Indução e Micro-CT Imaging de malformações cavernosas cerebrais no modelo de Mouse

Resumo

Este protocolo demonstra a indução da doença malformação cavernosa cerebral em um modelo do rato e usa contraste aprimorado micro computadorizada para medir carga de lesão. Esse método aumenta o valor dos modelos de rato estabelecida para estudar a base molecular e terapias potenciais para malformação cavernosa cerebral e outras doenças cerebrovasculares.

Resumo

Mutações no CCM1 (aka KRIT1), CCM2, ou CCM3 (aka PDCD10) gene causar malformação cavernosa cerebral (CCM) em seres humanos. Modelos do rato da doença CCM foram estabelecidos pela exclusão de tamoxifeno induzido de Ccm genes em animais pós-natal. Esses modelos de rato fornecem ferramentas de valor inestimáveis para investigar o mecanismo molecular e abordagens terapêuticas para a doença CCM. Um método exato e quantitativo para avaliar a progressão e o fardo da lesão é essencial para aproveitar o valor total desses modelos animais. Aqui, demonstramos a indução da doença do CCM em um modelo do rato e o uso do contraste melhorado método de (micro-CT) radiografia computadorizada micro medida CCM encargo de lesão no cérebro de rato. No dia pós-natal 1 (P1), usamos 4-hydroxytamoxifen (4HT) para ativar a atividade de recombinase Cre do transgene de Cdh5-CreErt2 para decompor o alelo floxed de Ccm2. Lesões do CCM em cérebro de rato foram analisadas em P8. Para o micro-CT, solução de Lugol à base de iodo foi usada para aumentar o contraste no tecido cerebral. Nós temos otimizado os parâmetros de verificação e utilizou uma dimensão de voxel de 9,5 µm, que levam a um tamanho mínimo de recurso de aproximadamente 25 µm. Esta resolução é suficiente para medir o número e volume de lesão CCM globalmente e com precisão e fornecer alta qualidade 3D mapeamento de lesões do CCM em cérebro de rato. Esse método aumenta o valor dos modelos rato estabelecida para estudar as bases moleculares e terapias potenciais para CCM e outras doenças cerebrovasculares.

Introdução

CCM são de paredes finas, dilatado malformações vasculares no cérebro, com prevalência de até 0,5% na população humana¹. CCM pode ser herdada como uma desordem dominante devido a mutações de perda de função em um dos três genes: CCM1 (aka Krit1), CCM2e CCM3 (também chamado PDCD10)^{2,3,4 ,5,6}. Estes genes estão presentes em um único complexo de sinalização.

Foram desenvolvidos vários modelos para doenças humanas de CCM modelo e entender os caminhos a jusante de genes CCM que são responsáveis por CCM^7,8,9,10. O modelo mais robusto é condicionalmente excluir qualquer um dos genes Ccm com tamoxifeno-inducible Cdh5-CreERT2 em P1 em filhotes recém-nascidos^8,10. Esses filhotes desenvolvem lesões CCM no cérebro de P6 para a frente e são esperados para ser um modelo ideal para estudos pré-clínicos em busca de mecanismos e agentes terapêuticos no tratamento de doenças do CCM.

Fardo de lesão CCM em cérebro de rato foi medido principalmente pelos métodos baseados em histologia, uma abordagem que é extremamente demorado e sujeito a investigador viés de^11,10,12. MRI com base em métodos foram usados para avaliar a carga de lesão CCM no rato adulto modelo^9,13. No entanto, um instrumento de MRI animal pequeno altamente especializado e varredura-tempo de várias horas durante a noite é necessária para alcançar uma resolução satisfatória para identificar lesões CCM. Também, não foi relatada se ressonância magnética pode ser usada para detectar lesões do CCM em camundongos Neonatais e resolução pode limitar a sensibilidade.

Recentemente desenvolvemos uma técnica de micro-CT para imagem e analisar CCM lesão^14,15. De alta resolução, tempo e método cost-effective dramaticamente impulsionaram o valor do modelo de doença CCM em estudos terapêuticos e mecanicistas. Melhorar o contraste, toda montagem coloração métodos têm sido utilizados para a imagem latente de micro-CT dos tecidos moles e rato embriões^16,17. Anteriormente, usamos uma baseada no ósmio de coloração para realçar o contraste para a imagem latente de micro-CT de lesões do CCM no cérebro¹⁴. Neste trabalho, usamos um menos tóxico, não-destrutivo, e reagente custo-eficiente, um iodo solução baseada em solução de Lugol, para realçar o contraste para a imagem latente de micro-CT. Iodo pode difundir em todo o cérebro e tem uma elevada afinidade para sangue¹⁸.

O protocolo detalhado é apresentado aqui para a indução de lesões do CCM em um modelo de rato neonatal, junto com a imagem e análise de lesões CCM com uma contraste baseados micro-CT. Este método baseado em micro-CT fornece medição global quantitativa do volume de lesão do CCM, identifica com precisão o número e a localização em 3D das lesões do CCM no cérebro do rato e reduz o custo e tempo necessário para o fenótipo desses animais.

Protocolo

todos os protocolos e ética animal foram aprovados pelo The Sydney Local Saúde Animal Welfare Comissão distrital e institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de medicina de Tianjin. Todos os experimentos foram conduzidos em Diretrizes/Regulamento do centenário Instituto, Universidade de Sydney e a Universidade de medicina de Tianjin

1. Indução de malformações cavernosas cerebrais em modelos de Mouse

1. Cruz Cdh5-CreErt2; Ccm2 ^fl/fl ratos com Ccm2 ^fl/fl para gerar ninhadas com Cdh5-CreErt2; Ccm2 ^fl/fl filhotes (Ccm2 ^iECKO) e controles littermate (Ccm2 ^fl/fl). Cdh5-CreErt2 e Ccm2 ^fl/fl animais têm sido descritas anteriormente ¹⁹.
2. Dissolver 4HT em 100% de etanol e armazenar a-80 ° C, em alíquotas de 30 µ l (4HT concentração: 10 mg/mL). No dia do uso, diluir aliquotadas 4HT em óleo de milho (0,5 mg/mL).
3. Intragastrically injetar 50 µ l de 4HT (0,5 mg/mL) para filhotes neonatais em P1 para induzir lesões CCM experimentais utilizando uma seringa de insulina.

