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Resumo

Este protocolo mede respostas gosto humano e inclui uma breve avaliação anatômica, um teste de gosto curto e um método de validação usando relatado sensação e gosto do receptor genótipo do assunto.

Resumo

A importância emergente de gosto em medicina e pesquisa biomédica e novos conhecimentos sobre seus fundamentos genéticos, motivou-nos para complementar os métodos de teste de sabor clássicos de duas maneiras. Primeiro, vamos explicar como fazer uma breve avaliação da boca, incluindo a língua, para garantir que as papilas sabor estão presentes e observe a evidência da doença em questão. Em segundo lugar, desenharmos na genética para validar dados de teste de gosto por comparar relatórios de intensidade percebida de amargura e de genótipos Inatos do receptor. Discordância entre medidas objetivas de genótipo e relatórios subjetivos da experiência de sabor pode identificar erros de coleta de dados, indivíduos distraídos ou aqueles que não tenham compreendido ou seguiu as instruções. Nossa expectativa é que testes de sabor rápido e válido podem persuadir a pesquisadores e clínicos para avaliar o sabor regularmente, fazendo testes de gosto tão comum como testes de audição e visão. Finalmente, porque muitos tecidos do corpo expressam receptores de sabor, sabor respostas podem fornecer um proxy para a sensibilidade dos tecidos em outras partes do corpo e, desse modo, servir como um teste rápido, point-of-care para guia diagnóstico e uma ferramenta de pesquisa para avaliar o receptor do gosto função da proteína.

Introdução

Medidas da percepção humana sabor podem ser parte dos cuidados médicos e um alvo de investigação biomédica, ainda gosto tem recebido pouca atenção em comparação com audição e visão (tabela 1). Do ponto de vista médico, quando os médicos avaliar pacientes queixando-se de perda de sabor, na maioria dos casos a perda real é de cheiro1, que levou à demissão de perda de sabor como uma queixa de apresenta incomum e frequentemente inválida. Gosto de distorções (Disgeusia) são mais comuns e surgem frequentemente dos efeitos secundários de medicamentos ou lesão de nervo periférico2,3, mas nenhum formulário tem um tratamento eficaz (além de parar a medicação). Os médicos também ignoraram a perda de sabor porque até agora teve pouco valor diagnóstico ou prognóstico por conta própria. No entanto, embora a medida do gosto tem sido um remanso, ele pode agora entrar em medicina tradicional com a revitalização de uma apreciação histórica que gosto pode ser uma ferramenta de diagnóstico ou prognóstico4,5. Por exemplo, a percepção de amargura pode prever função imune6 ou a disponibilidade de um paciente para tomar medicação7. No entanto, pesquisadores biomédicos negligenciaram largamente gosto. Esta desatenção pode, em parte, refletem o fato de que o progresso inicial na compreensão deste sistema sensorial tem suas raízes na psicologia experimental8, um campo com o qual aqueles na medicina pode ser relativamente desconhecidos. Além disso, o interesse renovado no gosto inaugurou gosto padronizados métodos9 que constroem em anteriores métodos10, que ao mesmo tempo abrangente são longos e inadequado para situações clínicas. Finalmente, confiança nas medidas de gosto pode ser fraca porque assuntos relatam sobre suas próprias experiências e validação de suas observações até agora tem faltado. Nossa esperança é que uma medida simples que os investigadores ou os clínicos podem facilmente administrar vai ganhar em popularidade com os eleitores. Aqui descrevemos um protocolo de exame de gostos simples que tem três partes: uma avaliação da cavidade oral, o teste de gosto e uma etapa de validação usando Inatos do genótipo. Primeiro, nós fornecemos o contexto biológico para esses procedimentos, que se fundem simples práticas em medicina, medidas sensoriais da psicologia experimental e validação das respostas usando o genótipo e genética.

Percepção de sabor começa na boca, para que um exame eficaz gosto precisa incluir uma breve avaliação clínica para doenças orais óbvias, vermelhidão, inchaço e outra descoloração. A cavidade oral contém sete subsites: a língua, gengiva, assoalho da boca, mucosa bucal, mucosa labial, palato duro e o trígono retromolar. Após estudos do paladar humano focado em participantes saudáveis ou aqueles com doenças bem definidas, mas como gosto de teste torna-se rotina em exames médicos, é importante gravar a condição da cavidade oral como parte do procedimento.

