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  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Descrevemos aqui um método simples e rápido para o isolamento de Salmonella typhimurium-contendo phagosomes de macrófagos revestindo as bactérias com biotina e estreptavidina.

Resumo

Salmonella typhimurium é uma bactéria intracelular facultativo que provoca gastroenterite em seres humanos. Após a invasão da propria do lamina, S.. typhimurium bactérias são rapidamente detectadas e fagocitadas por macrófagos e contidas em vesículas, conhecidas como phagosomes, a fim de ser degradado. Isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes têm sido amplamente utilizados para estudar como S. typhimurium infecção altera o processo de maturação do fagossoma para prevenir a degradação bacteriana. Classicamente, o isolamento de bactérias contendo phagosomes foi executada por centrifugação gradiente de sacarose. No entanto, esse processo é demorado e requer equipamento especializado e um certo grau de destreza. Descrito aqui é um método simples e rápido para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes de macrófagos revestindo as bactérias com grânulos magnéticos estreptavidina-biotina-conjugados. Phagosomes obtidos por esse método podem ser suspenso em qualquer reserva de escolha, permitindo a utilização de phagosomes isolados para uma ampla gama de ensaios, tais como análise de proteínas, metabólito e lipídios. Em resumo, este método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes é rápida, eficiente e específico, requer equipamento mínimo e é mais versátil do que o método clássico de isolamento por gradiente de sacarose-ultracentrifugação.

Introdução

Os macrófagos estão circulando em células fagocíticas especializadas que detectam, englobam e degradam qualquer partícula estranha presente em tecidos periféricos, variando de pilhas apoptotic a invadir microorganismos tais como bactérias. Em cima da superfície mediada reconhecimento de marcadores específicos do patógeno comumente presentes na superfície dos microorganismos (conhecido como patógeno associado a padrões moleculares ou PAMPs), macrófagos iniciar uma complexa reorganização da membrana celular em fim de cercar e phagocytize o patógeno1.

O patógeno tragado então contido pelo macrófago em uma vesícula intracelular denominada fagossomo. Através de uma série de fusão e fissão eventos com outras vesículas como endossomos e lisossomos, o patógeno contendo fagossoma adquire um conjunto de proteínas necessárias para a eliminação do conteúdo phagosomal. Portanto, a composição enzimática do fagossomo é altamente variável no decurso deste processo, conhecido como fagossoma maturação2.

Logo após a fagocitose, a complexo ATPase vacuolar (v-ATPase) da membrana do fagossomo é incorporada por fusão com endossomos3multiméricas. Este complexo utiliza ATP para bombear protões do citosol para o lúmen do fagossoma4. Acidificação do fagossomo é essencial para os eventos de fusão com outras vesículas5 e para a ativação de um grande número de enzimas degradativos dependente do pH6. Outra multiméricas complexo enzimático que é rapidamente montado na membrana do fagossomo é o complexo NADPH-oxidase (NOX). NOX complexo oxida NADPH para produzir espécies reativas de oxigênio (ROS) que são segregadas para o lúmen do fagossoma e que contribuem significativamente para a matança do tragado microorganismos7.

Durante os passos iniciais da maturação, phagosomes apresentar marcadores normalmente como Rab5 e Rab7 de endossomos cedo e tarde, respectivamente, juntamente com a subunidade de0 V do v-ATPase8. Fusão de phagosomes com lisossomos e tarde endossomos resulta na exposição do patógeno fagocitada para uma grande variedade de enzimas hidrolíticas, como proteases catepsina, lipases e β-galactosidase9. Acidificação do lúmen é também necessária para a ativação destas enzimas. Por exemplo, a clivagem de catepsina D para produzir o formulário curto ativo é dependente do pH10. Essas enzimas degradam o patógeno e mediam a produção de derivados de patógeno peptides curtos que são apresentados pelas macrófago histocompatibilidade (MHC) classe II moléculas complexas de células T para desencadear uma resposta imune adaptativa11.

