O Madagascar silvando barata como um modelo de animais não-mamíferos alternativo para investigar a eficácia da droga, patogenia e virulência

Resumo

Apresentamos um protocolo para utilizar o Madagascar silvando barata como alternativo não-mamíferos modelo animal para realizar estudos de resposta imune inata, patogênese, toxicidade de drogas, eficácia de droga e virulência bacteriana.

Resumo

Muitos aspectos da imunidade inata são conservados entre mamíferos e insetos. Um inseto, o Madagascar silvando barata do género Gromphadorhina, pode ser utilizado como um modelo alternativo de animais para o estudo da virulência, interação patógeno-hospedeiro, resposta imune inata e eficácia da droga. São apresentadas informações para a criação, cuidados e reprodução da barata sibilante. Podemos também ilustrar como ele pode ser infectado com bactérias como os patógenos intracelulares Burkholderia mallei, b. pseudomallei e b. thailandensis. Uso da barata sibilante é barato e supera a lidar com o uso de mamíferos na investigação de assuntos regulatórios. Além disso, resultados encontrados usando o modelo de Barata sibilante são reprodutíveis e semelhantes aos obtidos usando modelos de mamíferos. Assim, a barata de Madagascar que assobia representa um anfitrião substituto atraente que deve ser explorado ao conduzir estudos em animais.

Introdução

O uso de insetos como alternativos não-mamíferos de modelos animais para estudar a patogênese bacteriana e defesa inata do hospedeiro vem ganhando impulso nos últimos anos. Logisticamente, isto é devido ao seu custo relativamente barato e a facilidade na obtenção, manipulação e cuidar dos insetos em relação aos mamíferos. Existe também uma política regulamentar que regem o uso de insetos na investigação; Não é sujeita a alçada ou restrições estabelecidas por qualquer animal usam Agência Comitê ou governo. Insetos como modelos animais de substituto são particularmente aptos para estudos de rastreio abrangente para fatores de virulência, interações patógeno-hospedeiro e avaliações da eficácia de drogas antimicrobianas. Seu uso pode reduzir o número de mamíferos utilizados para a investigação, assim, superar alguns dos dilemas éticos inerentes à realização da experimentação animal ^1,2.

Insetos podem servir como anfitriões substituto porque há um alto grau de semelhança entre os sistemas imune inatas de insetos e mamíferos ^1,3. Ambos plasmatocytes insetos e mamíferos macrófagos fagocitam microorganismos ⁴. A contraparte inseto o neutrófilo é o hematócito ^5,6. Vias de explosão oxidativa intracelular no inseto e células de mamíferos são semelhantes; espécies reativas de oxigênio em ambos são produzidos pela ortólogos p47^phox e p67^phox proteínas ⁵. As cascatas de sinalização a jusante de receptores Toll em insetos e receptores Toll-like e interleucina-1 nos mamíferos também são notavelmente semelhantes; ambos resultam na produção de peptídeos antimicrobianos, tais como defensinas ⁷. Assim, os insetos podem ser utilizados para estudar gerais mecanismos imunes inatos que são compartilhados por metazoários.

Um inseto chamado Madagascar silvando barata do gênero Gromphadorhina, é uma das maiores espécies barata que existe, geralmente, atingindo 5 a 8 cm na maturidade. É nativo apenas para a ilha de Madagáscar e é caracterizada pelo som sibilante - faz um som que é produzido quando a Barata sibilante expele o ar através de aberturas respiratórias chamados espiráculos ⁸. O silvo característico serve como uma forma de comunicação social entre assobios baratas para namoro e agressão ⁹ e pode ser ouvido quando um macho é perturbado em seu habitat. O Madagascar silvando barata é movendo-se lento em comparação com a barata americana e outras espécies de pragas urbanas. É fácil de cuidar e se reproduzem; uma barata sibilante grávida pode produzir 20 a 30 filhotes por vez. Um bebê silvando barata, chamada uma ninfa, atinge a maturidade sexual em 5 meses depois, passando por 6 mudas e pode viver até 5 anos na natureza e em cativeiro ⁸.