A língua em si é uma estrutura muscular envolvida em mucosa; pontilham sua superfície dorsal é papilas, as pequenas estruturas levantadas que dão a língua sua textura única e contêm células receptoras de sabor. Podemos classificar a papila por sua forma: fungiforme, filiformes, foliate e circunvalada. Papila fungiforme (FP) é anterolateralmente localizado na língua e redonda, com uma forma de cogumelo,11. Os investigadores têm publicado vários métodos úteis para quantificar o FP e instruímos os leitores a estas fontes para medição protocolos12,13,14,15,16. Papilas foliate, dado forma como as páginas de um livro (folia), situam-se exclusivamente na lateral posterior língua superfície11. Papila circunvalada, encontrada no sulco terminalis da base da língua, é grandes estruturas em forma de cúpula, cercadas por paredes da mucosa (latim circum, "surround", + vallum, "parede")11. As papilas mais numerosas, as filiformes, são longas e finas e não contêm receptores de gosto.

As pessoas diferem na anatomia da língua. Enquanto as fontes desta variação anatômica são desconhecidas, é determinada em parte pela variação genética inata, com investigadores relatando 31% de concordância da anatomia da língua entre dizigóticos gémeos e 60% concordância entre gêmeos monozigóticos17. Densidade papilar também difere entre as pessoas, e apesar de rara, pelo menos uma doença genética (Disautonomia Familiar) resulta em uma ausência congênita de sabor papilas18,19,20. Assim, antes de executar teste psicofísico, é útil confirmar a presença de FP como parte da avaliação breve e observe o tamanho relativo e a cor da língua e evidência de doença oral.

As papilas gosto contêm o sensorial que células quando estimulado a sensação de gosto de iniciar. Os seres humanos são capazes de sensoriamento de pelo menos cinco classes de sabor: salgado, azedo, amargo, doce e umami. Enquanto salgado, doce e gosto umami sinalizar a presença de fontes de alimento valioso contendo cloreto de sódio, glicose e aminoácidos, respectivamente, amargor e acidez sinalizar a presença de ácidos e toxinas potenciais da decomposição bacteriana de alimentos, respectivamente e induzir o comportamento contrário21. Sabores salgados e amargo são transformados através da ativação de canais iônicos, encontrado em alguns tipos de células de sabor, embora o entendimento da transdução de sal está evoluindo e pode exigir tipo I também pilhas22,23. Doce, amargo e umami surgem da ativação de receptores G-proteína-acoplados em células de sabor tipo II, cada um em sintonia com um gosto particular. Heterodímeros de subunidades de três receptores particulares transduce doce e o umami, enquanto compostos amargos ativar um grupo de 25 diferentes receptores amargo24. Estes receptores amargos podem responder a vários compostos amargos, e um único composto amargo estimula muitas vezes mais de um receptor25. Apesar da recente expansão do conhecimento sobre a base molecular do gosto, novela caminhos26 e novas descobertas para além das qualidades de cinco sabor tradicional (por exemplo, percepção de28 27 ou ácido graxo cálcio) podem se avizinham.

Há pelo menos dois aspectos surpreendentes das famílias de receptores de sabor: genes que codificam para estes receptores podem diferem acentuadamente em sequência do DNA e, portanto, funcionam entre as pessoas, e muitos tecidos do corpo expressam esses genes21,29 , 30 , 31. estes sites extraoral incluem o cérebro, tireoide, superior e inferior do trato respiratório e o trato gastrointestinal, entre muitos outros21,29,30,31. Enquanto os receptores de gosto nesses locais não participam na percepção do gosto no sentido tradicional, eles provavelmente sentir o ambiente químico local29,32. Por exemplo, o epitélio ciliado das vias respiratórias superiores expressa o receptor amargo T2R38 (amargo sabor do Receptor 38), que responde à compostos químicos produzidos pelas bactérias e influencia a resposta imune inata32, tais como crescente infralateral e níveis de peptídeos antimicrobianos e óxido nítrico. Este achado tem implicações médicas para rinossinusite crônica, uma doença da infecção bacteriana crônica e inflamação do trato respiratório superior e seios paranasais.