Daí, maturação do fagossoma é crucial para a resposta imune inata e links braços do sistema imune inatos e adaptativos. Não é nenhuma surpresa que os patógenos desenvolveram estratégias para superar a eliminação por macrófagos pelo processo de maturação do fagossoma acima descritas. Por exemplo, a bactéria intracelular Mycobacterium tuberculosis e Legionella pneumophila impede a maturação do fagossoma inibindo v-ATPase assembly e o lúmen consequente acidificação12,13 . Outras bactérias, como a Listeria monocytogenes ou Shigella flexneri induzem a formação de poros na membrana do fagossomo de escapar para o citosol14,15. Por outro lado, Salmonella enterica sorovar typhimurium (S. typhimurium) é capaz de modificar as propriedades do fagossomo dentro do vacúolo para transformá-lo em um local adequado para a sua replicação16. Esta habilidade faz S. typhimurium um modelo muito interessante para estudar a interferência mediada por patógeno de maturação do fagossoma.

S. typhimurium é uma bactéria intracelular facultativo que provoca gastroenterite em seres humanos. Após a invasão da propria do lamina, S. Typhimurium bactérias são rapidamente detectadas e fagocitadas por macrófagos e contidas em phagosomes17. Alguns relatos têm descrito anteriormente que S. typhimurium-contendo phagosomes fabricantes para ambos os endossomos e lisossomos18do presente, e outros estudos encontraram fusão fagossoma-lisossoma prevenida sobre S. Typhimurium infecção19.

Inicialmente, maturação de fagossoma com S. typhimurium infecção foi investigada por microscopia de imunofluorescência. O desenvolvimento de técnicas para o isolamento de bactérias contendo phagosomes habilitado para um estudo mais preciso do conteúdo do fagossoma em termos de marcadores endossomo e lisossomo. Até à data, o principal método usado para o isolamento de bactérias contendo phagosomes é o fraccionamento subcelular em sacarose passo gradientes18,20. No entanto, este método requer várias etapas de centrifugação que podem causar danos mecânicos ao phagosomes, podem afetar a estabilidade dos componentes phagosomal (proteínas e lipídios) e é demorado. Além disso, exige o uso de um se: um pedaço de equipamento especializado que não é acessível para todos os laboratórios.

Recentemente, uma nova abordagem foi aplicada para o isolamento de bactérias contendo phagosomes, em que os patógenos bacterianos são rotulados com lipopetide biotinilado (Lipobiotin) e mais tarde extraído usando grânulos magnéticos estreptavidina conjugada21 . Propomos um método alternativo complementar através da marcação de macromoléculas contendo amina superfície bacterianas com NHS-biotina seguido por grânulos magnéticos estreptavidina conjugada. Phagosomes obtidos por esse método são altamente enriquecidos em marcadores endossomo e lisossoma e podem ser usados para uma ampla gama de ensaios, de análise de proteínas para análise omics. Além disso, não requer equipamento especializado como ultracentrifuges. Além disso, eliminando as etapas de centrifugação, tanto os danos mecânicos à phagosomes e a quantidade de tempo empregado são consideravelmente reduzidos. Esse método pode ser facilmente adaptado para o isolamento de phagosomes contendo outras bactérias, tais como o Gram-positivas Staphylococcus aureus, também incluído neste manuscrito. Em resumo, este método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes é um simples, econômico, e menos demorada do que a clássico isolamento por sacarose gradiente-ultracentrifugação, tornando-se altamente enriquecido contendo bactérias phagosomes.

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Protocolo

todas as etapas que envolvam a utilização de patogenicidade S. typhimurium deve ser efectuada em BSL-2 ou superior unidade de nível de segurança biológica. A cultura e o revestimento do S. Typhimurium, bem como a infecção de macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) deve ser realizada sob uma capa de fluxo laminar para evitar a contaminação. O isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes pode ser executada em qualquer bancada de laboratório BSL-2.

extração de medula óssea de ratos para sua diferenciação em macrófagos foi efectuada de acordo com as normas institucionais sobre o bem-estar animal e aprovada pela Agência para a natureza, estado da Renânia do Norte-Vestefália Ambiente e defesa do consumidor [turismo für Natur, Umwelt e Nordrhein-Westfalen de Verbraucherschutz (LANUV); Arquivo n: 84-02.05.40.14.082 e 84-02.04.2015.A443] e a Universidade de colônia.

