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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l'isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.

Abstract

Salmonella typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l'invasione della lamina propria, S. typhimurium batteri sono rapidamente rilevati e phagocytized da macrofagi e contenuti in vescicole conosciute come fagosomi al fine di essere degradato. Isolamento di S. typhimurium-fagosomi contenenti sono stati ampiamente usati per studiare come S. typhimurium infezione altera il processo di maturazione del fagosoma per impedire la degradazione batterica. Classicamente, l'isolamento di batteri contenenti fagosomi è stata eseguita da centrifugazione in gradiente di saccarosio. Tuttavia, questo processo richiede tempo e richiede attrezzature specializzate e un certo grado di destrezza. Qui descritto è un metodo semplice e rapido per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina-streptavidina-coniugato biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con tale metodo possono essere sospeso in qualsiasi buffer di scelta, consentendo l'utilizzazione dell'isolato fagosomi per una vasta gamma di saggi, quali l'analisi della proteina, metabolita e dei lipidi. In sintesi, questo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è specifico, efficiente, rapida, richiede attrezzature minime ed è più versatile rispetto al classico metodo di isolamento di ultracentrifugazione gradiente di saccarosio.

Introduzione

I macrofagi sono in circolazione le cellule fagocitiche specializzate che rilevare, inghiottono e degradano qualsiasi particella estranea presente nei tessuti periferici, che vanno da cellule apoptotiche a microrganismi come i batteri d'invasione. Al momento della rilevazione di recettore superficiale di marcatori specifici patogeni comunemente presenti sulla superficie dei microrganismi (noto come pattern molecolari associati o PAMPs), macrofagi avviare una riorganizzazione complessa della membrana cellulare in ordine per circondare e phagocytize l' agente patogeno1.

L'agente patogeno tratta quindi è contenuto dal macrofago in una vescicola intracellulare conosciuto come fagosoma. Attraverso una serie di fusione e fissione eventi con altre vescicole come gli endosomi ed i lisosomi, contenenti patogeno phagosome acquisisce una serie di proteine necessarie per l'eliminazione del contenuto phagosomal. Pertanto, la composizione enzimatica di phagosome è altamente variabile nel corso di questo processo, noto come phagosome maturazione2.

Poco dopo la fagocitosi, il multimerici complessi vacuolar ATPasi (v-ATPasi) sono incorporato nella membrana del fagosoma da fusione con gli endosomi3. Questo complesso utilizza ATP ai protoni pompa dal cytosol al lumen del fagosoma4. L'acidificazione di phagosome è essenziale per gli eventi di fusione con altre vescicole5 e per l'attivazione di un gran numero di enzimi degradativi dipendente dal pH6. Un altro complesso enzimatico multimerici che è rapidamente assemblato sulla membrana phagosome è il complesso di NADPH-ossidasi (NOX). Complesso di NOX si ossida NADPH per la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) che sono secreti nel lume del fagosoma e che contribuiscono significativamente all'uccisione dei microrganismi tratta7.

Durante le fasi iniziali di maturazione, fagosomi presentano gli indicatori in genere quali Rab5 e Rab7 di endosomi precoci e tardivi, rispettivamente con la subunità di0 V dell' v-ATPasi8. Fusione di fagosomi con i lisosomi e late endosomes risultati nell'esposizione dell'agente patogeno phagocytized a una vasta gamma di enzimi idrolitici come β-galattosidasi9, lipasi e proteasi catepsina. L'acidificazione del lume è inoltre necessario per l'attivazione di questi enzimi. Ad esempio, la scissione della catepsina D per produrre la forma breve attiva è dipendente dal pH10. Questi enzimi degradano l'agente patogeno e mediano la produzione dei peptidi corti patogeno-derivati che sono presentati da macrofagi di istocompatibilità (MHC) classe II molecole complesse alle cellule di T di innescare una risposta immunitaria adattativa11.

