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Resumo

O objetivo deste estudo é mostrar cada passo da técnica de dissecção de fibras em cérebros cadavéricos humanos, a documentação 3D dessas dissecações ea imagem de tensor de difusão das vias fibrosas anatomicamente dissecadas.

Resumo

O objetivo deste estudo é mostrar a metodologia para o exame das conexões de substância branca do complexo de área motora suplementar (SMA) pré-SMA e SMA utilizando uma combinação de técnicas de dissecção de fibras em espécimes cadavéricos e ressonância magnética (MR ) Tractografia. O protocolo também descreverá o procedimento para uma dissecção da substância branca de um cérebro humano, imagens de tractografia de tensor de difusão e documentação tridimensional. As dissecções de fibra no cérebro humano ea documentação 3D foram realizadas na Universidade de Minnesota, Microcirurgia e Neuroanatomia do Laboratório, Departamento de Neurocirurgia. Cinco espécimes de cérebro humano pós-morte e duas cabeças inteiras foram preparados de acordo com o método de Klingler. Os hemisférios cerebrais foram dissecados passo a passo de lateral para medial e medial para lateral sob um microscópio operatório, e imagens 3D foram capturadas em cada estágio. Todos os resultados de dissecção foram suportados por tensor de difusãoImagem. As investigações sobre as conexões em linha com a classificação de Meynert, incluindo fibras associativas (curto, fascículo superior superior I e traços frontais do aslante), fibras de projeção (corticospinal, claustrocortical, cíngulo e frontostriatal) e fibras comissurais Também conduzido.

Introdução

Entre as 14 áreas frontais delineadas por Brodmann, a área pré-motora e pré-frontal que se encontra em frente ao córtex motor precentral tem sido considerada como um módulo silencioso, apesar de o lobo frontal desempenhar um papel importante na cognição, no comportamento, E processamento de voz. Além do complexo de área motora suplementar (SMA), constituído pelo pré-SMA e pelo SMA propriamente dito (área de Brodmann, BA 6), que se estende medialmente, o módulo pré-motor / frontal inclui o pré-frontal dorsolateral (BA 46,8, E 9), frontopolar (BA 10), ventrolateral prefrontal (BA 47), bem como parte do córtex orbitofrontal (BA 11) na superfície lateral do cérebro 1 , 2 .

O complexo SMA é uma área anatômica significativa que é definida por suas funções e suas conexões. A ressecção e os danos desta região causam déficits clínicos significativos conhecidos como SMAsíndrome. A síndrome de SMA é uma condição clínica importante que é particularmente observada em casos de glioma frontal que contêm o complexo SMA 3 . O complexo SMA tem conexões com o sistema límbico, gânglios basais, cerebelo, tálamo, SMA contralateral, lóbulo parietal superior e porções dos lobos frontais através de tratos de fibra. O efeito clínico dos danos a estas ligações de substância branca pode ser mais grave do que para o córtex. Isto deve-se ao facto de as consequências da lesão do córtex poderem ser melhoradas ao longo do tempo devido à elevada plasticidade cortical 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ,. Portanto, a anatomia regional SMA e os caminhos da substância branca devem ser deeplCompreendida, em particular para cirurgia de glioma.

Uma compreensão abrangente da anatomia dos caminhos da substância branca é importante para o tratamento de largo espectro de lesões neurocirúrgicas. Estudos recentes da documentação tridimensional dos resultados anatômicos obtidos em microcirurgia foram utilizados para se obter uma melhor compreensão da anatomia topográfica e da inter-relação dos caminhos da substância branca do cérebro 13,14 . Portanto, o objetivo deste estudo foi examinar as conexões de substância branca do complexo SMA (pré-SMA e SMA propriamente dito) utilizando uma combinação de técnicas de dissecção de fibra em amostras de cadáveres e tractografia de ressonância magnética (MRI) e explicar todos os métodos E princípios de ambas as técnicas e sua documentação detalhada.

