A longo prazo consequências comportamentais e reprodutivas de embrionária exposição a baixas doses tóxicas para

Resumo

Exposição a tóxicos ambientais aguda pode afetar o desenvolvimento, com efeitos a longo prazo. Protocolos detalhados são fornecidos para ilustrar uma estratégia usando um modelo eficaz de laboratório para estudar o efeito da exposição embrionária precoce ao Bisfenol A. Nós fornecemos a fecundidade e ensaios comportamentais para monitorar a eficácia da nossas bio-ensaios de exposição tóxica.

Resumo

Bisfenóis, tais como o bisfenol A (BPA) e Bisfenol S (BPS) são polimerização agentes amplamente utilizados na produção de plásticos e inúmeros produtos de uso diário. Com base na sua estrutura química e propriedades biológicas como estradiol, eles foram classificados como endócrinos compostos (EDC). A exposição prolongada a CDE, mesmo em doses baixas, tem sido associada a vários defeitos de saúde, incluindo câncer, distúrbios comportamentais e infertilidade, com maior vulnerabilidade indicada durante os períodos do desenvolvimento precoce. Estudos celulares e moleculares com o geneticamente tractable modelo nemátode Caenorhabditis elegans têm demonstrado que a exposição ao BPA provoca apoptose, letalidade embrionária e perturbação no DNA mecanismos de reparação. Informamos anteriormente que a exposição dos embriões de c. elegans de baixas doses de fecundidade diminui de bisfenóis diferentes. Além disso, mostramos que os efeitos da exposição durante a fase inicial de desenvolvimento persistirem na vida adulta como analisada quantificando o comportamento de habituação, uma forma de aprendizagem não associativa. Aqui, nós fornecemos protocolos detalhados para exposição embrionária a CDE baixa dose anterior e a fecundidade associada toque ensaios de habituação, juntamente com resultados representativos.

Introdução

Exposição a tóxicos ambientais, particularmente os compostos aqueles que tendem a interferir com o desenvolvimento, tem estado sob escrutínio científico cuidadoso nos últimos anos. Mais de mil produtos químicos de uso diário são classificados como endócrinos compostos (EDC)¹. Períodos de rápido crescimento e desenvolvimento, que incluem embrionárias, infantil e fases de infância, eram conhecidos por ser particularmente vulneráveis aos efeitos deletérios que mesmo baixas doses EDC. Seus efeitos foram mostrados para causar reprodutivo e neurológico transtornos². A orientações painel nos agência de proteção ambiental e nos programa nacional de toxicologia, uma dose baixa pode ser definida como qualquer dose abaixo do nível do que foi relatado para causar uma mudança biológica observável ou danificar a³. Além dos efeitos de doses baixas de CDE individuais, misturas de vários CDE encontrado em baixas concentrações no ambiente têm o potencial de causar efeitos cumulativos substantivas⁴.

Bisphenol A (BPA ou 4,4'-(propane-2,2-diyl)) é um agente de polimerização encontrado em itens comumente usados como garrafas de água, armazenamento de recibos, selantes dentários e os forros de bebida e comida latas⁵. Devido à sua semelhança estrutural com 17 β Estradiol (E₂) e a sua afinidade para os receptores de estrogênio ERα e ERβ, BPA foi classificado como um produto químico (EDC)^5,6endócrinos. Apesar de mais fraco, afinidade do BPA para receptores de estrogênio mostrou que afetam o sistema de reprodução de ambos os sexos e interromper funções neurais em doses que são considerados seguros^7,8. Foram observadas alterações na metilação do DNA, através de mecanismos epigenetically regulamentados para causar defeitos neuronais a longo prazo em ratos expostos ao BPA⁹. Especificamente, o BPA também tem sido implicado como um possível culpado para o aumento das taxas de hiperatividade, deficiência de atenção e aumento da sensibilidade às drogas devido ao aumento de visto em receptores de dopamina D1 do posencéfalo límbica do rato após exposição crônica ^{9 , 10}. evidência significativa sobre os efeitos deletérios da CDE sobre a saúde humana é baseada em estudos de correlação, concentrando-se principalmente na exposição crônica das populações a tóxicos ambientais, mesmo em doses baixas,⁵; no entanto, limitações em inferências de estudos humanos e na manipulação de controles experimentais foram aceites ao se lidar com as críticas de campanha publicitária sem fundamento^11,12.

