유도 및 마우스 모델에서 대뇌 동굴 같은 기형의 마이크로-CT 영상

요약

이 프로토콜 대뇌 동굴 같은 기형 질병 마우스 모델에서의 유도 및 고 사용 대비 향상 된 병 변 부담을 측정 하기 위해 마이크로 컴퓨터 단층 촬영. 이 방법은 분자 기초 및 대뇌 동굴 같은 기형에 대 한 잠재적인 치료 및 기타 뇌혈관 질병 연구 설립된 마우스 모델의 가치를 향상 시킵니다.

초록

돌연변이 CCM1 (일명 KRIT1), CCM2, 또는 CCM3 (일명 PDCD10) 유전자는 인간의 대뇌 동굴 같은 기형 (CCM) 일으킬. CCM 질병 마우스 모델 출생 후 동물에서 Ccm 유전자의 tamoxifen 유도 삭제에 의해 설립 되었습니다. 이 마우스 모델 분자 메커니즘 및 CCM 질병에 대 한 치료 접근을 조사 하는 귀중 한 도구를 제공 합니다. 병 변 및 진행을 평가 하는 정확 하 고 양적 방법 이러한 동물 모델의 전체 가치를 활용 하기 위해 필수적 이다. 여기, CCM 질병 마우스 모델에서의 유도 시연 하 고 대비를 사용 하 여 향상 된 마우스 두뇌에서 측정 CCM 병 변 부담 x 선 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 메서드. 출생 후 하루 1 (P1), 우리 다니엘 Ccm2의 floxed 대립 유전자를 Cdh5 CreErt2 transgene에서 Cre recombinase 활동을 활성화 하기 위해 4-hydroxytamoxifen (4HT) 사용. 마우스 두뇌 병 변 CCM P8에 분석 되었다. 마이크로-CT, 뇌 조직에 대비 향상을 기반으로 하는 요오드는 Lugol의 솔루션 사용 되었습니다. 우리는 검색 매개 변수를 최적화 하 고 이어질 약 25 µ m의 최소 기능 크기 9.5 µ m의 복 치수를 활용. 이 해결책은 세계적으로 그리고 정확 하 게, CCM 병 변 볼륨 및 수를 측정 하 여 마우스 두뇌 병 변 CCM의 높은-품질 3 차원 매핑을 제공 충분 합니다. 이 메서드는 CCM 및 기타 뇌혈관 질환에 대 한 분자 및 잠재적인 치료 연구 설립된 마우스 모델의 가치를 향상 시킵니다.

서문

CCM는 얇은 벽으로, 뇌의 혈관 기형 인간의 인구¹에서 최대 0.5%의 보급으로 크기. CCM 3 개의 유전자 중 하나에 손실의 기능 돌연변이 때문에 지배적인 무질서로 상속 될 수 있습니다: CCM1 (일명 Krit1), CCM2및 CCM3 ( PDCD10라고도 함)^{2,3,4 ,,56}. 이 유전자는 복잡 한 신호에 존재 하는.

CCM^7,8,,910에 대 한 책임은 CCM 유전자의 다운스트림 경로 이해 하 고 모델 인간의 CCM 질병에 다양 한 모델 개발 되었습니다. 가장 강력한 모델 조건부로 신생아 강아지^8,10p 1에서 tamoxifen을 유도할 수 있는 Cdh5 CreERT2 와 함께 Ccm 유전자 중 하나를 삭제 하는 것입니다. 이 새끼는 이후 P6에서 뇌 병 변 CCM을 개발 하 고 검색 메커니즘에 대 한 전 임상 연구 및 치료제 CCM 질병 치료에 대 한 이상적인 모델이 될 것으로 예상 된다.

쥐의 뇌에서 CCM 병 변 부담 조직학 기반 방법, 매우 시간이 걸리는 하는 방식으로 주로 측정 되었다 하 고 조사에 따라 바이어스^10,,1112. MRI 기반 방법 성인 마우스 모델^9,13CCM 병 변 부담을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나, 고도로 전문화 된 작은 동물 MRI 계기와 하룻밤 몇 시간의 긴 검색 시간 CCM 병 변 식별에 만족 스러운 해결책을 달성 하기 위해 필요 합니다. 또한, 여부 MRI 신생아 쥐에 있는 CCM 장애 감지를 사용할 수 있는 보고 하지 않은 고 해상도 감도 제한할 수 있습니다.