De particular relevância para o sabor exame que descrevemos aqui é que o receptor do sabor amargo T2R38, codificada pelo gene TAS2R38 , apresenta variabilidade genética e, portanto, variável gosto sensibilidade. Diferenças perceptuais para a amarga composta Feniltiocarbamida (PTC) foram descrita pela primeira vez pelo químico Arthur Fox33; mais tarde, este composto foi identificado como um agonista do receptor de T2R3834. As diferenças individuais surgem a partir da sequência de DNA do gene TAS2R38 , que tem três polimorfismos de single-nucleotide, cada rendendo substituições de aminoácidos (A49P, A262V e I296V; R: alanina, prolina p, v: valina, isoleucina i:). Dois haplótipos comuns resultar, PAV e AVI, com indivíduos PAV/PAV, sendo altamente sensível ao PTC ("provadores"), indivíduos AVI/AVI sendo relativamente insensíveis ("não-provadores") e heterozigoto AVI/PAV indivíduos, sendo mais variável na sua sensibilidade 35. existem mais exemplos de variação genética que afetam a percepção do amarga, por exemplo, do receptor do gosto T2R19, codificada pelo gene TAS2R19 , da mesma forma apresenta variabilidade genética e diferentes sensibilidade de sabor para o composto amargo quinino,36. Da mesma forma, a variação em TAS2R31 afeta a amargura percebida de um dos adoçantes de alta potência37,38,39.

Aqui nós descrevemos um método rápido para caracterizar o sentido de um paciente do paladar que desenha em protocolos de alto rendimento em medicina clínica, psicologia experimental e genética.

Protocolo

A Universidade de Pensilvânia institucional diretoria aprovou este protocolo. Que excluímos sujeitos se eles eram menores de 18 anos de idade ou estavam grávidos.

1. avaliação da cavidade oral: Doença avaliação e identificação da papila

  1. Instrua o assunto para abrir a boca.
  2. Usando uma fonte de luz como uma lanterna ou farol, iluminar a cavidade oral e examinar os sete subsites da área (língua, assoalho da boca, mucosa bucal, mucosa labial, gengiva, palato duro e trígono retromolar).
    1. Visualize a superfície dorsal da língua. Instruir o sujeito que levanta a língua e examinar a superfície ventral da língua e assoalho da boca, certificando-se de estender a análise posterior para os molares.
    2. Usando um depressor, lateralize bochecha do sujeito para visualizar a mucosa bucal, bem como a gengiva lateral bilateral em torno dos dentes superiores e inferiores.
    3. Estenda o exame anteriormente, levantando os lábios superiores e inferiores para visualizar as superfícies da gengiva anterior e na mucosa labial.
    4. Finalmente, visualize o palato duro e trígono retromolar.
    5. Observação de lesões, abrasões e massas ou sinais de inflamação.
    6. Mais uma vez, pedir o assunto para abrir a boca e estender a língua.
    7. Use uma fonte de luz para visualizar a superfície dorsal da língua.
    8. Identificar a presença ou ausência de FP, por exemplo, uma superfície lisa de língua
  3. Observe os resultados do exame cavidade oral antes de prosseguir com o teste de sabor. Se os investigadores realizar este teste de sabor em um contexto médico, resultados inesperados devem solicitar mais check-up.

2. teste de sabor psicofísica

Nota: Recursos e descrições para o sabor psicofísica testes que se seguem também estão disponíveis na página web seguinte: https://osf.io/hn87s/.