Utilizamos o Madagascar silvando barata como um host de substituto para a infecção com patógenos intracelulares Burkholderia mallei, b. pseudomalleie b. thailandensis ^10,11. A virulência destes agentes patogénicos em assobios baratas foi comparada com sua virulência no modelo animal de referência por Burkholderia, o hamster sírio. Nós achamos que a dose letal de 50% (LD₅₀) de b. pseudomallei e b. mallei foi semelhante em ambos os modelos ¹¹. Curiosamente, b. thailandensis, embora avirulentas no modelo de roedor, é letal na barata sibilante ¹¹. Esta diferença em relação a infecção de b. thailandensis ressalta a utilidade do modelo Barata sibilante; B. thailandensis atenuantes mutantes podem ser resolvidos mais facilmente na barata sibilante do que em modelos de roedores. Além disso, como b. thailandensis é muitas vezes usado como organismo modelo para b. pseudomallei e b. mallei ^10,12,13, identificando atenuantes mutações nele poderia levam a destinos semelhantes em seus parentes mais virulentos.

Apesar da diferença de virulência do b. thailandensis na barata sibilante contra o hamster sírio, mutações em fatores de virulência crítica, tais como aquelas no sistema de secreção tipo 6-1 (T6SS-1), que são atenuantes em b. mallei e B. pseudomallei, são da mesma forma atenuantes para thailandensis b. ¹¹. O modelo de Barata sibilante é ainda mais validado em que individual T6SS mutantes (T6SS-2 T6SS-6) em b. pseudomallei, que não têm nenhuma influência na virulência em hamsters sírios, permanecem virulentos na sibilante baratas ¹¹. Assim, a Barata sibilante é um modelo animal substituto viável para as três espécies de Burkholderia . Recentemente, utilizamos a Barata sibilante como um modelo animal de substituto para examinar a eficácia de cloroquina a droga contra a malária (CLQ) contra Burkholderia infecção ¹⁰ e sua toxicidade.

Aqui, descrevemos a criação e os cuidados de Madagascar silvando barata e fornecer detalhes sobre como infectar este inseto com três espécies de Burkholderia . Além disso, ilustramos a Barata sibilante é um modelo substituto viável para estudar a virulência e a eficácia da droga em Burkholderia infecções e que ele provavelmente também pode servir como um host de substituto para outros patógenos bacterianos em estudos semelhantes.

Protocolo

1. os preparativos para a manutenção de uma colônia barata sibilante

1. Prepare as gaiolas para as assobios baratas viver. Aplique uma camada fina de vaselina, cerca de 20 a 30 mm de largura, para a circunferência das paredes internas perto do topo da gaiola para impedir que as baratas sibilantes de escalar fora da gaiola e escapar.
   Nota: Assobio baratas pode ser alojado em uma variedade de recipientes que tem um grande espaço, são de altura suficiente e têm tampas. Use gaiolas de rato (~ 43 x 23 cm x 20 cm). Para gaiolas destinados a 37 ° C, não Aplique vaselina.
2. Incluem uma caixa de papelão de ovos colocada de cabeça para baixo dentro da gaiola para fornecer um esconderijo para os insetos naturalmente tímidos. Não substitua a caixa de ovos de papelão com um feito de espuma de poliestireno para evitar a ingestão de plástico.
3. Não fornece fundamento para a limpeza mais fácil e para aumentar a visibilidade das ninfas recém-eclodidos.
4. Obter o alimento de cão seco que contém uma composição de ~ 20% de proteína bruta. Grosseiramente a moer a comida de cão com um processador de alimentos ou liquidificador e armazenar a 4 ° C.
5. Obter vários pratos rasos e pedras do aquário ou uma esponja para comida e água.
   Nota: placas de Petri são recommeded.

