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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.

Resumo

Gabaérgica interneurônios corticais são uma população heterogênea de células que desempenham um papel crítico em regular a saída de excitatórios neurônios piramidais, bem como sincronizar as saídas dos conjuntos de neurônio piramidal. Déficits na função interneurônio têm sido implicados em uma variedade de distúrbios neuropsiquiátricos, incluindo esquizofrenia, autismo e epilepsia. A derivação de interneurônios corticais de células-tronco embrionárias não só permite o estudo de seu desenvolvimento e função, mas fornece insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes a patogênese de distúrbios relacionados com interneurônio corticais. Interneurônios também tem a notável capacidade de sobreviver, migrar e integrar acolhimento circuitos corticais pós-transplante, tornando-os candidatos ideais para uso em terapias baseadas em células. Aqui, apresentamos um escalável, altamente eficiente e modificado do embryoid corpo-a-monocamada método para a determinação dos progenitores de interneurônio Nkx2.1-expressando e seus descendentes de células estaminais embrionárias de rato (mESCs). Usando uma linha de mESC de repórter dual Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, Nkx2.1 progenitores ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando podem ser isolado através de fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e posteriormente usado em um número de aplicações a jusante. Nós também fornecemos métodos para enriquecer para parvalbumin (PV) ou somatostatina subgrupos de interneurônio (SST), que pode ser útil para estudar os aspectos de determinação de destino ou para uso em aplicações terapêuticas que se beneficiariam de interneurônio subgrupo enriquecido transplantes.

Introdução

Em ambos os ratos e os seres humanos, aproximadamente metade dos interneurônios inibitórios tudo corticais (Cristo) se originam dentro de uma estrutura subcortical transitória, conhecida como a medial Eminência ganglionar (MGE), onde os progenitores neuroepithelial de cinsa e outros neuronal e glial subgrupos expressam o fator de transcrição Nkx2.11,2. Subgrupos de CIn ou subtipos são definidos pela interseção morfológica, neuroquímica, eletrofisiológicos e conectividade características3,4. O MGE-derivado de Cristo pode ser agrupados em subgrupos principalmente não-sobreposição com base em sua expressão de PV ou de SST, a expressão da qual correlaciona-se com particular eletrofisiológicos e conectividade tendências5. Disfunção dos interneurônios, especialmente aqueles no subgrupo PV, tem sido implicada em vários neuropsiquiátricas distúrbios e doenças6,7. O objectivo geral deste método é para produzir células-tronco derivadas de progenitores mitóticas e migratórias precursores enriquecidos para PV ou SST CIn destino para estudar Biologia interneurônio cortical e para uso em terapias baseadas em células.

Nós desenvolvemos um método altamente eficiente, escalável para a derivação de progenitores de interneurônio Nkx2.1-expressando e seus descendentes de mESCs. Usando uma Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dupla repórter mESC linha8, Nkx2.1 progenitores ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando podem ser isolados através de FACS e posteriormente usado em um número de aplicações a jusante. Ao manipular um número de vias de sinalização, duração da cultura e modo de neurogênese, podemos obter milhões de precursores interneurônio fluorescente etiquetadas apropriados para uma série de aplicações a jusante.

Apesar de vários outros métodos existem para gerar MGE-como progenitores de mESCs9,10,11,12,13,14, nosso método, que depende o Wnt antagonista Antônio-939, é particularmente eficiente na geração de co expressando progenitores tele-encefálico Foxg1/Nkx2.1. Além disso, a capacidade de selecionar para progenitores interneurônio ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando através do nosso sistema de dupla repórter, aumenta muito a capacidade de gerar distintas progenitores e seus descendentes.

Protocolo

Nota: A linha de mESC dupla repórter descrita neste protocolo está disponível mediante solicitação (sande@mail.med.upenn.edu).

1. preparação de mídia

Nota: Aquecer todos os meios a 37 ° C antes do uso em cultura de células.

