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Resumo

Este protocolo eficientemente estuda divisão de células de mamíferos em matrizes de colágeno 3D, integrando a sincronização da divisão celular, monitoramento de eventos de divisão em matrizes 3D usando a técnica de imagem live-célula, microscopia de reflexão confocal tempo-resolvido e análise quantitativa de imagem.

Resumo

O estudo de mamífero como a divisão celular é regulamentado em um 3D ambiente permanece largamente inexplorado, apesar de sua relevância fisiológica e significado terapêutico. Possíveis razões para a falta de exploração são as limitações experimentais e desafios técnicos que tornam o estudo da divisão celular em 3D cultura ineficiente. Aqui, descrevemos um método baseado em imagem para estudar eficientemente a divisão de células de mamíferos e célula-matriz interações em matrizes de colágeno 3D. Células rotuladas com H2B fluorescentes são sincronizadas usando a combinação de tratamento de bloqueio e nocodazole timidina, seguido por uma técnica mecânica de agitar-se. Células sincronizadas depois são incorporadas a uma matriz de colagénio 3D. Divisão celular é monitorada usando microscopia de viver-pilha. A deformação das fibras de colágeno durante e após a divisão celular, que é um indicador de interação célula-matriz, pode ser monitorizada e quantificados usando microscopia de reflexão confocal quantitativa. O método fornece uma abordagem eficiente e geral para estudar a divisão de células de mamíferos e célula-matriz interações em um ambiente 3D fisiologicamente relevante. Esta abordagem não só fornece novos insights sobre a base molecular do desenvolvimento do tecido normal e doenças, mas também permite o desenho de novas abordagens diagnósticas e terapêuticas.

Introdução

Mitose da célula é um evento crítico na vida celular, o Regulamento das quais tem um papel crucial no desenvolvimento de tecidos e órgãos. Mitose anormal está implicada na variação genética natural, os processos de envelhecimento humano e a progressão do câncer1,2,3,4,5. O aumento da taxa de proliferação de células tumorais em comparação com células normais é uma das marcas registradas do cancro, apesar do fato de que comportamentos de célula são bastante heterogêneos entre os diferentes tipos de tumores e até mesmo entre os pacientes. Apesar de resultados promissores pré-clínicos, alguns medicamentos antimitóticos recém-desenvolvidos não têm demonstrado para ser eficaz em testes clínicos6,7,8,9,10 ,11. A relevância de modelos experimentais e pré-clínicos tem que ser considerado. Muitos tipos de células de mamíferos e câncer normais dividem-se em matrizes de tridimensionais (3D), como fibroblastos e células de Fibrossarcoma em colágeno-rico 3D tecidos conjuntivos e células de câncer metastático na matriz extracelular do estroma 3D (ECM). No entanto, a grande maioria dos experimentos de divisão de células de mamíferos e os ensaios foram realizada em células cultivadas em substratos de bidimensional (2D). Uma matriz 3D projetado melhor pode recapitular a microestrutura, propriedades mecânicas e bioquímicos sinais de ECM 3D de ambos os tecidos normais e patológicos12,13,14, 15,16,17.

O estudo de mamífero como a divisão celular é regulado em 3D ambientes permanece largamente inexplorado, apesar de tanto a relevância fisiológica e o significado terapêutico18,19. Possíveis razões incluem a dificuldades técnicas e desafios experimentais associados a estudar a divisão celular em matrizes 3D. Mitose celular constitui uma pequena fração temporal no ciclo celular completo20. Trabalho anterior demonstrou que a taxa de proliferação de muitas células de mamíferos, como o adenocarcinoma de mama humano MCF-7, osteossarcoma humana U2OS e fígado humano HepG2, é muito menor em matrizes 3D em comparação com suas contrapartes em substratos 2D21, 22. Além disso, células incorporado em matrizes 3D entram e saem de foco durante a imagem latente da viver-pilha. Todos esses fatores contribuem para a extremamente baixa eficiência de captura de eventos de divisão celular em 3D cultura usando técnicas de imagem.