Planejamento e Estratégia de Estudo

Antes da realização das experiências, um litroOs procedimentos que precisam ser aplicados aos espécimes antes e durante as dissecções, e todas as conexões entre regiões SMA que foram reveladas com dissecção e DTI foram conduzidas. Os estudos prévios sobre localização e separação anatômica de regiões pré-SMA e SMA-próprias e sobre a anatomia topográfica de suas conexões foram revisados.

Protocolo

Os falecidos são incluídos aqui como uma população, embora pessoas falecidas não são tecnicamente seres humanos; Os sujeitos humanos são definidos por 45 CF 46 como "seres humanos vivos 15 , 16 ".

1. Preparação de amostras

  1. Examine 5 cérebros fixados em formalina (10 hemisférios) e 2 cabeças humanas inteiras.
  2. Fixar os espécimes numa solução de formalina a 10% durante pelo menos 2 meses de acordo com o método de Klingler 17 .
  3. Congelar todos os espécimes a -16 ˚C durante 2 semanas de acordo com o método de Klinger 17 .
  4. Descongelar os espécimes sob a água da torneira.
  5. Realizar uma craniotomia frontotemporal estendida na cabeça cadavérica para expor o cérebro.
    1. Coloque a cabeça cadavérica em uma braçadeira de três pinos ( tabela de materiais).
    2. Fazer uma incisão frontotemporal da pele com um bisturi.
    3. Remova a pele e os músculos usando um bisturi, fórceps e tesoura.
    4. Faça um ou mais buracos no crânio até atingir a dura-máter; Use uma broca com um redutor de velocidade compacto e um acessório de perfuração cranial de 14 mm a 79.000 rpm ( Tabela de Materiais).
    5. Corte a aba do osso e abra o crânio usando um roteador canelado de 2 mm x 15,6 mm com um acessório de rebarba de 2,1 mm em forma de pino a uma velocidade de broca de 80.000 rpm ( Tabela de Materiais).
  6. Remova a dura-máter, a aracnóide ea pia-máter e dissecar usando um microdissector sob um microscópio de 6X a 40X ampliação 5 , 18 ( Tabela de Materiais).

2. Técnica de Dissecção de Fibras

OBSERVAÇÃO: Execute todas as dissecações sob ampliação de 6X a 40X em um microscópio cirúrgico.

  1. Realizar as dissecções de fibras de forma gradual em cada hemisférioRe, de lateral para medial e medial para lateral.
    1. Decorticate o córtex cerebral usando um dissector de panfield ( Tabela de Material ) e remover todos os tecidos frontais cortical para expor os tratos de fibra de associação curtos, que são U fibras ou fibras intergyral que interconectam gyri vizinho 5 , 13 .
    2. Remova as fibras de associação curtas com um dissector de painel e um micro gancho cirúrgico, aparando suavemente sob o microscópio ( Tabela de Materiais) para alcançar e expor as fibras de associação longa, que interligam áreas distantes no mesmo hemisfério.
    3. Vá profundamente nas fibras da associação longa para remover as fibras superficiais da associação usando um micro gancho cirúrgico e um dissector do panfield; Remova cada feixe de fibras sob um microscópio ( Tabela de Materiais) para expor as fibras comissurais de projeção.
    4. Veja cada uma das conexões do complexo SMADe acordo com a anatomia topográfica previamente definida na literatura 2 , 8 , 18 , 19 , 20 , 21 .
  2. Manter todos os espécimes (cabeças inteiras e cérebros) que foram utilizados durante as dissecações em solução de formaldeído a 10% ( Tabela de Materiais) entre os períodos de dissecção.