  1. Mídia de fibroblasto embrionário mouse (MEF) (para a preparação de 500 mL)
    1. Adicione 50 mL soro de bovino fetal (FBS) 449 mL de Dulbecco médio (DMEM modificado águia) e filtrar através de uma unidade de filtração 500ml 0.22 µm poro.
    2. Adicione o agente antimicrobiano de 1 mL (50 mg/mL) após a filtração. Armazenar a mídia em 4 ° C por até 1 mês ou alíquota e loja a ≤-20 ° C.
  2. N2 mídia (para a preparação de 500 mL)
    1. Adicionar 5 mL de L-alanina-L-glutamina (100x) e 500 µ l 2-mercaptoetanol (55 milímetros) a 489,5 mL DMEM: F-12 mistura de nutrientes (DMEM/F-12) e filtrar através de uma unidade de filtração 500ml 0.22 µm poro.
    2. Adicione o agente antimicrobiano de 1 mL (50 mg/mL) e 5 mL de N2 suplemento-B após a filtragem. Armazene a mídia em 4 ° C no escuro por até 1 mês.
  3. Meio de crescimento livre de soro (KSR) (para a preparação de 500 mL)
    1. Adicione 75 mL de suplemento de soro livre médio, 5 mL de L-glutamina (100x), 5 mL MEM aminoácidos não essenciais (MEM-timina) (100x), e 500 µ l 2-mercaptoetanol (55 milímetros) para não 413,5 mL-glutamina contendo DMEM e filtrar através de uma unidade de filtração 500ml 0.22 µm poro.
    2. Adicione o agente antimicrobiano de 1 mL (50 mg/mL) após a filtração. Armazene a mídia em 4 ° C por até 1 mês.
  4. Mídia de células-tronco embrionárias de rato (para a preparação de 500 mL)
    1. Adicionar a classe de células-tronco 75ml FBS, 5ml MEM-timina (100x), 5 mL de L-glutamina (100 x), e 500 µ l 2-mercaptoetanol (55 milímetros) para não 413,5 mL-glutamina contendo DMEM e filtrar através de uma unidade de filtração 500ml 0.22 µm poro.
    2. Adicione o agente antimicrobiano de 1 mL (50 mg/mL) após a filtração. Armazenar a mídia em 4 ° C no escuro por até 1 mês ou alíquota e loja a ≤-20 ° C.

2. cultivo mESCs

  1. Placa mitotically MEF alimentador células inativas em mídia MEF em placas de cultura de tecidos tratada em 3-4 x 104 células/cm2. Permitir que pelo menos 12 h para eles a se estabelecer em uma incubadora de cultura de célula a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2 antes do chapeamento do mESCs. Se não usado imediatamente, substitua a mídia MEF a cada 3 dias. Livrou-se de MEFs não utilizados no prazo de 7 dias do chapeamento.
  2. Adicione mESCs (faixa de densidade de 1-4 x 104 células/cm2) para placas MEF no mESC mídia contendo Mouse fator inibitório de leucemia (mLIF) (1.000 U/mL). Incube a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2células.
  3. Passagem mESCs usando do trypsin-EDTA (tripsina 0,05%) (1:5-1:10) uma vez que se torna o prato ~ 70-80% confluente ou se as colônias estão começando a tocar. Isto normalmente ocorre a cada 2 dias, mas pode demorar até 4 ou 5 dias, dependendo da densidade inicial do chapeamento.
  4. Manter os mESCs em uma camada de alimentador MEF médio e mESC manter pluripotência.
  5. Antes de iniciar a diferenciação, passagem das células pelo menos uma vez em placas de gelatina revestida sem MEFs para diluir para fora os MEFs.
    1. Preparar as placas de gelatina revestida pela adição de 0,1% gelatina em solução salina tamponada fosfato (PBS) com Ca2 +/ mg2 + para um prato de cultura de tecidos Tratado e deixando a 37 ° C, durante pelo menos 1 h. chapa de 1,5 a 2 x 106 células/10 placa de cm (2.7-3.6 x 104 células/cm2) e permitir que as células expandir por 2 dias antes do início de diferenciação.