Interações entre o ECM e células desempenham um papel crítico na regulação de divisões celulares. Aqui, descrevemos uma abordagem para estudar a divisão de células de mamíferos em matrizes de colágeno 3D eficientemente. O método inclui a incorporação de marcadores mitóticas para as células, sincronização da divisão celular, bem como o acompanhamento dos eventos de divisão em matrizes 3D usando a técnica de imagem live-célula, microscopia de reflexão confocal tempo-resolvido, e análise quantitativa de imagem. Proteína de fluorescência-etiquetada histona H2B é introduzido pela primeira vez dentro das células, como um marcador para diferenciar mitose e interfase as células. Em seguida, as células são sincronizadas usando a combinação de tratamento de bloqueio e nocodazole timidina, seguido por uma técnica mecânica de agitar-se. Células sincronizadas então são encapsuladas diretamente em matrizes de colágeno 3D. Eventos de divisão celular de células múltiplas são monitorados com eficiência usando imagens de viver-pilha baixa-ampliação lapso de tempo. A deformação das fibras de colágeno, que é um indicador de interação célula-matriz, é monitorada usando microscopia confocal reflexão em alta ampliação.

Anteriormente usamos essa técnica para monitorar e quantificar a interação célula-matriz antes, durante e após a mitose de duas linhas de células de câncer metastático, carcinoma ductal invasivo humano MDA-MB-231 e Fibrossarcoma humana HT1080 células, colágeno 3D matrizes de19. Os métodos aqui apresentados fornecem uma abordagem eficiente e geral para estudar os dois mamíferos divisão celular em um 3D interações de ambiente e célula-matriz. A linha de celular MDA-MB-231 é usada como um exemplo em todo o papel. Este protocolo fornece novos insights sobre a base molecular do desenvolvimento do tecido normal e doenças e também pode permitir para a concepção de novas abordagens diagnósticas e terapêuticas.

Protocolo

O protocolo fornecido segue as diretrizes de Homewood The das revisão institucional na placa (HIRB).