3. Técnica de Fotografia 3D

  1. Use uma plataforma de cor preta durante a fotografia dos espécimes.
  2. Siga uma técnica de fotografia 3D 22 .
    1. Coloque cada espécime em uma plataforma de cor preta projetada.
    2. Selecione uma cena com uma vista totalmente frontal da amostra e faça uma foto focalizando a câmera em qualquer ponto da amostra próximo ao ponto central na tela da câmera (guia do instrumentoLe). Utilize uma objectiva SLR de 18 a 55 mm f / 3,5-5,6 ou uma lente macro de 100 mm f / 2,8 L e defina a abertura para F29, ISO 100.
    3. Gire a câmera ligeiramente para a esquerda até que o ponto mais à direita na tela da câmera seja o mesmo que o ponto de foco acima. Deslize a câmera para a direita até que o ponto médio na tela se sobreponha ao ponto de foco original na amostra. Focalize a câmera neste ponto e pegue outro tiro.
    4. Manter a distância eo eixo da câmera para a amostra fotografada em valores constantes.
  3. Crie uma imagem 3D usando um programa gerador de imagem 3D (Tabela de materiais).
    1. Abra o programa de software 3D.
    2. Escolha "Abrir imagens estéreo de Arquivo".
    3. Selecione as duas imagens (esquerda e direita) e verifique se a imagem esquerda está no slot esquerdo ea imagem direita está no slot direito.
    4. Selecione a opção "Half color anaglyph RL / 2" e gere o anaglyph no formato jpeg.