1. Culturing, S. typhimurium

  1. inóculo S. typhimurium (Estirpe SL1344) de uma única colônia bacteriana em 5 mL de caldo de infusão (BHI) coração cérebro usando um loop bacteriano.
  2. Incube a suspensão bacteriana em uma incubadora a 37 ° C durante a noite com tremendo.
  3. No dia seguinte, transfira 1 mL da suspensão bacteriana em 19 mL de caldo BHI em um Erlenmeyer e incubar a 37 ° C numa incubadora com agitação.
  4. Monitorar o S. typhimurium crescimento através da medição da densidade óptica (OD) em 600 nm (OD 600) com um espectrofotômetro. As medidas devem ser tomadas aproximadamente cada 30 min.
  5. OD quando 600 atinge 1.0, retire a suspensão bacteriana da incubadora e transferência para tubo de 50 mL. Centrifugar as bactérias a 5.400 x g, durante 15 min a 4 ° C.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender em 10 mL de salina tampão fosfato (PBS).
  7. Centrifugar a 5.400 x g, durante 15 min a 4 ° C.
  8. Remover o sobrenadante e ressuspender as bactérias em 4,9 mL de PBS estéril.

2. Revestimento de S. typhimurium com grânulos magnético NHS-biotina/estreptavidina-conjugados

  1. Adicione 100 µ l de 10 mg/mL biotina vinculando a solução (NHS-biotina dissolvido em dimetilsulfóxido, DMSO) preparada na hora, para a suspensão bacteriana preparado na etapa anterior. Por exemplo, dilua 5 mg de NHS-biotina em 0,5 mL de DMSO estéril. Mix corretamente pipetando subindo e descendo várias vezes.
  2. Dividir a mistura em cinco tubos de 1,5 mL.
  3. Incubar por 2 h à temperatura ambiente (RT) sobre uma thermoblock com agitação constante a 350 rpm.
  4. Centrifugar tubos a 15.000 x g durante 10 minutos a RT e descartar o sobrenadante.
  5. Resuspenda em 1 mL de PBS estéril, centrifugar 15.000 x g por 10 min a RT e descartar o sobrenadante.
  6. Repita etapa 2.5 mais duas vezes para remover completamente a excesso biotina vinculando solução.
  7. Após a última lavagem, resuspenda o pellet em 1 mL de PBS estéril.
  8. Transferir 100 µ l de solução de grânulos magnético estreptavidina conjugada com 10 mg/mL em um tubo de 1,5 mL e deixá-lo na prateleira magnética 5 min.
  9. Remover o solvente com uma pipeta, tomar a solução de grânulos magnético streptavidin-conjugados de rack magnético e ressuspendê-lo com 1 mL de suspensão bacteriana revestida de biotina preparado no passo 2.7.
  10. Incubar por 1h no RT em uma thermoblock com agitação constante a 350 rpm.
  11. Coloque a solução na prateleira magnética; esperar 5 min e depois remover com uma pipeta as bactérias que não adere na parede (mantê-lo em um tubo rotulado como " bactérias não revestidos "). A fração aderindo à parede do tubo em contato com o ímã é as bactérias biotina/estreptavidina-revestido.
  12. Remover o tubo contendo a bactéria rotulada de rack magnético e ressuspender em 1 mL de PBS estéril.
  13. Colocá-lo novamente na prateleira magnética, esperar por 5 min e usar uma pipeta para remover a PBS.
  14. Repita etapas 2.13 e 2.14 mais duas vezes para remover todas as bactérias que não são revestidas com os grânulos magnéticos estreptavidina conjugada.
  15. Após a última lavagem, resuspenda as bactérias revestido em 500 µ l de PBS estéril e rotular o tubo como " revestido de bactérias ".
  16. Contar a colônia formando unidades (cfu) de ambos " decapada bactérias " e " revestido de bactérias " soluções do chapeamento seriais diluições em placas de ágar BHI. Aproximadamente 2 x 10 8 UFC/mL de bactérias revestidas são obtidos a partir de 20 mL da suspensão bacteriana inicial com OD 600 de 1.0. Manter a suspensão bacteriana revestida a 4 ° C, para ser usado no dia seguinte para infectar os macrófagos.