Devido à conservação dos genes Caenorhabditis elegans' em relação dos mamíferos, incluindo seus genes do hormônio esteroide-receptor, os pesquisadores utilizaram este modelo de laboratório geneticamente tractable para desvendar os efeitos funcionais e mecanicistas da CDE ¹³. experimentos com c. elegans mostraram que estes compostos tais como o BPA e BPS podem causar apoptose, mortalidade embrionária, ruptura nos mecanismos de reparação da quebra de DNA dupla-hélice e função neural^{14,15 ,16}.

Nosso laboratório tem mostrado anteriormente que nem baixa dose exposição limitada a embriogênese precoce leva a fecundidade baixou com défices comportamentais nos sobreviventes adultos¹⁵. Habituação a um estímulo repetido é uma forma de aprendizagem não associativa em sistemas modelo, incluindo c. elegans, e nossa metodologia usa esta forma de aprendizagem não-associativa como uma saída comportamental a ensaiar os efeitos a longo prazo da exposição embrionária para as substâncias tóxicas¹⁷ especificamente, nós fornecemos protocolos detalhados para estudar a exposição BPA em c. elegans, incluindo seus efeitos imediatos sobre mortalidade embrionária e efeitos a longo prazo sobre o comportamento do adulto, com uma esquema geral retratada em Figura 1. Resultados representativos de fecundidade e de ensaios de não-aprendizagem associativa são fornecidos para realçar a eficácia de nossa metodologia.

Protocolo

Protocolos abaixo tem sido padronizados para testar os efeitos da exposição BPA durante a embriogênese precoce e podem ser modificados para uso com BPS, BPF ou outros CDE e substâncias tóxicas em embriões de c. elegans .

1. material instalação

1. Prepare 500 mL de mídia de¹⁸ nematódeo crescimento Media (NGM) dissolvendo-se 1,5 g de NaCl, 1,25 g de peptona e 8,5 g de ágar-ágar em água de 500 mL. Após a esterilização em autoclave (121 ° C, 15 PSI, 20 min.), adicionar 0,5 mL de colesterol (5 mg/mL em etanol), 0,5 mL de 1 M MgSO₄, 0,5 mL de 1 M CaCl₂ e 12,5 mL de tampão de fosfato de potássio 1 M, pH 7,4 (108,3 g de KH₂PO₄ 35,6 g de K₂HPO₄, água para 1L).
2. Prepare a solução de hipoclorito pela mistura de 25 mL de 1 N KOH, 4 mL de água sanitária e 71 mL de água. Tornam essa solução fresca.
3. Prepare o M9 Buffer misturando 3 g de KH₂PO₄, 6g Na₂HPO₄, 5g de NaCl, 5 mL de 1 M de MgSO₄e água a 1 L.
4. Prepare o Buffer S¹⁸ misturando 129 mL de 0,02 M K₂HPO₄mL 871 de KH₂PO₄e 5,85 g de NaCl.
5. Esterilize o M9 e S buffers em autoclave.
6. Cresce uma cultura durante a noite de Escherichia coli (cepa 50 OP) em 20 mL de caldo de Luria (LB).
7. Dissolva o BPA em 10% de etanol para fazer uma solução stock de 1 mM. Faça diluições subsequentes de 0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM e 10 µM em buffer de S.
   Nota: Diluição no buffer S aquoso reduz a concentração de etanol; por exemplo, a maior concentração de BPA descrito neste protocolo (10 µM), a concentração de etanol é 0,1% v/v.

2. Culturing de c. elegans e sincronização

1. Despeje a mídia NGM chapas de 100 milímetros (cerca de 25 mL/placa) e deixar solidificar. Uma vez solidificado, propagar as placas espalhando 150 µ l de Escherichia coli OP50 da cultura líquida cresceu durante a noite. Incube as placas a 37 ° C durante a noite.
2. No dia seguinte, traslado N2 vermes nas chapas de novo reunir uma laje aproximada do quadrado de 1 cm. Permitir que vermes a crescer por 3 dias a 20 ° C até que a placa é preenchida com adultos maduros bem alimentados contendo embriões visíveis.
3. Para sincronizar, lave cada placa pipetando até 5 mL de tampão de M9 através da placa. Transferi o líquido para um tubo de centrifuga conico de estéril 15 mL.
   Nota: A sincronização é feita para matar vermes adultos e coletar embriões que são relativamente o mesmo palco.
4. Centrifugar a 3.000 x g, durante 4 min à temperatura ambiente, a fim de obter uma pastilha solta de vermes adultos.
5. Utilizando uma pipeta de 10 mL, remova cuidadosamente o sobrenadante por forma a deixar a pelota intacta. Adicionar 5 mL da solução de hipoclorito e misture suavemente.
6. Centrifugar a 3.000 x g , à temperatura ambiente durante 4 minutos.
7. Remover o sobrenadante com uma pipeta de 10 mL e lave com 7 mL de tampão de M9. Repita duas vezes.