우리는 최근 이미지 CCM 병 변^14,15를 분석 하는 마이크로-CT 기술 개발. 이 고해상도, 시간 및 비용 효율적인 방법을 극적으로 증가 기계 및 치료 연구에 CCM 질병 모델의 값. 대비 향상, 전체 마운트 착 방법 부드러운 조직 및 마우스 배아^16,17의 마이크로-CT 영상에 대 한 사용 되었습니다. 이전에 우리는 오스뮴 기반 얼룩을 사용 뇌¹⁴병 변 CCM의 마이크로-CT 영상에 대 한 대비 향상. 이 문서에서 우리는 더 적은 독성, 비-파괴적인, 사용 하 고 비용 효율적인 시는 요오드 기반 Lugol의 솔루션, 마이크로-CT 영상에 대 한 대비를 강화 하. 요오드 두뇌에 걸쳐 확산 수 있으며 혈¹⁸에 대 한 높은 선호도 있습니다.

자세한 프로토콜은 여기는 이미징 함께 신생아 마우스 모델에서 CCM 변의 유도 및 발표 대비 기반 마이크로 중부와 CCM 장애의 분석 이 마이크로-CT 기반된 메서드 CCM 병 변 양의 양적 글로벌 측정, 수와 쥐의 뇌 병 변 CCM의 3 차원 위치를 정확 하 게 식별 하며 비용을 크게 줄일 수와 시간 표현 형이이 동물 있어야 합니다.

프로토콜

모든 동물 윤리 및 프로토콜 시드니 지역 건강 지구 동물 복지 위원회 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 천진 의과대학의에 의해 승인 했다. 모든 실험 100 주년 연구소, 시드니 대학, 천진 의과대학의 지침/규정에 따라 실시 했다

1. 마우스 모델에서 대뇌 동굴 같은 기형의 유도

1. 크로스 Cdh5-CreErt2; Ccm2 ^{fl/플로리다} Ccm2 ^{fl/플로리다}와 새끼를 생성 하와 쥐 Cdh5-CreErt2; Ccm2 ^{fl/플로리다} (Ccm2 ^iECKO) 새끼 및 littermate 컨트롤 (Ccm2 ^{fl/플로리다}). Cdh5-CreErt2 및 Ccm2 ^{fl/플로리다} 동물 앞에서 설명한 ¹⁹ 되었습니다.
2. 4HT 100% 에탄올에 녹이 고 30 µ L의 aliquots에서-80 ° C에서 저장 (4HT 농도: 10 mg/mL). 사용 당일, 옥수수 오일 (0.5 mg/mL)에서 aliquoted 4HT 희석.
3. Intragastrically 4HT의 50 µ L를 주사 (0.5 mg/mL)는 인슐린 주사기를 사용 하 여 실험 CCM 장애를 유도 하는 p 1에서 신생아 강아지를.

2. 마이크로-CT 검사에 대 한 준비를 샘플

1. 이산화탄소 질 식 통해 P8에 신생아 강아지를 안락사.
2. 마우스 심장의 심 실에 10 mL 주사기에 PBS에 2% paraformaldehyde 3 mL와 29 게이지 바늘을 삽입 하 여 내 심장 관류 수행.
   주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호 착용.
3. 는가 위를 사용 하 여 본문에서 머리를 분리 합니다. 머리는 위를 사용 하 여 모든 피부를 제거 하 고 껍질 전체 뇌 해 부를 집게를 사용 하 여 두개골을.
4. Stereomicroscope와 두뇌의 확대, 1 x 이득, 0.6, 감마와 20 ms 노출 시간 x 7.82에서 촬영할.
5. 해결 해 부 두뇌 PBS 솔루션에서 4 %paraformaldehyde 하룻밤.
   주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호 착용.
6. 다음 날에는 집게를 사용 하 여 hindbrains를 분리 하 고 PBS 솔루션 세척.
7. Lugol에 hindbrains를 품 어 ' 48 h. s 요오드 솔루션
8. 인큐베이션, 다음 짧게 공기 건조 초과 Lugol 제거 하려면 hindbrains ' s 요오드 솔루션.
9. 는 Lugol 팩 ' s 요오드 스테인드 0.65 mL microcentrifuge 튜브에 조직을 수축 ( 그림 2 A)를 피하기 위해 플라스틱 파라핀 영화와 완전히 물개 hindbrains.
10. 스캔 ( 그림 2 B) 동안 이동에서 그들을 방지 하기 위해 스폰지와 함께 5 mL 플라스틱 튜브에서 microcentrifuge 튜브 장소.