3. Infecção de BDMDs

  1. no mesmo dia, quando as bactérias são revestidas com biotina e grânulos magnéticos estreptavidina conjugada placa totalmente diferenciadas BMDMs 22 em pratos de 6 cm em uma densidade de 5 x 10 6 células por prato.
  2. No dia seguinte, centrifugar a suspensão bacteriana revestida a 15.000 x g por 5 min a 4 ° C.
  3. Remover o sobrenadante e ressuspender em meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em uma concentração de 10 x 10 6 UFC/mL.
  4. Para infectar os macrófagos em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10, remover o meio dos BMDMs e adicionar 5 mL de suspensão bacteriana revestida preparado. MOI ideal poderão ser avaliado para cada tipo de célula ou finalidade experimental das isolados phagosomes.
  5. Incubar em RT para 10 min para sincronizar fagocitose.
  6. Incubar a 37 ° C numa incubadora 5% CO 2 por 30 min iniciar a fagocitose. Outros tipos de células podem exigir diferentes incubações para assegurar a internalização das bactérias.
  7. Retire o meio contendo bactérias os pratos e lavar as células com RPMI três vezes para remover as bactérias não-internalizada.
  8. Finalmente, adicionar 10 mL de RPMI contendo 10% FBS e 50 µ g/mL gentamicina para matar todas as bactérias não-fagocitadas.
  9. Incubar os BMDMs infectados a 37 ° C com 5% CO 2 até que ponto o tempo desejado. Ponto de tempo desejado deve ser determinado experimentalmente de acordo com as bactérias e tipo de células utilizado e a finalidade da análise. Para o estudo dos primeiros eventos de fusão endossomo-fagossoma em S. BMDMs infectadas typhimurium, recomenda-se uma incubação 30 min. Para a análise dos acontecimentos posteriores, phagosomes podem ser extraídos após 2h ou 4h de incubação. Incubação prolongada de macrófagos com S. Typhimurium além 24h resulta em morte de macrófagos. Estendido a infecção intracelular antes da extração do fagossoma provavelmente pode levar a degradação de moléculas de biotina. No entanto, nós não observaram perda de biotina na revestido-bactérias até 24 h.