Quindi, la maturazione del fagosoma è cruciale per la risposta immunitaria innata e collega le braccia innate e adattativa del sistema immunitario. Non è una sorpresa che gli agenti patogeni hanno evoluto strategie per superare l'eliminazione dai macrofagi attraverso il processo di maturazione del fagosoma sopra descritte. Ad esempio, i batteri intracellulari tubercolosi del micobatterio e Legionella pneumophila impediscono la maturazione del fagosoma d'inibizione dell'Assemblea del v-atpasi e lume conseguente acidificazione12,13 . Altri batteri, come Listeria monocytogenes o Shigella flexneri inducono la formazione di pori nella membrana del fagosoma per scappare verso il citosol14,15. D'altra parte, Salmonella enterica sierotipo typhimurium (S. typhimurium) è in grado di modificare le proprietà di phagosome all'interno del vacuolo per trasformarla in un luogo adatto per sua replica16. Questa capacità rende S. typhimurium un modello molto interessante per studiare interferenza patogeno-mediata di maturazione del fagosoma.

S. typhimurium è un batterio intracellulare facoltativo che causa gastroenterite in esseri umani. Dopo l'invasione della lamina propria, S. Typhimurium batteri sono rapidamente rilevati phagocytized da macrofagi e contenuti all'interno di fagosomi17. Alcuni rapporti hanno descritto in precedenza che S. typhimurium-fagosomi contenenti presentano responsabili per sia gli endosomi ed i lisosomi18, e altri studi hanno trovato fusione fagosoma-lisosoma ha impedito al S. Typhimurium infezione19.

Inizialmente, maturazione di phagosome su S. l'infezione typhimurium è stato studiato da microscopia di immunofluorescenza. Lo sviluppo di tecniche per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi attivato uno studio più accurato del contenuto phagosome in termini di indicatori endosoma e lisosoma. Ad oggi, il metodo principale utilizzato per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi è il frazionamento subcellulare il saccarosio passo gradienti18,20. Tuttavia, questo metodo richiede più passaggi di centrifugazione che possono causare danni meccanici alla fagosomi, possono influenzare la stabilità dei componenti phagosomal (proteine e lipidi) e richiede molto tempo. Inoltre, si richiede l'utilizzo di un'ultracentrifuga: un pezzo di attrezzature specializzate che non sono accessibile per ogni laboratorio.

Recentemente, un nuovo approccio è stato applicato per l'isolamento di batteri contenenti fagosomi, in cui gli agenti patogeni batterici sono etichettati con biotinilati lipopetide (Lipobiotin) e successivamente estratte utilizzando streptavidina coniugata biglie magnetiche21 . Proponiamo un metodo alternativo e complementare di etichettatura batteriche superficiali contenenti macromolecole con NHS-biotina seguita da streptavidina coniugata biglie magnetiche. Fagosomi ottenuti con questo metodo sono altamente arricchiti in indicatori endosoma e lisosoma e possono essere utilizzati per un'ampia gamma di dosaggi, di analisi della proteina di omics analisi. Inoltre, non richiede attrezzature specializzate come ultracentrifughe. Inoltre, eliminando le fasi di centrifugazione, sia il danno meccanico al fagosomi e la quantità di tempo impiegata notevolmente sono ridotti. Questo metodo può essere facilmente adattato per l'isolamento di fagosomi contenenti altri batteri, come i batteri Gram-positivi Staphylococcus aureus, anche incluso in questo manoscritto. In sintesi, questo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi è un semplice, conveniente, e meno tempo rispetto all'isolamento classica di saccarosio gradiente-ultracentrifugazione, rendering altamente arricchito fagosomi contenenti batteri.

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Protocollo

tutti i passaggi che implicano l'uso di patogeni S. typhimurium deve essere eseguito in un BSL-2 o maggiore sicurezza biologica livello struttura. La cultura e la spalmatura di S. Typhimurium, come pure l'infezione dei macrofagi derivate da midollo osseo (BMDMs) deve essere eseguita sotto cappa a flusso laminare per prevenire la contaminazione. L'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi può essere eseguita su qualsiasi banco di laboratorio BSL-2.

l'estrazione del midollo osseo da topi per relativa differenziazione in macrofagi è stata eseguita in conformità con le linee guida istituzionali sul benessere degli animali e approvato dall'Agenzia dello stato della Renania settentrionale-Vestfalia per la natura, Ambiente e tutela dei consumatori [Landesamt für Natur, Umwelt e Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; File no: 84-02.05.40.14.082 e 84-02.04.2015.A443] e l'Università di Colonia.