3. 쥐의 뇌에서 CCM 마이크로-CT 스캔

1. 수직 마이크로 CT 시스템에서 알루미늄 홀더에 튜브에 포장 hindbrain 탑재.
2. 540 투영 및 50의 소스 상태 2 s 노출 시간에 검색 매개 변수를 설정할 단층 데이터 집합 (이미지 해상도 9.5 μ m/픽셀)을 얻으려고 kV 및 10 W.
3. 검사에서 검사는 재건축 자동으로 하드웨어 기반 투영 재구성 소프트웨어 마이크로 CT 시스템을 제공한 16-비트 축 조각의 이미지 시리즈 생산 (" TXM " 파일).

4. 마이크로-CT 데이터 집합의 분석

1. 복원된 이미지 파일 (" TXM " 파일) 3 차원 분석 소프트웨어에서 두뇌를 사용 하 여 시각화는 " 볼륨 렌더링 " 함수.
2. 변환 사용 하 여 원하는 방향 hindbrain는 " 경계 상자 " 및 " 클리핑 평면 " 기능.
3. 확장된 모드에서 변환 된 이미지를 다시 샘플링 하 고 복 크기 보존.
4. 만들기 " 새 레이블 필드 편집 " 변환 된 이미지 (4.3)에 hindbrain 스케일 강도 사용 하 여 강조.
5. 강조 표시 된 영역을 추가 하 고 실행 " 분석 라벨 " 전체 hindbrain (즉, 전체 볼륨 및 지역)의 측정을 얻을. 측정 Excel 파일로 내보내기.
6. Hindbrain를 사용 하 여 시각화는 " isosurface 렌더링 " 함수.
7. 다른 만드는 " 새로운 레이블 필드 편집 " 병 변과 스케일 강도 사용 하 여 변환 된 이미지와 하이라이트 영역에.
8. 강조 표시 된 영역을 추가 하 고 실행 " 레이블 " hindbrain (즉, 전체 볼륨 및 지역) 내에서 장애의 측정을 얻기 위해 분석. 측정 Excel 파일로 내보내기.
9. 시각화를 사용 하 여 병 변은 " 표면 생성 " 및 " 보기 표면 " 기능.
10. Hindbrain 원하는 방향에서의 이미지를 스냅숏 또는 생성 하는 장애의 3 차원 시각화를 위한 영화.

결과

P 1에서 4HT의 단일 주사 소 뇌 병 변 CCM을 유도 하기 충분 했다. Lugol의 요오드 화물 대조 마이크로-CT는 충분히 CCM 장애를 감지 하 고 그것의 양 및 수 정할 수 있습니다. 최적화 된 마이크로-CT를 활용 하 여, 우리 Ccm2^iECKO 쥐의 hindbrains 병 변 CCM을 몇 군데. 검사 x-레이 이미지 생산 다른 깊이 방향에 뇌 실질에 전체 장애의 시각화를 허용, 마우스 뇌의 3 차원 이?...

토론

CCM은 개인¹의 0.5%까지 영향을 미치는 일반적인 혈관 기형입니다. CCM 산발적 또는 가족 형태로 발생할 수 있습니다. 환자 예 후 명확 하지 않습니다 종종 CCM 병 변 원인 뇌졸중 및 기타 신경학 상 결과 예기치 않게 파열 수로. 현재 유일한 치료 옵션은 높은 위험을 동반 하는 병 변 수술로 제거 하는.

인간의 CCM 조건에 재현 되어 최근 동물 모델⁷

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy tamoxifen	Sigma-Aldrich	H6278	To activate Cdh5-CreErt2
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML	To dilute 4-hydroxy tamoxifen
Stereomicroscope	Leica	M205FA	To take macroscopic images
Lugol's Iodine solution	Sigma-Aldrich	L6146	To stain samples for contrast micro-CT
Plastic paraffin film	Parafilm	PM992	To package samples
Micro-CT	Xradia	MicroXCT-400	Micro-CT
3D rendering software	FEI Visualization Science group	Avizo 3D image processing software	To analyse micro-CT scans