4. Isolamento de S. typhimurium-contendo Phagosomes

  1. preparar o volume do fagossoma necessário buffer de isolamento um (50 mM tubos, pH.7, 50mm MgCl 2, 5mm EGTA) pela adição de ditiotreitol (DTT) a uma concentração final de 1 mM, citocalasina B para um final concentração de 10 µM e protease e fosfatase inibidores como recomendado pelo fabricante.
    Nota: TDT e Cytochalasin B devem ser adicionado para o tampão de isolamento do fagossoma A sempre imediatamente antes da utilização. Cytochalasin B interrompe o citoesqueleto, facilitando a ruptura da membrana celular.
  2. Na altura desejada aponte, remover o meio das células infectadas e lavar com PBS estéril, aquecido a RT.
  3. Adicionar 750 µ l de phagosomisolamento e tampão A por prato e incubar 20 min no gelo. Quando usando números de telemóvel diferentes, o volume de tampão de isolamento A deve ser ajustado proporcionalmente.
  4. Adicionar 250 µ l de tampão de isolamento do fagossoma B (tubos de 50 mM, pH.7, 50mm MgCl 2, 5mm EGTA, 220 mM manitol e sacarose 68 milímetros). A placa para assegurar que o buffer alcança a superfície total do prato de pedra. Quando usando números de telemóvel diferentes, o volume de tampão de isolamento B deve ser ajustado proporcionalmente.
  5. Remover as células do prato raspando suavemente usando um policial de borracha e transfira para um tubo previamente refrigerados 1,5 mL.
  6. Passar a suspensão de células através de uma agulha 26G utilizando uma seringa de 1 mL pelo menos 15 vezes (uma aspiração mais uma ejeção da contagem de suspensão de células como uma vez). Isto é o suficiente para liberar o conteúdo citosólico do BMDMs. O número de passes através da agulha deve ser otimizado para cada tipo de célula.
  7. Coloque a suspensão de eritrócitos na prateleira magnética e espere 5 min. As partículas anexadas ao ímã são as phagosomes que contenham revestido - S. Typhimurium. A suspensão contém o resto dos componentes celulares.
  8. Transferir a suspensão em um tubo de 1,5 mL rotulado como " citosol ".
  9. Retire o tubo com os phagosomes isolados do rack magnético e Resuspenda-los em 1 mL de PBS estéril.
  10. Coloque a suspensão do fagossoma na prateleira magnética, aguarde 5 min e remova a PBS.
  11. , Repita os passos 4.9 e 4.10 para lavar os isolados de S. typhimurium-contendo phagosomes.
  12. Finalmente remover a PBS e Resuspenda os phagosomes no buffer necessário; por exemplo, em um buffer de ensaio (RIPA) radioimmunoprecipitation para análise de proteínas. Aproximadamente 50-200 µ g de proteína é obtida por amostra seguindo este protocolo, dependendo a quantidade inicial de células e o MOI de infecção.

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Resultados

Isolamento de bactérias contendo phagosomes pelo presente protocolo requer o biotinylation das bactérias como um primeiro passo. Avaliamos, portanto, a eficácia da S. typhimurium biotinylation por análise de microscopia confocal de BMDMs infectados com biotinilado mCherry -S. typhimurium rotulado com Cy5-estreptavidina. Brevemente, BMDMs foram infectados conforme descrito neste protocolo com mCherry -S. typhimurium biotinilado ante...

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Discussão

Um novo método para o isolamento de S. typhimurium-contendo phagosomes revestindo as bactérias com biotina e estreptavidina conjugada com grânulos magnéticos é descrito aqui. Após suave rompimento da membrana celular, que contêm bactérias phagosomes podem ser facilmente extraídos usando um rack magnético. Mostramos que a rotulagem das bactérias preserva a capacidade do patógeno para induzir a inflamação e não altera a propriedade fagocítica da célula hospedeira. Importante, phagosomes o...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Pesquisa no laboratório de Robinson é suportada pelo financiamento do Cluster de excelência Colónia na resposta de estresse celular em doenças Aging-Associated, Universidade de Colónia, Alemanha (CECAD; financiado pelo DFG no quadro da iniciativa de excelência da federal alemão e os governos do estado) e bolsas da Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Fortuna Köln e Maria Pesch Fundação da Universidade de Colónia, Alemanha.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
EZ-Link NHS BiotinThermo Fisher Scientific20217
FluidMag StreptavidinChemicell4205
PIPESCarl Roth9156.2
MgCl2Carl RothA537.4
EGTACarl Roth3054.3
SucroseCarl Roth4621.1
MannitolCarl Roth4175.1
DTTSigma43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific1861280
Cytochalasin BSigmaC6762
DYNAL or DynaMag MagnetThermo Fisher Scientific12321D
SmartSpec 3000 SpectrophotometerBio-Rad170-2501
Bacterial loop (10µl)Sarstedt86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMIBiochromFG1415
PBSBiochromL1825
Cy5-streptavidinInvitrogenSA1011
anti-beta-actin antibodySanta Cruz Biotechnologysc-47778
anti-mCherry antibodyThermo Fisher ScientificPA5-34974
anti-Rab5 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-46692
anti-Rab7 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibodySanta Cruz Biotechnologysc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20943
anti-cathepsin D antibodySanta Cruz Biotechnologysc-6486
anti-Tomm20 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-17764
anti-calnexin antibodySanta Cruz Biotechnologysc-46669
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20357

Referências

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