2. sibilante barata cuidados e reprodução

1. Obter outbred Madagascar silvando baratas (~ 5 cm) de um criador comercial. As espécies utilizadas neste protocolo é Gromphadorhina laevigata. Desembale a caixa de transporte contendo as baratas sibilantes imediatamente após o recebimento.
2. Siga as orientações institucionais adequadas para a utilização de equipamentos de proteção individual na manipulação de animais.
   Nota: Use luvas grossas descartáveis para manuseio baratas como as garras do Tarso de uma barata sibilante são afiadas.
3. Transferir até 75 baratas sibilantes grandes (> 3cm) por gaiola grande. Transferir as ninfas recém eclodidas e menores (< 3 cm) para uma gaiola separada.
   Nota: Manter significativamente mais de 75 grandes assobios baratas por gaiola do rato podem levar à deterioração da saúde da colônia e também poderiam resultar em mortes.
4. Lidar com uma barata recém derretida, o que é off-White na cor, com cuidado e evite espremê-lo. Alternativamente, permitir que o exoesqueleto de escurecer e endurecer antes de manipulação.
   Nota: Não é necessário remover os ácaros, Gromphadorholaelaps schaeferi, que muitas vezes acompanham sibilantes baratas em cima do recibo de criadores. Os ácaros benéficos mantém as baratas sibilantes limpo e são inofensivos aos seres humanos.
5. Alimentação assobios baratas com comida de cachorro seco chão em um prato raso, uma ou duas vezes por semana. Fornece suficiente comida de cachorro para garantir que as baratas sibilantes tenham comida suficiente até a próxima alimentação. Rejeite qualquer alimento que tornou-se úmido e mofado.
6. Além de comida de cachorro, fornece pedaços de frutas e vegetais, tais como maçãs, batatas ou alface, em um prato raso. Descarte alimentos mofados ou podre.
7. Fornecer água potável uma ou duas vezes por semana em um prato raso, mas não encha o prato para evitar derramamento na gaiola. Coloque pedras de aquário pequeno ou uma esponja no prato para fornecer uma área de pouso para pequenas ninfas. Use água de osmose reversa, se disponível.
8. Manter silvando baratas no escuro em temperaturas variando de 21 ° C a 30 ° C. Manter grandes baratas sibilantes destinadas a experimentação a uma temperatura mais baixa (~ 21 ° C) por ~ 2 meses diminuir a procriação e a gravidez. Em contrapartida, manter ninfas em temperaturas mais altas (28 ° C a 30 ° C) para acelerar o crescimento.
   Nota: Manter gaiolas à temperatura (21 ° C) em um escuro do armário.
9. Fornece umidade, incluindo uma panela separada de água se assobio baratas são mantidas em uma incubadora.
10. Limpe a gaiola por escavar para fora fezes secas regularmente ou pela transferência de assobios baratas para uma gaiola limpa a cada 2 a 3 semanas. Protege o fundo da gaiola. Limpe a gaiola imediatamente se o excesso de água é permitido para acumular e misture com o excremento no fundo da gaiola.

3. barata preparação para experimentação

1. Transferi o número apropriado de sibilantes baratas numa jaula para uma incubadora umidificado 37 ° C 1 a 3 semanas antes de um experimento para aclimatação. Incluem um grupo de controle para injeção. Este período de aclimatação é fundamental para evitar o choque de temperatura durante a experimentação.
2. Não aplique vaselina para gaiolas destinadas a 37 ° C, porque a temperatura mais alta derrete a gelatina.
3. Verificar as baratas sibilantes cada 1 a 2 dias para substituir a comida e água e limpar a gaiola.
4. Obter recipientes de alimento plásticos descartáveis clara com tampas para agrupar as baratas sibilantes durante a experimentação. Para ventilação, esburacar a tampa ou o lado do recipiente com um prego e um martelo.
   Nota: Contentores de tampa de rosca uso sobre snap cap recipientes na configuração de nível 3 de segurança biológica. Recipientes de pressão cap podem ser reforçadas com fita adesiva, se necessário.
5. No dia da injeção, distribuir 6 a 12 aclimatadas sibilantes baratas em grupos por recipiente, garantindo igual distribuição por sexo e massa corporal.
6. Determine o sexo das baratas sibilantes individuais. Determine o sexo, a proeminência de chifres encontrado em machos e a falta de fêmeas.
7. Pese as baratas sibilantes individuais. Para facilitar a pesagem de uma barata que assobia no contrapeso, coloque-o dentro de dois barcos de pesar que têm sido tarados.
   Nota: Para obter consistência entre experiências, use sibilantes baratas com um peso de 4 a 8 g. No entanto, nenhuma diferença na sobrevivência após infecção foram encontrados entre pequenos (1,5 a 2 g) e sibilante baratas grandes (6 a 8 g). Para estudos de drogas, use sibilantes baratas com um peso de g ~ 5 para obter uma concentração de droga mais consistente por corpo em massa.
8. Em vez de um prato de água, incluem água elevado conteúdo frutas ou vegetais, tais como uma fatia de batata ou maçã. Deite fora a comida podre. Não fornece água adicional para manter o recipiente seco.
9. Retorno silvando baratas a 37 ° C até injeções.

4. preparações e cultura bacteriana

Nota: As espécies bacterianas utilizadas neste protocolo são b. mallei, b. pseudomallei e b. thailandensis. Todas as manipulações com b. mallei e b. pseudomallei devem ser realizadas em classe II ou gabinetes de segurança biológica classe III localizado em um nível de biossegurança (BSL) laboratório 3. Realizar manipulações com b. thailandensis em segurança biológica semelhante armários localizados em um laboratório BSL2 ou BSL3. Siga institucional o procedimento padrão para BSL3 trabalho. Siga as orientações institucionais para o uso de equipamentos de proteção individual ao manipular as bactérias.