1. Culturing S. typhimurium

  1. inoculare S. typhimurium (Ceppo SL1344) da una singola colonia batterica in 5 mL di brodo di infusione (BHI) cuore cervello utilizzando un ciclo batterico.
  2. Incubare la sospensione batterica in un incubatore a 37 ° C durante la notte con agitazione.
  3. Il giorno seguente, trasferire 1 mL di sospensione batterica in 19 mL di brodo BHI in una beuta e incubare a 37 ° C in un incubatore con agitazione.
  4. Monitorare l' S. typhimurium crescita misurando la densità ottica (OD) a 600 nm (OD 600) con uno spettrofotometro. Le misurazioni devono essere effettuate circa ogni 30 min.
  5. OD quando 600 raggiunge 1,0, rimuovere la sospensione batterica dall'incubatore e trasferimento in tubo da 50 mL. Centrifugare i batteri a 5.400 x g per 15 min a 4 ° C.
  6. Rimuovere il surnatante e risospendere in 10 mL di soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS).
  7. Centrifugare a 5.400 x g per 15 min a 4 ° C.
  8. Rimuovere il supernatante e risospendere i batteri in 4,9 mL di PBS sterile.

2. Rivestimento di S. typhimurium con biglie magnetiche NHS-biotina/streptavidina-coniugato

biotina
  1. aggiungere 100 µ l di 10 mg/mL soluzione (NHS-biotina disciolto in dimetilsolfossido, DMSO) preparata, la sospensione batterica di collegamento preparato nel passaggio precedente. Ad esempio, diluire 5 mg di NHS-biotina in 0,5 mL di DMSO sterile. Mix correttamente pipettando su e giù più volte.
  2. Dividere il mix in cinque provette da 1,5 mL.
  3. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente (TA) su un termoblocco con agitazione costante a 350 giri/min.
  4. Centrifugare le provette a 15.000 x g per 10 min a RT e scartare il surnatante.
  5. Risospendere in 1 mL di PBS sterile, centrifuga a 15.000 x g per 10 min a RT e scartare il surnatante.
  6. Ripetere passo 2.5 due volte per rimuovere completamente la biotina in eccesso che collega soluzione.
  7. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in 1 mL di PBS sterile.
  8. Trasferire 100 µ l di soluzione di coniugato streptavidina biglie magnetiche di 10 mg/mL in una provetta da 1,5 mL e lasciarlo sul rack magnetico per 5 min.
  9. Rimuovere il solvente con una pipetta, prendere la soluzione di biglie magnetiche streptavidina-coniugato dal rack magnetico e risospendere le con 1 mL di sospensione batterica rivestito di biotina preparata al punto 2.7.
  10. Incubare per 1h a RT su un thermoblock con agitazione costante a 350 giri/min.
  11. Posto la soluzione su rack magnetico; aspettare 5 minuti e poi rimuovere con una pipetta i batteri che non aderiscono alla parete (tenerlo in una provetta etichettata come " non rivestita batteri "). La frazione che aderisce alla parete del tubo a contatto con il magnete è il batterio biotina/streptavidina-rivestito.
  12. Rimuovere il tubo contenente i batteri con etichettati dal rack magnetico e risospendere in 1 mL di PBS sterile.
  13. Riposizionarlo sul rack magnetico, attendere 5 min e utilizzare una pipetta per rimuovere il PBS.
  14. Ripetere i passaggi da 2.13 e 2.14 altre due volte per rimuovere tutti i batteri che non sono rivestiti con i branelli magnetici streptavidina coniugata.
  15. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i batteri rivestito in 500 µ l di PBS sterile ed etichettare il tubo come " rivestito di batteri ".
  16. Contare le unità formanti colonia (UFC di entrambi) " batteri non rivestiti " e " rivestito di batteri " soluzioni di placcatura diluizioni seriali su piastre di agar BHI. Circa 2 x 10 8 cfu/mL di batteri rivestiti sono ottenuti da 20 mL di sospensione batterica iniziale con OD 600 di 1.0. Mantenere la sospensione batterica rivestito a 4 ° C per essere usati il giorno seguente per infettare i macrofagi.