  1. Preparação tastant
    1. Prepare soluções conforme indicado abaixo. Fazer de cada solução usando um balão volumétrico para garantir a precisão das concentrações a ± 0,0002 M. dissolver amostras usando água ultrapura. Adaptar a escolha de compostos para os objetivos da pesquisa. Os compostos incluídos aqui servem como um exemplo.
      1. Benzoato de denatónio (amargo): prepare uma solução stock de 4,99 x 10-3 M benzoato de denatónio dissolvendo 2,228 g de benzoato de denatónio em 1 litro de água. Adicione 180 µ l desta solução para um balão volumétrico de 500 mL. Adicione água para o volume para 500 mL, produzindo uma solução com uma concentração final de 1,8 µM.
      2. PTC (amargo): colocar 0,0135 g do PTC em um balão volumétrico de 500 mL. Adicione água para o volume para 500 mL. PTC é difícil dissolver, então coloque uma barra de agitação no balão e aqueça a solução a 70 ° C, em um prato quente. Use a barra de agitação para misturar a solução até dissolver todo soluto (~ 15 min). Isso produz uma solução com uma concentração final de 180 µM.
      3. Quinino (amargo): colocar 0,011 g de quinino HCl dihidratado num balão volumétrico de 500 mL. Adicione água para o volume para 500 mL, produzindo uma solução com uma concentração final de 56 µM.
      4. Cloreto de sódio (sal): Coloque 7,5 g de cloreto de sódio em um balão volumétrico de 500 mL. Adicione água para o volume para 500 mL, produzindo uma solução com uma concentração final de 0,25 M.
      5. Sacarose (doce): colocar 60 g de sacarose em um balão volumétrico de 500 mL. Adicione água para o volume para 500 mL, produzindo uma solução com uma concentração final de 0,35 M.
    2. Loja sabor soluções a 4 ° C. Alguns comumente usados compostos de sabor são sensíveis à luz, e os investigadores devem envolvê-los em papel ou outros materiais para reduzir sua exposição a luz.
    3. Para identificar erros comuns na preparação da solução, encha um copo de degustação com a velha solução e outra com a nova solução. Saborear cada solução para verificar se que eles são idênticos nos força.
    4. Inclua a água como uma solução de controle, apresentada na primeira posição para verificar assuntos entendem o procedimento de teste. Apresentam temas com cada tastant e o controle tastant duas vezes, tendo o cuidado de evitar apresentar a mesma tastant consecutivamente. Por exemplo, para testar cinco tastants exclusivos, apresentam doze amostras no questionário (ver 2.2): os cinco tastants e água, cada um apresentado duas vezes. Alíquota de 5 mL de água em frascos de vidro individuais cintilação. Rotule os tampões de frasco com uma etiqueta azul escura, o algarismo 1.
    5. Repita este processo para cada tastant. Tampões de frasco de rótulo com um adesivo circular de acordo com a ordem de apresentação e um código de cor, exemplo detalhado abaixo; coincidir com os rótulos dos frascos com as etiquetas do questionário de sabor (ver 2.2).
      Água (azul escuro)
      Quinino (luz azul)
      NaCl (verde)
      PTC (amarelo)
      Sacarose (laranja)
      Benzoato de denatónio (vermelho)
      NaCl (azul escuro)
      Benzoato de denatónio (luz azul)
      Água (verde)
      Quinino (amarelo)
      Sacarose (laranja)
      PTC (vermelho)
    6. Pacote de samples, colocando-os em duas caixas, amostras de 1 – 6 e 7 – 12 em caixas rotuladas "caixa A" e "caixa B," respectivamente (Figura 1); outras estratégias de embalagem são possíveis.

figure-protocol-5611
Figura 1: kit de sabor. Assuntos usam o kit de intensidade de sabor de taxa e a qualidade dos vários tastants codificados por cores. A caixa contém amostras 1 – 6, caixa B contém 7 – 12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Questionário de sabor
    1. Prepare o questionário gosto usando uma escala de categoria para classificar a intensidade de sabor e uma escolha forçada para identificar a qualidade de sabor de cada tastant (Figura 2).
    2. Coloque etiquetas circulares da cor adequada e o número ao lado da amostra adequada no questionário sabor (consulte 2.1.6).

figure-protocol-6533
Figura 2: entrada de questionário, constituído por uma escala de categoria para classificação de intensidade de sabor e forçado a escolha resposta para tastant qualidade. O questionário de sabor incluirá uma entrada para cada um do tastants Color-coded testado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Administração de teste de gosto
    1. Fornece temas com caixa A, casa B, uma garrafa de água, copo vazio, caneta e papel e caneta gosto questionário contendo entradas para 12 amostras. Use a mesma marca de água engarrafada durante toda a duração de qualquer determinado estudo. Como uma alternativa a um questionário de papel, porta o material em software de pesquisa online e administrado via tablet ou desktop/Laptop. Um modelo de amostra está disponível em https://osf.io/hn87s/.
    2. Instrua a temas que eles serão convidados a avaliar a intensidade e a qualidade (por exemplo, salgado, azedo, amargo, doce ou sem sabor) de cada tastant. Além disso, informe assuntos podem não ter todas as qualidades.
    3. Explicar o procedimento de teste, como segue: enxaguar a boca duas vezes com água e cuspir no copo fornecido. Despeje tudo de amostra 1 na boca e aí aguarde 5 segundos antes de cuspir a solução no copo. Não gargarejar ou engolir a solução. Círculo-uma das 13 linhas verticais correspondentes com intensidade do exemplo, em uma escala de 0 a 12, de "sem intensidade em tudo" para "extremamente intenso" e escolher uma qualidade única para descrever o sabor. Depois, enxague a boca com água duas vezes antes de prosseguir para a próxima amostra.
    4. Observe o assunto degustação e classificação da amostra 1 (água). Deve a desviar de classificação de "sem intensidade em tudo" e "sem sabor", reiterar as instruções do questionário antes de permitir que o teste prosseguir.
    5. Revise o questionário acabado de completude.
    6. Classificações de intensidade numa escala de 0 a 12, a partir das linhas verticais que circulavam os assuntos de pontuação. Média as duas classificações de intensidade para cada tastant; Esse valor será usado para análise.