1. Prepare um prato principal de Burkholderia pelo menos 3 dias antes da infecção. Use Luria-Bertani (Lennox) (LB) ágar para b. pseudomallei ou b. thailandensis e uso LB ágar suplementado com 4% de glicerol para b. mallei. Bactérias de raia de um estoque de glicerol 25% armazenado a-80 ° C.
   Nota: Sempre marcam a placa mestra directamente a partir do estoque de glicerol congelados; evitar a passagem serial das bactérias de placa para placa pois isto pode causar reduzida virulência.
2. Inocule o caldo de 10 a 20 mL LB com várias colónias de b. pseudomallei ou thailandensis b. da placa de mestre. Da mesma forma inocule caldo LB suplementado com 4% de glicerol para b. mallei.
3. Agite o caldo de cultura em 175 a 250 rpm a 37 ° C ~ 18 h.
4. Centrífuga de 2 a 3 mL de cultura a 5.000 x g durante 10 minutos.
5. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o bacteriana em soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10mm at₂PO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH 7,4).
6. Diluir as bactérias com PBS para atingir uma densidade óptica (OD) de 0.5, medido em uma absorvância em 600 nm num espectrofotómetro.
7. Serialmente dilua as bactérias dez vezes em PBS partir do OD inicial de 0,5. Use estas suspensões para infecção.
8. Determine a colônia formando unidades (CFU) do inóculo pela diluição serial e chapeamento de 100 alíquotas µ l em meios de ágar. Incube as placas a 37 ° C por 24 a 48 h.

5. drogas preparações

1. Determinar a quantidade adequada de droga para ser dada por corpo em massa. A dosagem CLQ dada à Barata sibilante baseou-se na dosagem padrão para mamíferos, que é de 50 mg/kg/dia.
2. Resuspenda ou diluir a droga de interesse no veículo. Por exemplo, dilua CLQ em PBS em uma concentração de 12 mg/mL. Esta concentração fornece 300 µ g de droga para um g ~ 6 silvando barata em um 25 µ l injetado volume.
3. Se necessário, esterilize a solução de drogas por passagem através de um filtro de seringa 0,22 µm.
4. Armazene a solução de droga a 4 ° C até o uso. Aquecer a solução de fármaco pelo menos 21 ° C (temperatura ambiente) antes de injeções.

6. montagem do Injector

1. Defina o ponteiro para o volume desejado (25 µ l), rodando o parafuso de ajuste em uma pipeta repetitiva.
2. Empurre a barra de lançamento da pipeta repetitiva para dentro e puxe o botão para fora. A pipeta repetitiva está agora pronta para acomodar uma seringa carregada.
   Nota: Calibre o volume ejetado por pipeta repetitiva, medindo a quantidade de água ejectada em um equilíbrio.
3. Encha uma seringa de 1 mL com suspensão contendo bactérias ou drogas.
4. Fixar um 26 estéril seringa ou agulha de 27 G x ½ polegada (ou menor).
5. Toque a seringa para flutuar as bolhas de ar no topo e expulsar as bolhas e cerca de suspensão em um recipiente com água sanitária 10%.
6. Encaixe a seringa para o clipe de seringa da pipeta repetitiva com o bisel da agulha voltado para cima.
7. Puxe a barra de lançamento para fora e pressione o botão dispensador com firmeza para executar injeções em branco em um recipiente com água sanitária 10%, até que o êmbolo da seringa é contra o traficante.
8. Realizar 1 ou 2 injeções em branco adicionais para garantir o líquido está sendo ejetado fora a seringa. A pipeta repetitiva está pronta para injeções.