1. expressao de H2B-mCherry como um marcador para a mitose da célula

  1. Geração de particulas de Lentivirus de rim embrionário humano 293T (HEK 293T) células
    1. As células HEK 293T numa placa de cultura de células de 10 cm em uma densidade populacional de 5 x 106 células/prato em meio de cultura celular (de Dulbecco médio (DMEM) contendo alta glicose modificado águia (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% de soro Fetal bovino (FBS) e 1% da placa penicilina-estreptomicina (caneta/Strep)). Incube por 24 h a 37 ° C e 5% de dióxido de carbono (CO2). A desejado confluência das células no dia do transfection é cerca de 70-80%.
      Nota: As células de 293T HEK são usadas aqui para produzir partículas virais, que serão usadas posteriormente para transduce MDA-MB-231 células a fim de gerar uma linhagem de células expressando estàvel H2B-mCherry. Certifique-se que as células estão distribuídas uniformemente através da placa. Adição das células largas sábio à placa e suavemente movendo a placa e para trás pode ajudar na distribuição uniforme. Células também podem ser semeadas em placas ou frascos de outros tamanhos, o que resultarão na coleção de diferentes volumes de partículas virais.
    2. Transfect as células HEK 293T usando um reagente de transfeccao com três plasmídeos (vetor de Lentivirus, CMV ΔR 8,91 e pMDG-VSVG). O plasmídeo codificação H2B-mCherry é clonado em um vetor de Lentivirus com promotor de fosfoglicerato quinase (PGK). ΔR CMV 8,91 contém três necessários HIV genes, gag, pole rev. pMDG-VSVG contém o gene de envelope de VSV-G.
      Nota: Existem vários agentes de Transfeccao para escolher.
      1. Permitir que o frasco de reagente de Transfeccao para atingir a temperatura (RT) antes do uso. Invertido ou vórtice do frasco brevemente.
      2. Mix 16 µ g de DNA, que consiste de 6 µ g de plasmídeo H2B-mCherry, 8 µ g de ΔR CMV 8,91 e 2 µ g do pMDG-VSVG, em 1 mL de mídia soro reduzida. Incube a RT por 5 min.
        Nota: A quantidade e a proporção dos três vetores é variado e otimizado para vetores de transferência Lentivirus diferentes.
      3. Adicione 48 µ l (use a proporção de 1:3 do DNA: reagente de transfeccao) do reagente de Transfeccao para a solução de DNA acima e então incubar a RT pelo menos 15 min.
        Nota: A relação do DNA vs reagente de transfeccao é variada e otimizada para vetores de transferência Lentivirus diferentes. Certifique-se que o reagente de transfeccao não entra em contacto com o lado do tubo de centrífuga de 1,5 mL.
      4. Adicione a solução de complexos lipídios-DNA feita na etapa 1.1.2.3 drop-wise para as células. Agite suavemente a placa para garantir a distribuição uniforme do complexo no prato.
    3. Aproximadamente 6 h após a transfeccao, aspirar a médio e adicionar o meio de cultura celular fresco (DMEM com a glicose alta (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% FBS e 1% caneta/Strep).
    4. Recolher o sobrenadante 24, 48 e pós-transfecção 72 h. Substituir o médio após cada colheita (DMEM, 4,5 g/L glicose, piruvato de sódio, com 10% FBS e 1% caneta/Strep).
    5. Filtre as Particulas de Lentivirus através de um filtro de 0,45 µm para remover os restos celulares. Alternativamente, spin para baixo o sobrenadante para separar para fora os detritos de células. O sobrenadante pode ser usado para transdução imediatamente, ou pode ser armazenado a-80 ° C.
  2. Geração de célula linhas estàvel expressando H2B-mCherry
    Nota: Este protocolo é descrito em detalhes para células MDA-MB-231. Antes de utilizar no experimento, células de carcinoma de mama humano MDA-MB-231 (centro de Oncologia de ciências físicas, NIH) são cultivadas em DMEM com glicose alta (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% FBS e 1% caneta/Strep.
    1. As células de MDA-MB-231 em uma densidade populacional de 1 x 105 células numa placa de cultura de 35 mm da placa.
      Nota: A densidade do chapeamento para linhas de célula diferente deve ser otimizada e, portanto, pode ser diferente a densidade ideal para as células de MDA-MB-231.
    2. 24 h após o chapeamento das células, adicionar 1 mL de vírus e 1 mL de meio fresco (DMEM, glicose alta (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% FBS e 1% caneta/Strep).
    3. Incube as células para um período de 6 h durante a noite.
      Nota: Tanto o volume do vírus e o tempo de incubação precisa ser otimizado para linhas celulares diferentes. Por exemplo, se as células não parece saudáveis algumas horas após a adição do vírus, utilize 1 mL de vírus e 2 mL de meio fresco (DMEM, glicose alta (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% FBS e 1% caneta/Strep) para etapa 1.2.2. Pode também ser reduzido o tempo de incubação na etapa 1.2.3.
    4. Aspire o meio e adicionar 10 mL de meio fresco (DMEM, glicose alta (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% FBS e 1% caneta/Strep). Encube por entre 24 a 72 horas a 37 ° C e 5% de CO2.
    5. Verifique se a expressão de H2B-mCherry nas células usando um microscópio de epifluorescência.
      Nota: Se a eficiência de transdução é baixa nas células, o volume de vírus na etapa 2.2 e o tempo de incubação na etapa 2.3 poderia ser aumentado.

2. sincronização das células expressando estàvel H2B-mCherry

  1. Placa em cada poço de uma placa de 24 células as células em 50 a 60% confluencia, ou seja, placa de 2 x 104 MDA-MB-231.
  2. Incube a cultura em 37 ° C e 5% CO2 por 24 h.
  3. Substituir o meio de crescimento com 0,5 mL de meio (DMEM, glicose alta (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% FBS e 1% caneta/Strep) contendo timidina 2mm e deixar na incubadora durante 24 h.
    Nota: As células expostas a timidina são presos na fase de crescimento celular (G1) / transição de síntese (S) de DNA e durante a fase S devido a inibição da síntese de DNA. A duração da incubação deve ser variada e otimizada para linhas de célula diferente.
  4. Libere as células da exposição de timidina lavando-os com solução salina tamponada fosfato (PBS) três vezes. Incubar em seguida, as células em meio de cultura celular normal (DMEM, glicose alta (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% FBS e 1% caneta/Strep) por 5h.
    Nota: A liberação das células a partir da exposição de timidina permite que as células avançar para o crescimento de células (G2) / mitótica (M) fase para células anteriormente preso na fase G1/S e à fase G1 para células anteriormente preso ao S de fase. O comprimento do tempo de liberação deve ser variado e otimizado para linhas de célula diferente.
  5. Bloquear as células com 250 ng/mL de nocodazole para 12 h.
    Nota: Todas as células expostas a nocodazole são presos na fase G2/M. Nocodazole é citotóxica. A exposição prolongada ao nocodazole pode causar apoptose. Ajuste o período ou concentração de exposição para linhas de célula diferente se mortes de célula são observados. As células que são sincronizadas com êxito irão expor uma morfologia esférica.
  6. Agitar as células para 45 s a 1 min usando um agitador orbital em 150 a 200 rpm.
    Nota: Células mitóticas, que têm pouca aderência ao substrato, serão abaladas durante o processo.
  7. Remover o meio para extrair células, pipetando o meio para um tubo de centrifugação e em seguida, adicionar 0,5 mL de meio fresco (DMEM, glicose alta (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% FBS e 1% caneta/Strep) para cada poço da placa.
  8. Repita os passos de 2,6 e 2,7 três vezes.
  9. Centrifugue a mídia coletada que contém as células mitóticas na 800 x g, durante 3 min.
    Nota: Este passo é usado para remover o nocodazole do meio celular.