3. o genótipo

  1. Colete a saliva de cada assunto usando um kit de coleta de DNA de saliva.
  2. Purifica o DNA genômico da amostra, seguindo as instruções do fabricante.
  3. Determine o genótipo TAS2R38 usando o SNP genotyping ensaios (rs713598, rs1726866, rs10246939)40.
  4. Determine o genótipo TAS2R19 usando o SNP genotyping ensaios (rs10772420)36.

4. genótipo-fenótipo validação

  1. Analisar os dados de controle disponíveis em pool de mais de 800 temas genótipo por TAS2R38 (rs713598, rs1726866, rs10246939) e TAS2R19 (rs10772420) na seguinte página web: https://carayata.shinyapps.io/TasteBoxplots/.
  2. Com base no genótipo de um sujeito TAS2R38 , compare sua resposta gosto psicofísica para o PTC composto amargo com as normas para os indivíduos com o mesmo genótipo. Respostas devem corresponder; no entanto, em casos raros, o genótipo TAS2R38 não perfeitamente prever PTC resultados sensoriais35.
  3. Devem respostas mostram divergência significativa, comparar a resposta de sabor do sujeito de quinino com as normas para os indivíduos com o mesmo genótipo de TAS2R19 . Respostas para intensidade de quinino e genótipo devem corresponder a36. Se todos os resultados de sabor não correspondem com o genótipo, é possível que o sujeito (a) não entende a tarefa (b) é fornecer avaliações espúrias ou fingimento ou (c) houve um erro de coleta de dados por parte do investigador.
  4. Identificar exceções de ponto de dados e talvez excluir da análise (Figura 3). Correspondência dos resultados sensoriais com genotipagem objetiva valida a confiabilidade do procedimento de teste psicofísico.

Resultados

Resultados do teste do sabor tem sido agrupados para todas as disciplinas avaliadas (n = 840) e são apresentados após a segregação por genótipo. O conjunto completo de dados pode ser acessado em https://carayata.shinyapps.io/TasteBoxplots/ e podem ser revisto para avaliar cada tastant e para TAS2R38 e TAS2R19 de genótipos. Resultados confirmam a existência de diferenças de sabor perceptual para PTC entre assuntos agrupados por genótipo do receptor de TAS2R38...

Discussão

A importância deste método é que ele usa uma abordagem multidisciplinar com características da medicina (exame oral), a psicologia experimental (a prova) e a genética (uma etapa de validação). Informações de sabor são propensas a desenvolver-se como uma ferramenta de diagnóstica e prognóstica porque gosto fornece uma janela para a função das proteínas em outras partes do corpo. Do ponto de vista da psicologia experimental, a adição de um simples exame pode identificar indivíduos que não são apropriado...

Divulgações

NAC e DRR são co-inventores em uma patente sob revisão (terapia e diagnóstico para infecção respiratória 61/697.652, WO2013112865).

Agradecimentos

Prêmios da National Institutes of Health apoiou esta pesquisa (R01DC013588 de NAC, R21DC013886 NAC e DRR e NIDCD administrativos pesquisa suplemento para promover o surgimento de clínico-cientistas na investigação Chemosensory para JED). Foram coletados dados do genótipo do equipamento comprado em parte com os fundos do NIH de OD018125.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Disposable diagnostic penlightPrimacareDL-9223
UltraLite Pro headlightIntegra LifeSciencesAX2100BIF
Millipore Q-Gard 2 water purification systemEMB MilliporeQGARD00D2
Denatonium benzoate Sigma AldrichD5765
PhenylthiocarbamideSigma AldrichP7629
Quinine hydrochloride dihydrateSigma AldrichQ1125
Sodium ChlorideSigma AldrichS1679
SucroseSigma AldrichS0389
Glass scintillation vialsThomas Scientific1230L59Same as Wheaton catalog no. 986580
Oragene Discover OGR-500 DNA collection kitDNA GenotekOGR-500
prepIT L2P Protocol reagentsDNA GenotekPT-L2P-5
rs713598 TaqMan SNP genotyping assayThermoFisher ScientificC___8876467_10
rs1726866 TaqMan SNP genotyping assayThermoFisher ScientificC___9506827_10
rs10246939 TaqMan SNP genotyping assayThermoFisher ScientificC___9506826_10
rs10772420 TaqMan SNP genotyping assayThermoFisher ScientificC___1317426_10

Referências

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