3. Infezione di BDMDs

  1. lo stesso giorno quando i batteri sono rivestiti con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata, piastra completamente differenziato BMDMs 22 in piatti di 6 cm con una densità di 5 x 10 6 cellule per piatto.
  2. Il giorno successivo, centrifugare la sospensione batterica rivestito a 15.000 x g per 5 min a 4 ° C.
  3. Rimuovere il supernatante e risospendere in medium di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) ad una concentrazione di 10 x 10 6 cfu/mL.
  4. Per infettare i macrofagi ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10, rimuovere il supporto dal BMDMs e aggiungere 5 mL di sospensione batterica rivestito preparato. MOI ottimale può essere valutata per ogni tipo di cellula o scopo sperimentale dell'isolato fagosomi.
  5. Incubare a temperatura ambiente per 10 min per sincronizzare fagocitosi.
  6. Incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO 2 per 30 min ad avviare la fagocitosi. Altri tipi di cellule possono richiedere tempi diversi di incubazione per garantire l'internalizzazione dei batteri.
  7. Rimuovere il mezzo contenente batteri dai piatti e lavare le cellule con RPMI tre volte a rimuovere i batteri non interiorizzato.
  8. Infine aggiungere 10 mL di RPMI contenente 10% FBS e gentamicina 50 µ g/mL per uccidere tutti i batteri non-phagocytized.
  9. Incubare il BMDMs infetti a 37 ° C con 5% CO 2 finché il tempo desiderato. Il punto di tempo desiderato deve essere determinato sperimentalmente secondo i batteri e tipo di cellulare utilizzato e lo scopo di analisi. Per lo studio degli eventi di fusione fagosoma-endosomi precoci in S. BMDMs typhimurium-infettati, è consigliabile un'incubazione di 30 min. Per l'analisi degli eventi successivi, fagosomi possono essere estratte dopo 2 o 4 ore di incubazione. Incubazione prolungata dei macrofagi con S. Typhimurium oltre 24 h provoca la morte dei macrofagi. Estesi, infezione intracellulare prima l'estrazione phagosome probabilmente potrebbe portare alla degradazione delle molecole di biotina. Tuttavia, non abbiamo osservato perdita di biotina sui batteri rivestito fino alle h. 24

4. Isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi

buffer di isolamento
  1. preparare il volume del fagosoma richiesto un (50 mM tubi, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) aggiungendo ditiotreitolo (DTT) a una concentrazione finale di 1 mM, citocalasina B ad un finale concentrazione di 10 µM e proteasi e fosfatasi inibitori come consigliato dal produttore.
    Nota: DTT e Cytochalasin B devono essere aggiunti per il tampone di isolamento phagosome A sempre immediatamente prima dell'uso. Cytochalasin B sconvolge il citoscheletro, facilitando la rottura della membrana cellulare.
  2. Al momento desiderato punto, rimuovere il mezzo da cellule infette e lavare con PBS sterile riscaldato a RT.
  3. Aggiungere 750 µ l di phagosomisolamento e tampone A ogni piatto e incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Quando si utilizzano numeri differenti delle cellule, il volume di tampone di isolamento A dovrebbe essere regolato proporzionalmente.
  4. Aggiungere 250 µ l di tampone di phagosome isolamento B (tubi di 50 mM, pH.7, MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM mannitolo e saccarosio 68 mM). Roccia la piastra per assicurare che il buffer raggiunge la superficie del piatto. Quando si utilizzano numeri differenti delle cellule, il volume di tampone di isolamento B deve essere regolato proporzionalmente.
  5. Rimuovere le cellule dal piatto raschiando delicatamente utilizzando un poliziotto di gomma e trasferirli in una provetta da 1,5 mL pre-refrigerati.
  6. Passare la sospensione cellulare attraverso un ago 26G utilizzando una siringa da 1 mL almeno 15 volte (uno aspirazione più una espulsione della sospensione la conta delle cellule come una volta). Questo è sufficiente per rilasciare il contenuto citosolico di BMDMs. Il numero di passaggi attraverso l'ago deve essere ottimizzato per ogni tipo di cellula.
  7. Posizionare la sospensione cellulare sul rack magnetico e attendere 5 min. Le particelle attaccate al magnete sono fagosomi contenenti rivestito - S. Typhimurium. La sospensione contiene il resto dei componenti cellulari.
  8. Trasferire la sospensione in una provetta da 1,5 mL etichettata come " citosol ".
  9. Rimuovere il tubo con i fagosomi isolati dal rack magnetico e li risospendere in 1 mL di PBS sterile.
  10. Posizionare la sospensione phagosome al ripiano magnetico, attendere 5 minuti e rimuovere il PBS.
  11. Ripetere i passaggi da 4.9 e 4.10 per lavare l' isolato S. typhimurium-contenente fagosomi.
  12. , Infine, rimuovere il PBS e risospendere i fagosomi nel buffer richiesto; ad esempio, in un tampone del saggio (RIPA) radioimmunoprecipitation per l'analisi della proteina. Circa il 50-200 µ g di proteina è ottenuta per campione seguendo questo protocollo, a seconda della quantità iniziale di cellule e il MOI di infezione.

