizar em um microscópio confocal, use um objetivo 20X (ver Lista de Materiais). Utilizar a ferramenta "telha" para denotar a área de interesse no tecido, usando a configuração de "rede" centrado (por exemplo, uma grade de 2x2 centrado).
9. Durante o ajuste do intervalo z-pilha, verificar em várias áreas da fatia que os intervalos definidos são adequados.
   NOTA: O zrange provável será igual à espessura do tecido. Cada pulmão é único e as definições devem ser ajustadas para cada experimento. telhas 2x2 e 10 z-pilhas irá geralmente resultar em ~ um quadro / 2 min. Assegurar a função de auto-foco é activado antes de iniciar o experimento para minimizar XY e Z-tração durante o período de imagem.

Resultados

Para identificar a localização de dois subconjuntos de DC, CD11b CDCs ^hi e CD103 ⁺ CDCs, PCLS de ratinhos C57BL / 6 foram cortadas e coradas com anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para CD11c, CD88, CD103, CD324 e (E-caderina). Os anticorpos para as células epiteliais das vias respiratórias, CD324 mancha e CD88 é apresentado sobre os macrófagos e neutrófilos, mas não CDCs ^8. Isto permitiu-nos distinguir CDCs de CD11c ⁺

Discussão

O protocolo aqui descrito foi originalmente desenvolvido para visualizar os locais de dois subconjuntos de CDCs dentro do pulmão. No entanto, este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar muitos tipos de células diferentes, mantendo ao mesmo tempo a viabilidade celular e a arquitectura tridimensional do pulmão. A última característica é uma vantagem importante em relação aos sistemas de cultura de células e facilita a identificação de tipos de células raras. O método baseia-se na geração de PCL...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	000664
Prox1-TdTomato transgenic mice	Jackson Laboratory	018128	B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J
OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice	Jackson Laboratory	004194, 016617	B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J
Rag1 knock-out mice	Jackson Laboratory	002216	B6.129S7-Rag1tm1Mom/J
Ovalbumin, Low Endo, Purified	Worthington Biochemical Corporation	LS003059
Lipopolysaccharides from Escherichia coli	Sigma-Aldrich Co.	L2630-25MG
Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft	BD Diagnostic Systems	427421	0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter
GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose	BioExpress	E-3112-125	2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C.
Compresstome VF-300	Precisionary Instruments, Inc.	VF-300
Double Edge Stainless Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	72000	Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung.
Krazy Glue All Purpose Instant Gel	VWR	500033-484	Commonly available for $3/tube in local drugstores
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	21083027
Normal Rat Serum (NRS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	012-000-120
Normal Mouse Serum (NMS)	Jackson ImmunoResearch Inc.	015-000-120
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03HI
Staining Buffer	Made in House	N/A	PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4
Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies)	Made in House	N/A	Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2
Anti-mouse CD11b eFluor 450	eBioscience	48-0112-80	Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605	BioLegend	101237	Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70)
Anti-mouse CD11c Phycoerythrin	eBioscience	12-0114-82	PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418)
Anti-mouse CD11c Allophycocyanin	BD Phamingen	550261	APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3)
Anti-mouse CD88 Phycoerythrin	BioLegend	135806	PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70)
Anti-mouse CD103 Allophycocyanin	eBioscience	17-1031-82	Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7)
Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450	eBioscience	48-0902-82	Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1)
Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin	eBioscience	17-1721-82	Anti-mouse CD172a APC (clone: P84)
Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421	BD Horizon	564188	BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488	eBioscience	53-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1)
Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647	eBioscience	51-3249-82	Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1)
Glass Bottom Microwell Dishes 35 mm petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 coverglass	MatTek Corperation	P35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	ThermoFisher Scientific	155411PK	Pack of 16
15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness	MatTek Corperation	PCS-1.5-15
Bare Platinum Wire	World Precision Instruments	PTP201	0.020" (0.5 mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher Scientific	P36934	Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use.
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free	Corning	356231
Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope	Carl Zeiss		Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objective lends	Carl Zeiss	420650-9901-000