4. Técnica DTI

  1. Adquirir dados de difusão pré-processados ​​utilizando os dados de difusão do Projeto Human Connectome 23 , baixando-os do site referenciado.
    A informação de difusão foi obtida em voluntários normais usando um dispositivo de RM 3 T modificado (tabela de instrumentos) utilizando uma sequência de imagem planar de eco de spin-eco (EPI) com multi- Acelera�o da imagem de banda 24 , 25 , 26 , 27 , 28 . Os parâmetros de sequência relevantes incluem: TR = 5 520 ms; ET = 89,5 ms; FOV = 210 x 180 mm; Matriz = 168 x 144; Espessura da fatia = 1,25 mm (tamanho do voxel 1,25 x 1,25 x 1,25 mm); Factor de multibanda = 3; E valores de b = 1.000 s / mm2 (95 direcções), 2.000 s / mm2 (96 direcções) e 3.000 s / mm2 (97 direcções). Os dados foram então processados ​​utilizando FreeSurfer 29 e FSL 30 ; O processo incluiu correcção de correntes de Foucault, correção de movimento, normalização de intensidade b0, correção de distorção de susceptibilidade e correção de não-linearidade de gradiente 28 , 31 , 32 , 33 . Correspondente T1-ponderada MP-RAGE imagens também estão incluídas no pacote de download. Os procedimentos estão documentados no manual de procedimentos do Projeto Connectome Humano 23 .
  2. Pós-processar os dados de difusão usando Diffusion Spectrum Imaging (DSI) Studio 34 para gerar uma estimativa voxel-wise difusão orientação distribuição função (ODF), empregando uma generalizada q-sampling imaging (GQI) algoritmo [ 35] .
    1. Carregar o conjunto de dados baixado para o software por selEctando "STEP1: Open source images" e selecionando o arquivo data.nii.gz.
    2. Selecione o botão "STEP2: Reconstruction". Depois de verificar a máscara cerebral, vá para o "Passo 2" e selecione "GQI" como o método de reconstrução. Selecione "r ^ 2 ponderação" com uma "razão de comprimento" de "1.0". Deixe as seleções restantes como padrão.
    3. Selecione "Executar reconstrução".
  3. Coloque sementes apropriadas para regiões de interesse para agilizar o rastreamento de fibras.
    1. Na "Janela de Região", clique no botão "Atlas" para colocar sementes para o fascículo longitudinal superior (SLF) I. Selecione "Brodmann" e adicione "Região 6" e "Região 7." Na janela de região, defina o tipo "Região 6" como "semente" e o tipo "Região 7" como "região de inclusões" (ROI).
      1. Selecione "Nova Região" na janela da região e desenhe manualmente um ROINo aspecto mais posterior do giro frontal superior no plano coronal. Execute o rastreamento de fibra como descrito na etapa 4.4.
    2. Coloque as sementes para o SLF II de forma semelhante usando "Nova Região" na janela da região e desenhe a região "semente" no aspecto posterior da matéria branca do giro frontal médio no plano coronal. Escolha um ROI usando "Atlas" (como no passo 4.3.1) e regiões Brodmann 9, 10, 46, 39 e 19. Execute o rastreamento de fibra como descrito no passo 4.4.
    3. Coloque as sementes para o SLF III com uma região "semente", usando "Atlas" (como no passo 4.3.1) na janela da região e escolha "Região 40" do Atlas de Brodmann e o ROI de "Atlas ..." na "Região 40 "E" Região 44 ". Execute o rastreamento de fibra como descrito na etapa 4.4.
    4. Colocar sementes para fibras de calos usando "Nova Região" na janela da região e desenhar uma "semente" no plano sagitalE corpo caloso. Execute o rastreamento de fibra como descrito na etapa 4.4.
    5. Coloque sementes para fibras cinguladas usando "Nova Região" na janela da região e desenhe uma região "semente" no giro médio-cingulado na visão coronal. Use "Nova Região" para desenhar dois ROIs, um no cíngulo mais anterior e um no giro cingulado posterior sob a vista coronal. Execute o rastreamento de fibra como descrito na etapa 4.4.
    6. Coloque sementes para fibras claustrocortical usando "Nova Região" na janela da região e desenhe uma "semente" no claustro com um ROI na corona radiata usando a função "Atlas ...". Selecione o atlas como "JHU-WhiteMatter-labels-1mm."
      1. Selecione e adicione "Anterior_corona_radiata", "Posterior_corona_radiata" e "Superior_corona_radiata". Desenhe uma região de evitação para todas as fibras que passam por um plano inferior ao nível do claustrum no plano axial usando "New Region"Na janela da região Execute o rastreamento de fibra como descrito no passo 4.4.
    7. Coloque sementes para o trato corticoespinal usando uma "semente" da função "Atlas ..." na janela da região; Selecione "JHU-WhiteMatter-labels-1mm" e adicione a região "Corticospinal_tract". Execute o rastreamento de fibra como descrito na etapa 4.4.
    8. Coloque as sementes para o trato frontal aslativo (FAT) usando uma região "semente" da função "Atlas ..." na janela da região e selecionando o ROI de Brodmann e "Região 6" na "Região 44" e na "Região 45". " Execute o rastreamento de fibra como descrito na etapa 4.4.
    9. Coloque as sementes para o trato frontostriatal (FST) com uma "semente" na "Região 6" usando a função "Atlas ...". Insira novas regiões no "caudate", "putamen" e "globus pallidus" do atlas "HarvardOxfordSub" e defina o tipo na janela da região para "end."
      OBSERVAÇÃO: O rastreamento das fibras para a FST será realizado selecionando a semente da Região 6 e apenas uma das sementes subcorticais por sessão de rastreamento ( isto é, a região 6 e o ​​caudado, seguida pela região 6 e o ​​putamen e, finalmente, a região 6 eo globus Pallidus).
      1. Execute o rastreamento de fibra como descrito no passo 4.4 para cada combinação.
  4. Execute o rastreamento de fibra para cada uma das combinações acima.
    1. Na janela "Opções", defina os parâmetros de rastreamento como: índice de terminação de qa de 0,08, limiar angular de 75, passo de 0,675, suavização de 0,2, comprimento mínimo de 20 mm e comprimento máximo de 200 mm. Selecione a orientação da semente como "Todos", a posição da semente como "Subvoxel" e escolha aleatoriamente como "Ativado". Use a interpolação de direção trilinear com um algoritmo de rastreamento de Eline (Euler). Para cada combinação de regiões acima, escolha "Executar rastreamento" no & #34; Fibra Tracts "janela.
      NOTA: Devido à natureza aleatória do rastreamento, "falsas fibras" claras são identificadas e removidas seletivamente, com as regiões de evitação desenhadas à mão como uma "Nova Região".
  5. Affine registar o cérebro extraído T1 ponderada 3D MP-RAGE scan fornecido no Human Connectome Project dados ajustados para a difusão dados usando o "Slices -> inserir T1 / T2 imagens" função de DSI-Studio. Gere uma renderização de superfície do cérebro selecionando "Slices -> Add Isosurface". Use um "limiar" de 665.