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Risultati

Isolamento di batteri contenenti fagosomi dal presente protocollo richiede il biotinylation dei batteri come un primo passo. Quindi abbiamo valutato l'efficacia di S. typhimurium biotinylation dall'analisi di microscopia confocal di BMDMs infettato biotinilati mCherry -S. typhimurium etichettato con Cy5-streptavidina. Brevemente, BMDMs sono stati infettati come descritto in questo protocollo con mCherry -S. typhimurium precedentemente ...

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Discussione

Un nuovo metodo per l'isolamento di S. typhimurium-contenente fagosomi rivestendo i batteri con biotina e sfere magnetiche streptavidina coniugata è descritto qui. Dopo la rottura della membrana cellulare delicata, fagosomi contenenti batteri possono essere facilmente estratte mediante un rack magnetico. Indichiamo che l'etichettatura dei batteri conserva la capacità dell'agente patogeno per indurre l'infiammazione e non altera la proprietà fagocitaria della cellula ospite. D'importanza, fagosomi ott...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Ricerca nel laboratorio di Robinson è sostenuta da finanziamenti da Colonia Cluster di eccellenza sulle risposte di Stress cellulare nelle malattie di Aging-Associated, Università di Colonia, Germania (CECAD; finanziato dal DFG nell'ambito dell'iniziativa di eccellenza della Repubblica federale tedesco e Dichiari i governi) e sovvenzioni dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Fortuna Köln e Maria-Pesch Foundation dell'Università di Colonia, Germania.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
EZ-Link NHS BiotinThermo Fisher Scientific20217
FluidMag StreptavidinChemicell4205
PIPESCarl Roth9156.2
MgCl2Carl RothA537.4
EGTACarl Roth3054.3
SucroseCarl Roth4621.1
MannitolCarl Roth4175.1
DTTSigma43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific1861280
Cytochalasin BSigmaC6762
DYNAL or DynaMag MagnetThermo Fisher Scientific12321D
SmartSpec 3000 SpectrophotometerBio-Rad170-2501
Bacterial loop (10µl)Sarstedt86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMIBiochromFG1415
PBSBiochromL1825
Cy5-streptavidinInvitrogenSA1011
anti-beta-actin antibodySanta Cruz Biotechnologysc-47778
anti-mCherry antibodyThermo Fisher ScientificPA5-34974
anti-Rab5 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-46692
anti-Rab7 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibodySanta Cruz Biotechnologysc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20943
anti-cathepsin D antibodySanta Cruz Biotechnologysc-6486
anti-Tomm20 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-17764
anti-calnexin antibodySanta Cruz Biotechnologysc-46669
anti-GAPDH antibodySanta Cruz Biotechnologysc-20357

Riferimenti

  1. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
  2. Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
  3. Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758(2008).
  4. Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
  5. Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
  6. Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
  7. Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
  8. Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
  9. Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
  10. Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
  11. Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
  12. Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
  13. Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
  14. Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
  15. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
  16. Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
  17. Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
  18. Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
  19. Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
  20. Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
  21. Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
  22. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  23. Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
  24. Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
  25. West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
  26. Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
  27. Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
  28. Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).

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