3. diferenciar mESCs em direção a MGE-como progenitores tele-encefálico

  1. Dia de diferenciação (DD) 0 = "flutuar em células"
    1. Depois os mESCs cresceram placas de gelatina revestida por 2 dias, aspirar a mídia e lavar as células uma vez com PBS sem Ca2 +/ mg2 +. Adicione o suficiente do trypsin-EDTA (tripsina 0,05%) para cobrir a superfície da placa (normalmente 4 mL do trypsin-EDTA para um prato de cultura de tecido de 10 cm) e colocar as células volta para a incubadora a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2 por 4 min.
    2. Depois de 4 min, saciar o tripsina-EDTA usando 2 vezes o volume com mídia mESC. Transferir as células para um tubo de centrífuga de tamanho adequado e centrifugar as células a 200 x g por 5 min. Depois de 5 min, retire o tubo e aspire a mídia sem perturbar o sedimento. Resuspenda o pellet em mídia KSR:N2 (1:1) de 1 mL contendo o inibidor BMP LDN-193189 (250 nM) e o inibidor de Wnt Antônio-939 (10 µM).
    3. Medir a concentração de células usando um hemocytometer ou contador automatizado de células. Iniciar o crescimento de células como corpos do embryoid (EBs) adicionando 75.000 células/mL em meios KSR:N2 (1:1) contendo LDN-193189 (250 nM) e Antônio-939 (10 µM) em pratos de cultura de tecidos não-aderente. Incube a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2células.
  2. Na DD1, prepare-se para célula "desembarque" por revestimento pratos de cultura de tecidos tratado com poli-L-lisina (10 µ g/mL em PBS com Ca2 +/ mg2 +) durante a noite (O/N) a 37 ° C, com umidade relativa ≥ 95% ou pelo menos 1 h.
  3. DD2, Aspire o poli-L-lisina e revestir as placas com laminina (10 µ g/mL em PBS com Ca2 +/ mg2 +) O/N a 37 ° C, com umidade relativa ≥ 95%.
    Nota: Enquanto O/N é ideal, tão pouco como 2 h pode ser suficiente. Se as placas não são usadas no dia seguinte, Aspire laminina, substituir com PBS sem Ca2 +/ mg2 +e armazenar a 4 ° C por até 2 semanas.
  4. DD3 ("células de terra")
    1. Antes de iniciar a dissociação do EB, aspirar a laminina e deixe as chapas completamente seco em uma capa de cultura de tecidos. Não utilize placas que aparecem brilhantes ou visivelmente molhado. Transferi o EBs com mídia em um tubo de 15 mL e centrifugar para 3-4 min em 15 x g, ou até que a EBs ter peletizado.
  5. Aspire a mídia e adicionar 3 mL de solução de desprendimento de células contendo DNase (2 U/mL) e incubar a 37 ° C, com umidade relativa ≥ 95% e 5% de CO2 por 15 min. flick suavemente o tubo a cada 3 min para auxiliar na dissociação de EB.
  6. Uma vez que a EBs não são mais visíveis ou decorridos 15 min, adicione 6 mL KSR:N2 (1:1) contendo DNase (1 U/mL) e centrifugar durante 5 min à x 200g.
  7. As células KSR:N2 (1:1) contendo LDN-193189 da placa (250 nM), Antônio-939 (10 µM) e o inibidor ROCK Y-27632 (10 µM) em 4,5-5 x 104 células/cm2.

4. SST-enriquecendo o protocolo: "DD12 GFP alta Sonic Hedgehog (SHH)" (continuação da etapa 3.7)

  1. Na DD5, mudar de mídia com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e SSH (50 ng/mL).
  2. Preparar as placas de cultura de tecido para re-chapeamento no dia 8 (etapa 4.4) usando as instruções descritas em etapas 3.2-3.3.
  3. Na DD7, mudar de mídia com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e o SHH (50 ng/mL).
  4. Na DD8, re-placa as células.
    Nota: Embora este passo não é essencial, re-chapeamento as células pode reduzir tipos de células diferenciadas precoce, indesejada. Re-chapeamento também rompe-se bolas de células que dificultam análises imuno-histoquímica a jusante e aumenta a eficiência da FACS nos pontos de tempo mais tarde.
    1. A re-placa células, separar as células da placa com tripsina-EDTA (tripsina 0,05%) por 5 min a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2. Saciar o tripsina-EDTA usando 2 vezes o volume com KSR:N2 e centrifugar 200 x g por 5 min. filtrar as células através de um tubo de filtro de 40 µm para remover qualquer touceiras. Re-placa as células em 250.000 células/cm2 na N2/KSR (1:1), contendo o FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e Y-27632 (10 µM) com SHH (50 ng/mL).
      Nota: Se em vez disso, a decisão é feita para não re-placa as células na DD8, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 contendo SHH (50 ng/mL) em 2 dias de DD7 para DD12 e continuar a adicionar o IGF-1 (20 ng/mL) e FGF-2 (10 ng/mL) até DD9.
  5. Na DD10, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 contendo SHH (50 ng/mL).
  6. Na DD12, para obter as células que são enriquecidas por subtipos de SST, use FACS para isolar Lhx6::GFP-expressando apenas células.
    1. Para desprender as células, use um reagente de célula-dissociação contendo tripsina não ao invés do trypsin-EDTA. Lave as células uma vez com PBS sem Ca2 +/ mg2 +. Adicionar previamente aquecido não-tripsina contendo células-dissociação reagente contendo DNase (2 U/mL) para as células. Colocá-los na incubadora a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2 por 10-30 min ou até que as células têm destacado. Bata levemente as placas cada 5min para auxiliar a dissociação.
      Nota: Para culturas DD11-12, apenas 10-15 min pode ser necessário. Para culturas de DD15-16, 30 min ou mais podem ser exigida para dissociação completa.
    2. Uma vez que as células têm levantado completamente no prato, proceder ao isolamento de FACS usando protocolos padrão ou usar as células em outras análises a jusante.