3. incorporação do sincronizado células em colágeno matrizes

Nota: Tipo I colágeno é a proteína mais abundante no organismo humano e na ECM dos tecidos conjuntivos e, portanto, é amplamente utilizado para investigar a célula eucariótica como funções são moduladas por um ambiente 3D17,23,24 . Colágeno é solúvel em ácido acético. Após a neutralização e o aquecimento da solução de colágeno para 20-37 ° C, monômeros de colágeno polimerizam em uma malha de fibras de colágeno.

  1. Prepare a solução de x DMEM a 10 pela dissolução de um pacote de pó DMEM, 3,7 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3) e 1 g de 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) em 50 mL de água destilada. Filtrar a solução e então prepare-se 1 M de hidróxido de sódio (NaOH) pela dissolução de 2 g de NaOH pelotas em 50 mL de água destilada. Filtro e alíquota da solução em tubos de centrífuga de 1,5 mL.
    Nota: A solução DMEM Normal não deve ser usada nesta etapa. A adição de um volume significativo da solução de colágeno diluirá o meio. Portanto, a solução concentrada de DMEM é preparada para garantir que a concentração final de DMEM na matriz de colágeno será o mesmo que o DMEM normal.
  2. Continue a trabalhar com as células coletadas de passo 2.9. Aspire a médio e ressuspender as células em cerca de 0,25 - 0,5 mL de meio de cultura celular fresco (DMEM, glicose alta (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% FBS e 1% caneta/Strep).
    Nota: Para chegar a uma densidade de célula específica na matriz de colagénio, a densidade inicial de células em suspensão não pode ser muito baixa. Assim, o volume do meio usado para re-suspender as células dependerá do número total de células disponíveis.
  3. Lugar de 10 µ l da solução de célula re-suspenso da etapa 3.2 em um hemocytometer e contagem a densidade das células na solução.
  4. Determine os volumes necessários para todos os componentes fazer a matriz de colagénio 3D. 500 µ l de gel de colágeno µ g / µ l 2 é usado aqui como um exemplo.
    1. Calcule o volume da solução de células necessária para obter a 40.000 células/mL (ou 20.000 células para a 500 µ l de gel de colágeno). Este número em µ l é X. 50 µ l de 10 x DMEM será necessária. 50 µ l de FBS serão necessários.
    2. Calcule o volume de colágeno que armazeno necessário. A concentração de colágeno I é em torno de 4 µ g / µ l. A quantidade de colagénio necessário em µ l é Y.
    3. Calcular o volume de hidróxido de sódio precisa neutralizar o ácido acético na solução de colágeno: colágeno de µ l Y * 0,023 * 1000 = Z µ l NaOH necessária.
    4. Determinar o volume da solução de enchimento: (500 µ l total gel - células de X µL - 50 µ l 10 X colágeno para µ l de Y do 50 µ l de FBS - DMEM - Z µ l NaOH) = R µ l
      Nota: A solução de enchimento é destilada água. Se o volume calculado de solução o enchimento é um número negativo, a densidade celular original na suspensão de célula é muito baixa. As células precisam ser girado para baixo novamente e re-suspenso em um menor volume de meio (DMEM, glicose alta (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% FBS e 1% caneta/Strep).
  5. Adicionar os componentes na seguinte ordem para um tubo de centrifugação limpa 1,5 mL: células em média, 10 x DMEM, FBS, deionizada (DI), colágeno, NaOH. Coloque todos os componentes no gelo para abrandar a gelificação da solução de colágeno. Use técnicas de pipetagem apropriadas para evitar a formação de bolhas.
  6. Depois de adicionar o NaOH, misture cuidadosamente a solução com uma pipeta de 1 mL.
    Nota: Gelificação do colágeno vai começar certa imediatamente após a adição de NaOH. Mistura deve ser feito com cuidado e rapidamente.
  7. Uma vez que a solução é bem misturada, adicione 500 µ l da solução a cada poço da placa de 24 poços. Coloque a placa de 24 na incubadora 37 ° C. Coloque o meio de cultura celular fresco em banho-maria a 37 ° C.
    Nota: Placas de plástico inferior são utilizadas para viver-pilha de baixa ampliação microcopy em que a distância de trabalho da lente é acima de 1 mm. fundo de vidro as placas são usadas para microscopia de viver-pilha alta ampliação devido a curta distância de trabalho de alto lente de ampliação.
  8. Adicionar 500 µ l de meio pré-aquecido (DMEM, glicose alta (4,5 g/L), piruvato de sódio, 10% FBS e 1% caneta/Strep) ao topo do gel 30 min depois de concluir a etapa 3.7.