2. Preparação para Micro-CT Scans da amostra

1. eutanásia neonatais filhotes no P8 através de dióxido de carbono asfixia.
2. Realizar a perfusão intra cardíaca através da inserção de uma agulha de calibre 29 com 3 mL de 2% paraformaldeído em PBS em uma seringa de 10 mL para o ventrículo do coração do mouse.
   Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar proteção adequada.
3. Separar a cabeça do corpo usando uma tesoura. Remova toda a pele se a cabeça usando uma tesoura e descolar o crânio usando fórceps para dissecar o cérebro todo.
4. Tirar fotos do cérebro com duas oculares em 7,82 x ampliação, 1 x ganho, 0,6 gama e tempo de exposição de 20 ms.
5. Consertar o cérebro dissecado com paraformaldeído 4% em solução de PBS durante a noite.
   Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; usar proteção adequada.
6. No dia seguinte, desanexar hindbrains usando uma pinça e lavar com solução de PBS.
7. Incubar os hindbrains no Lugol ' s solução de iodo por 48 h.
8. Após a incubação, brevemente ar seco os hindbrains para remover o excesso Lugol ' solução de iodo de s.
9. Pack o Lugol ' iodo s manchado hindbrains em 0,65 mL microcentrifuge tubos e selo completamente com filme plástico parafina para evitar o encolhimento do tecido ( Figura 2).
10. Coloque microcentrifuga tubos em tubos de plástico de 5 mL com esponjas para impedir a movimentação durante a verificação ( Figura 2 B).

3. Micro-CT Scan do CCM no cérebro do rato

1. verticalmente, montar o rombencéfalo embalado em um tubo em um suporte de alumínio no sistema de micro-CT.
2. Definir os parâmetros de digitalização para 540 projeções e tempo de exposição 2 s com condições de fonte de 50 kV e 10 W para adquirir os conjuntos de dados tomográficos (imagem resolução 9,5 μm/pixel).
3. Radiografias do exame são reconstruídas automaticamente pelo software de reconstrução de projeção baseada em hardware fornecido pelo sistema micro-CT, produzindo uma série de imagem de 16 bits fatias axiais (" TXM " arquivo).

4. Análise de conjuntos de dados Micro-CT

1. abrir o arquivo de imagem reconstruída (" TXM " arquivo) do software de análise em 3D e visualizar o cérebro usando o " renderização de volume " função.
2. Transformar o rombencéfalo à orientação desejada usando o " caixa delimitadora " e " plano de recorte " funções.
3. Resample na imagem transformada em modo estendido e preservar o tamanho de voxel.
4. Criar " editar novo rótulo de campo " na imagem transformada (4.3) e destacar apenas o rombencéfalo usando intensidade greyscale.
5. Adicionar as áreas destacadas e executar " etiqueta análise " para obter medições do rombencéfalo inteira (ou seja, total volume e área). Exportar as medições em um arquivo Excel.
6. Visualizar o rombencéfalo usando o " isosuperfície renderização " função.
7. Criar outro " editar novo rótulo de campo " sobre as áreas de imagem e destaque transformadas com lesões usando a escala de cinzentos intensidade.
8. Adicionar as áreas destacadas e executar " rótulo " análise para obter medições das lesões dentro do rombencéfalo (i.e., volume total e área). Exportar as medições em um arquivo Excel.
9. Visualizar as lesões utilizando o " gerar superfície " e " vista de superfície " funções.
10. As imagens do rombencéfalo em orientações desejados de instantâneo ou gerar um filme para visualização em 3D das lesões.

Resultados

Uma única injeção de 4HT no P1 foi suficiente para induzir lesões CCM no cerebelo. Solução de Lugol iodo contrastado micro-CT suficientemente detectado lesões CCM e podia quantificar o volume e o número. Estamos utilizando o micro-CT otimizado, fotografada lesões CCM nos hindbrains de Ccm2^iECKO ratos. Imagens digitalizadas de raios-x foram reconstruídas para produzir imagens em 3D do cérebro do rato, que permitiu a visualização de lesões inteiras no par?...

Discussão

CCM é uma malformação vascular comum que afeta até 0,5% de indivíduos¹. CCM pode ocorrer de forma esporádica ou familiar. Prognóstico do paciente é muitas vezes pouco claro como lesões CCM podem romper inesperadamente para causar acidente vascular cerebral e outras consequências neurológicas. Atualmente, a único tratamento opção é remover cirurgicamente lesões, que são acompanhadas de alto risco.

Recentemente foram reproduzidas em condições humanas de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy tamoxifen	Sigma-Aldrich	H6278	To activate Cdh5-CreErt2
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML	To dilute 4-hydroxy tamoxifen
Stereomicroscope	Leica	M205FA	To take macroscopic images
Lugol's Iodine solution	Sigma-Aldrich	L6146	To stain samples for contrast micro-CT
Plastic paraffin film	Parafilm	PM992	To package samples
Micro-CT	Xradia	MicroXCT-400	Micro-CT
3D rendering software	FEI Visualization Science group	Avizo 3D image processing software	To analyse micro-CT scans