5. PV-enriquecendo o protocolo: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (continuação da etapa 3.7)

  1. Na DD5, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL) e IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Prepare-se para re-chapeamento no DD8 placas de cultura de tecidos (etapa 4.4) usando as instruções descritas em etapas 3.2-3.3.
  3. Na DD7, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL) e IGF-1 (20 ng/mL).
  4. Na DD8, re-placa as células conforme descrito na etapa 4.4 com as seguintes exceções: quando re-chapeamento das células, substitua SHH smoothened agonista (SAG; 30 nM) e adicionar inibidor PKC atípica (aPKCi; 2 µM). Tomados em conjunto, a mídia re-chapeamento é agora N2/KSR (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM) e aPKCi (2 µM).
  5. Na DD10, mude os meios de comunicação com KSR:N2 contendo aPKCi (2 µM).
  6. DD11
    Nota: neste momento, as células Nkx2.1::mCherry+ são enriquecidas para se tornar PV cinsa.
    1. Separe as células da placa para FACS usando o mesmo protocolo descrito na etapa 4.6. Se a decisão é feita para coletar células Nkx2.1::mCherry+ em um dia mais tarde de diferenciação, ignore esta etapa.
  7. Na DD12, mude os meios de comunicação com KSR:N2 contendo aPKCi (2 µM). Na DD14, mude os meios de comunicação com KSR:N2 contendo aPKCi (2 µM). Na DD16, mude os meios de comunicação com KSR:N2 contendo aPKCi (2 µM). Na DD17, recolha as células de Nkx2.1::mCherry+ usando o mesmo protocolo descrito na etapa 4.6.

6. PV-enriquecendo o protocolo: "DD17 mCherry Low SHH" (continuação da etapa 3.7)

  1. Na DD5, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL) e IGF-1 (20 ng/mL). Na DD7, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL) e IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Na DD9, mude os meios de comunicação com KSR:N2 (1:1). Deste ponto em diante, sem fatores de crescimento adicionais são necessárias.
    1. Continue a mudar os meios de comunicação a cada 2 dias até a colheita das células na DD17.

Resultados

O protocolo descrito neste documento é uma versão modificada de nossos protocolos publicados15,16,17 e foi otimizado para uso com nossa linha de dual-repórter mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Adicionando o inibidor de Wnt Antônio-939 de DD0-5, combinado com o re-chapeamento no DD8, alcançaremos a indução de Nkx2.1 robusta, onde mais de 50% de todos os núcleos DAPI + na cultura são também...

Discussão

Enquanto este método é altamente eficaz na padronização J1-derivado de mESCs (SCRC-1010), nós experimentamos sucesso variável com outras linhas de mESC e isolados clonais. Por exemplo, Foxg1::venus mESCs (EB3-derivado; Danjo et al 13) responder mal para este protocolo e indução de Foxg1 por DD12 é tipicamente na ordem de 1-2%. Por razões que não entendemos, Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP outro repórter dual clone (denominado JQ59) foi isolado simultaneamente como a linha descrita n...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Nós estamos gratos ao Qing Xu para desenvolver a linha de mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP repórter dual, bem como Jennifer Tyson, Asif Maroof e Tim Petros para seus primeiros trabalhos em ajudar a desenvolver este protocolo. Agradecemos também o núcleo de citometria de fluxo CHOP para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por um NIH R01 MH066912 (SA) e F30 MH105045-02 (DT).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Bottle-top vacuum filter systemCorningCLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap CapThermoFisherCorning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M)MTI-GlobalstemGSC-6101G1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBSAtlanta BiologicalsS11150H
PrimocinInvivogenAnt-pm-2Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-BStemcell Technologies7156Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x)ThermoFisher35050061Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR)ThermoFisher10828028Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x)ThermoFisher25030081
MEM-NEAA (100x)ThermoFisher11140050
2-MercaptoethanolThermoFisher21985023
KnockOut DMEMThermoFisher10829018Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBSVWR82013-578Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm)BD Falcon353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm)VWR25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF)ChemiconESG1107Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12ThermoFisher11330032
0.1% Gelatin SolutionATCCATCC PCS-999-027
LamininSigmaL2020
Poly-L-lysineSigmaP6282
Trypsin-EDTA (0.05%)ThermoFisher25300054
AccutaseThermoFisherA1110501Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM610A
LDN-193189Stemgent04-0074Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939Stemgent04-0046Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2R&D Systems233-FBResuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2R&D Systems291-G1Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632)Tocris1254Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG)Millipore566660-1MGResuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHHR&D Systems464-SH-025Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, MyristoylatedEMD Millipore539624Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

Referências

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