Resultados

O complexo SMA está situado na parte posterior do giro frontal superior. As bordas do complexo SMA são o sulco precentral posterior, o sulco frontal superior inferior-lateralmente eo sulco cingulado inferior-medialmente 18 . O complexo SMA consiste em duas partes: a pré-SMA anterior e a SMA propriamente posterior 18 . Existem diferenças em termos de ligações de matéria branca e função entre estas duas partes 18

Discussão

A Importância e Técnicas de Estudo para os Caminhos da Matéria Branca

O córtex cerebral é aceito como uma estrutura neural principal associada com 2,5 milhões de anos de vida humana. Aproximadamente 20 bilhões de neurônios se separaram em várias partes com base na especificação morfológica e celular 40 . A arquitetura de cada uma dessas partes corticais tem sido funcionalmente sub-agrupadas, tais como sensorimotor sentido e movimento, experiência emocional e...

Divulgações

Os autores declaram que não há interesses financeiros concorrentes e não há fontes de financiamento e apoio, incluindo qualquer equipamento e medicamentos.

Agradecimentos

Os dados foram fornecidos em parte pelo Projeto Connectome Humano, Consórcio WU-Minn (Investigadores Principais: David Van Essen e Kamil Ugurbil; 1U54MH091657), financiado pelos 16 Institutos e Centros NIH que apoiam o NIH Blueprint for Neuroscience Research; E pelo McDonnell Center for Systems Neuroscience na Universidade de Washington. As Figuras 2A e 2D foram reproduzidas com permissão da colecção Rhoton 57 (http://rhoton.ineurodb.org/?page=21899).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
%4 Paraformaldehyde SolutionAFFYMETRIX, Inc. 2046C208used to fixation
FreezerINSIGNANS-CZ70WH6used to freez
Panfield DissectorAESCULAPFD305used to dissection
Surgical Micro ScissorW. Lorenz 04-4238used to miscrodissection
Surgical Micro HookV. Mueller NL3785-009used to miscrodissection
MICRO VESSEL STRETCHER/DILATORW. Lorenz 04-4324used to miscrodissection
Emax2 SC 2000 Electric ConsoleAnspach CompaniesSC2102used to craniatomy
Drill SetAnspach CompaniesNS-CZ70WH6used to craniatomy
20-1000 operating microscopeMoeller-Wedel,GermanyFS 4-20used to miscrodissection
Canon EOS 550D 18 MP CMOS APS-C Digital SLR CameraCanon Inc.DS126271used to take photos
EF 100mm f/2.8L IS USM Macro LensCanon Inc.4657A006used to take photos
MR-14EX II Macro Ring Lite (Flash)Canon Inc.9389B002used to take photos
TripodLino Manfrotto322RC2used to take photos
MAYFIELD Infinity Skull ClampIntegra Inc.A0077used to fix the head
Modified Skrya 3T "Connectome" ScannerSiemens Company, Inc. A911IM-MR-15773-P1-4A00used to scan DTI
XstereO PlayerYury GolubinskyVersion 3.6(22)used to create anaglyphs
EF-S 18-55mm f/3.5-5.6 IS II SLR LensCanon Inc.2042B002used to take photos
Scalpel6B INVENT 7-104-Lused to make incision
Compact  Speed Reducer Anspach CompaniesCSR60used to make burr hole 
14 mm Cranial Perforator Anspach CompaniesCPERF-14-11-3Fused to make burr hole 
2 mm x 15.6 mm Fluted Router Anspach CompaniesA-CRN-Mused to make craniotomy
2.1 mm Pin-shaped BurrsAnspach Companies03.000.130Sused to make craniotomy

Referências

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