4. live Cell Imaging das células se dividindo em matrizes de colágeno 3D (baixa ampliação)

Nota: Imagens de células são coletadas em intervalos de 2 min, usando uma câmera de dispositivo acoplado (CCD) de carga montada em um microscópio de contraste de fase que é equipado com um objetivo X 10 e controlado pelo software de imagem.

  1. Liga a unidade de célula viva montada em cima da lente objetiva. Espere até que a temperatura se estabilize a 37 ° C, a concentração de CO2 é de 5% e a umidade é de 75%.
  2. Colocar a placa de gel 24 na unidade de célula viva no microscópio. Encontrar o fundo do prato e em seguida, mova a lente objetiva até o microscópio centra-se em cerca de 500 µm da parte inferior da placa.
    Nota: As células na matriz do colágeno que estão muito perto do fundo do prato não são completamente incorporados na matriz 3D. As células que são 500 µm longe da parte inferior da placa de imagem irá garantir que as células não são afetadas pelos efeitos de borda16,17,25.
  3. Mova o palco ao redor para encontrar as células e selecione várias posições para a imagem latente.
  4. Configure o experimento de lapso de tempo em intervalos de 2 min.
    Nota: O número máximo de posições que podem ser tomadas durante o intervalo de 2 min é limitado pela velocidade de movimento do palco motorizado e o comprimento do tempo de exposição para captura de imagens.

5. o colágeno rede deformação durante a divisão celular (microscopia de alta magnificação)