7. barata injeções

1. Executar todas as injeções de barata em uma classe II ou classe III de segurança biológica em um BSL2 ou BSL3 configuração usando institucional recomendado equipamento de proteção pessoal.
2. Limpe as superfícies de trabalho na segurança do armário que podem entrar em contato com as baratas sibilantes. Use água sanitária 10%, seguida por etanol a 70% para remover o cloro residual. Permitir que a superfície ao ar seco.
3. Com uma mão, agarre a Barata sibilante ao seu lado. Imobilize uma barata sibilante tal que é incapaz de recuo durante a injeção. Dobre a Barata sibilante ligeiramente para que as membranas cutâneas entre a terga abdominal são expostas.
4. Com a outra mão, segure a pipeta repetitiva tais que a agulha é um 0 ° de ângulo de 30° da linha média do dorso-ventral a Barata sibilante. Perfure a membrana cutânea adjacente a 3^rd,^thde 4 ou 5^th tergal da extremidade posterior.
   Nota: A entrada da agulha para a Barata sibilante no ângulo indicado garante que a agulha não passar e sair fora a Barata sibilante. Local da injeção garante que o material ejetado está contido dentro da cavidade abdominal, repleta de hemolinfa. Pratique segurando as baratas sibilantes e injectar-se com água antes de injeções de empresa com bactérias vivas ou drogas.
5. Aperte o botão de dispensar firmemente para injetar o volume. Delicadamente, retire a agulha no mesmo ângulo utilizado para a entrada.
6. Lugar a Barata sibilante injetada em um recipiente separado para distingui-lo das assobios baratas que ainda não foram injetadas. Limpe qualquer hemolinfa que pode ter escorria para fora do local da injeção.
7. Continue injetando outras sibilantes baratas dentro de um grupo usando a mesma seringa e agulha. Pare de injetar antes que o êmbolo da seringa atinge o fundo do barril para evitar dosagem incompleta na última injeção.
8. Para injeções múltiplas em uma única Barata sibilante, tais como aqueles com bactérias e drogas, injetar em lados diferentes de uma tergal no lado dorsal das baratas sibilantes. Alternativamente, realizar múltiplas injecções injetando em diferente terga (3^rd para 5^th).
9. Garantir que as tampas dos recipientes são encaixadas. Reforça as tampas com fita adesiva, se necessário.
10. Incube silvando baratas numa incubadora umidificado 37 ° C.

8. gravação silvando barata de morbidade e mortalidade

1. Realize todos os exames de Barata sibilante em uma classe II ou classe III de segurança biológica com institucional recomendado equipamento de proteção pessoal. Limpe as superfícies da segurança do armário com água sanitária 10%, seguida por 70% de etanol. Permitir que a área de trabalho para o ar seco.
2. Marca sibilantes baratas uma ou duas vezes diariamente durante um período de 1 a 2 semanas usando a morbidade marcando a tabela (tabela 1).
3. Retire o recipiente baratas mortas sibilantes e registrar o número de sobreviventes.
4. Transferi o restante ao vivo silvando baratas para um recipiente limpo, se o excesso de umidade acumulada no fundo do recipiente. Como alternativa, use toalhas de papel descartáveis para limpar o excesso de umidade.
5. Substitua a comida podre diária e retorno de assobios baratas para a incubadora umidificado 37 ° C.
6. No final do estudo, coloque sobreviventes em um saco de risco biológico e congelar a-80 ° C para eutanásia.
7. Analisar estatisticamente os dados¹⁴ para determinar LD₅₀ e por análise de Kaplan-Meier e Log-Rank para sobrevivência. Como com todos os insetos experimentação, algumas mortes podem ocorrer no grupo controle. Estas mortes são atribuídas a mortalidade natural dos insetos ¹⁵. Para uma discussão mais detalhada sobre como a conta de mortes no grupo controle, consulte referência¹⁵.

Resultados

Esta seção ilustra os resultados obtidos quando sibilantes baratas de Madagascar foram infectadas com b. mallei, b. pseudomallei, ou b. thailandensis; os resultados mostram que este inseto é um modelo animal tractable para diferentes espécies de Burkholderia em estudar a virulência, toxicidade de drogas e eficácia de drogas contra a infecção bacteriana. Mais baratas sibilantes sobreviveram em grupos que foram infectados com os mutantes atenuados (Δh...

Discussão

Óptimas condições experimentais começam com uma colônia barata sibilante saudável, que exige um mínimo mas compromisso consistente. Embora o assobio baratas pode ir para um período relativamente longo de tempo (~ semanas) sem comida e água, manutenção de bi-semanal ou gaiola deve ser fornecida. Isso inclui verificação de alimentos e abastecimento de água e garantindo que a gaiola é seca. Manutenção das condições de vida seca é especialmente importante durante a aclimatação e incubação em temperatu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Madagascar hissing cockroach	Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC	143668
Kibbles n Bits, any flavor	Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA	UPC #079100519378
Snap on disposable plastic containers or equivalent	Rubbermaid, Huntersville, NC	UPC #FG7F71RETCHIL
Screw on disposable plastic containers or equivalent	Rubbermaid, Huntersville, NC	UPC #FG7J0000TCHIL
Tridak STEPPER series repetitive pipette	Dymax Corporation www.dymax.com	T15469
Syringe (1 mL)	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	309659
Needle (26 or 27G x 1/2)	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	305109, 305111
Chloroquine diphosphate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	C6628
Phosphate buffered saline	Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD	10010023
Difco Luria- Bertani (Lennox)	Becton Dickinson, Sparks, MD	240230
Agar	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A1296
Glycerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G6279