  1. Liga a unidade de célula viva montada em cima da lente objetiva. Espere até que a temperatura se estabilize a 37 ° C, a concentração de CO2 é de 5% e a umidade é de 75%.
  2. Para visualizar as fibras de colágeno em matrizes de colágeno 3D imaculado, configure um microscópio confocal para capturar a luz apenas refletida (488 nm) do 488 nm laser usado para iluminar a amostra. O laser usa um 60 X objetivo de água-imersão, at = 1.2, WD = 200 µm e é controlado pelo software de imagem.
  3. Colocar a amostra (células em matrizes de colágeno) na unidade de células vivas. Encontrar o fundo do prato e em seguida, mova a lente objetiva até o microscópio centra-se em cerca de 100 µm do fundo da placa. As células que são 100 µm longe da parte inferior da placa de imagem irá garantir que as células não são afetadas pelos efeitos de borda.
    Nota: Aqui um objectivo de imersão de água é usado em vez de uma lente de imersão de óleo porque a distância de trabalho da lente de imersão de óleo é apenas cerca de 100 µm. O uso da lente óleo-imersão coloca um problema como a espessura do vidro na parte inferior da placa é normalmente cerca de 100 µm.
  4. Mova o palco ao redor para encontrar as células e selecione várias posições para a imagem latente.
    Nota: Microscopia Confocal opticamente seções a amostra e só capta os sinais do plano focal. Células vivas se podem estar dentro e fora de foco durante o experimento de lapso de tempo. Para habilitar a captura de imagens da célula, durante longos períodos de tempo, Z-pilha é usada para coletar imagens de sucessivas fatias em intervalos de 5 µm. São imagens de um total de 5 fatias, abrangendo 25 µm.
  5. Configure o experimento de lapso de tempo em intervalos de 5 min.
    Nota: 5 minutos é usado aqui como o intervalo em vez de 2 min, usado na seção 4, porque múltiplos modos de varredura, incluindo digitalização para H2B-mCherry, reflexo de digitalização para colágeno e Z-pilha de varredura, de fluorescência são aplicados para cada posição. O uso de múltiplos modos de digitalização reduz a velocidade de varredura de uma posição quando comparado com a imagem de baixa ampliação.
  6. Quantificar a deformação da matriz de colágeno na proximidade de uma célula, devido à força exercida por essa célula usando a partícula velocimetry (PIV) com sub-pixel resolução20de imagem. Realizando esta análise em imagens 2D permite a visualização clara de ambos os sinais do H2B-mCherry e as fibras de colágeno. Aplique a passa-baixa anisotropic filtragem para melhorar o sinal do colágeno rede20.
  7. A fim de medir o deslocamento local de uma região sub imagem de interesse localizado em (x,y) do quadro k k+ 1 do quadro, extraia uma janela regional de 15 × 15 pixels centrado em (x,y) no quadro k. Em seguida, identificar a melhor correspondência locais (x,y) * através os locais que apresentam um coeficiente de correlação cruzada normalizado máximo na imagem obtida no quadro k+ 1. O vetor de deformação é calculado como (x,y) *-(x,y).

Resultados

O objetivo deste artigo é apresentar um método baseado em imagem para estudar processos de divisão de células de mamíferos em matrizes 3D e para quantificar as interações entre a célula e a matriz extracelular 3D durante e após a divisão celular. Para facilitar a geração de imagens da mitose celular, incorporamos H2B-mCherry em células de MDA-MB-231 usando Lentivirus transdução. H2B conjugados com proteínas fluorescentes é usado como um marcador mitótico para distinguir ...

Discussão

O estudo prévio de divisão celular em 3D não era eficiente devido às limitações experimentais e desafios técnicos18,19. Os passos críticos para o estudo eficiente de divisão de células de mamíferos em matrizes de colágeno 3D são: (1) a incorporação de fluorescência-etiquetada marcadores mitóticas para as células; (2) a sincronização da divisão celular; e (3) o acompanhamento dos eventos de divisão em matrizes 3D usando a técnica de imagem l...

Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01CA174388 e U54CA143868. Os autores gostaria de reconhecer o prêmio PURA da Universidade Johns Hopkins para suporte de Chen Wei-tong. Este material é baseado em trabalho suportado pela nacional Science Foundation Graduate bolsa de pesquisa sob Grant no. 1232825.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Human embryonic kidney 293TATCC
MDA-MB-231Physical Sciences Oncology Center, NIH
DMEMCorning10-013-CV
DMEM powderThermoFisher Scientific12100-046
Fetal bovine serumHycloneSH30910.03
Penicillin-Streptomycin 100XSigma-AldrichP0781
Fugene HDPromegaE2311
Lipofectamine 2000Life technologies11668-07
Plasmid encoding H2B-mCherry in a lentiviral vectorAddgeneplasmid 21217
ThymidineSigma-AldrichT1895
NocodazoleSigma-AldrichM1404
Opti-MEMLife Technologies31985-070
Sodium bicarbonateGibcoBRL11810-025
HEPESSigma-Aldrich113375-100
CollagenCorning354236
NaOHJ.T. Bake3722-01
Millex-HV syringe filter unit, 0.45-μm, PVDF, 33 mmMilliporeSLHVM33RS
Nikon TE2000E epifluorescence microscopeNikonTE2000E
Cascade 1K CCD cameraRoper Scientific
NIS-Elements AR imaging softwareNikon
Nikon A1 confocal microscopeNikonA1

Referências

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