3. expor Worms ao BPA

1. Após a última lavagem do passo 2.7 acima, suspenda a cerca de 100 µ l de ovos com buffer M9. Transferi 50 µ l de ovos para tubos de microcentrífuga de 2 mL contendo já a concentração adequada que BPA diluído em tampão de S. Ajuste a quantidade de buffer de S para garantir a correta concentração final de BPA (µM 0.0, 0.1 µM, 0,5 µM, 1,0 µM, 5,0 µM e 10 µM) pelo tubo. A tabela 1 ilustra uma maneira de tornar estas diluições.

Para a concentração Final de BPA	Estoque de BPA (100 μM)	S Buffer	Worms sincronizado
0.1 ΜM	1 ΜL	949 ΜL	50 ΜL
0,5 ΜM	5 ΜL	945 ΜL	50 ΜL
1 ΜM	10 ΜL	940 ΜL	50 ΜL
5 ΜM	50 ΜL	900 ΜL	50 ΜL
10 ΜM	100 ΜL	ΜL DE 850	50 ΜL

Tabela 1: Estoque BPA, buffer de S e vermes sincronizadas usados para atingir a concentração desejada usada para nosso estudo.

2. Coloque os tubos em uma coqueteleira e agite por 4 h a 20° C, em 25 rpm para um agitador rotativo ou 25 inclina-se. / min. para um balanço shaker.
3. Após 4 h, coloque os tubos nos suportes de tubo e permitir worms para resolver.
4. Descartar o sobrenadante e transferir vermes para placas semeadas (placas NGM com OP50 Escherichia coli). Fazer a cultura OP50 Escherichia coli líquida tal como afirmado no 1.5 e propagar as placas, como indicado no ponto 2.1.
5. Deixe os vermes crescem para 60h em 20 ° C. Examine placas todos os dias para a contaminação. Placas NGM contaminadas são geralmente descoloradas e acompanhadas de colônias individuais. Verifica vermes sob o microscópio para superlotação. Falta de gramado OP50 Escherichia coli e vermes concentradas em pequenos pontos significam a superlotação.

4. ensaio de habituação de toque anterior

1. Transferência de aproximadamente 10 jovens sincronizados pegar vermes adultos para novas placas não-semeadas de NGM usando um fio de platina 30 G fogo-esterilizados. Deixar vermes sem ser perturbado por 5 min permitir-lhes tempo para se aclimatar à nova placa.
2. Para a resposta de habituação, usar um sobrancelha cabelo anexado ao fim de um espeto de madeira ou palito de dente e esterilizar mergulhando em etanol a 70%. Limpe com um tecido limpo cotão e esperar 1 min para etanol evapora-se fora. Toque suavemente o verme na cabeça (anterior do bulbo faríngeo) usando os pelos da sobrancelha. Repita os toques, permitindo que 10 s entre toques a fim de permitir que o worm recuperar.
3. Continue a tocar (permitindo 10 intervalos de interstimulus s) até que o worm já não se move para trás. Neste ponto, o worm tem habituado ao estímulo. Registre o número de toques necessários para o worm para se habituar.
4. Analise a diferença entre as taxas de má habituação dos tratados e não tratados controles usando o One-Way ANOVA seguida pelo teste post hoc de Tukey.

5. worm fecundidade ensaio

1. Transferência individuais vermes L3 para um prato fresco e semeado usando uma picareta de platina. Certifique-se que apenas um verme é colocado por placa.
   Nota: após a fase larval de L3, vermes evoluir para a fase larval de L4 e idade adulta. Pegá-los cedo é conveniente em que eles são grandes o suficiente para a transferência de animais individuais, garantindo que eles já não tinha todos os ovos que, de outra forma, iria ser desperdiçados na contagem.
2. Conte o número de ovos postos a cada 12-24 h. Depois de contar, transferi o verme do pai para uma nova placa. Repita até que o verme para a postura dos ovos, normalmente depois de 5 dias quando incubadas a 20 ° C.
   Nota: em média, um verme tipo selvagem pode colocar até 300 ovos; Portanto, transferindo o pai para uma nova placa diariamente evita a superlotação.
3. Analise a diferença entre o número médio de ovos colocados pelos tratados e não tratados controles usando o One-Way ANOVA seguida pelo teste post hoc de Tukey.

Resultados

Estudos anteriores com c. elegans relataram que a exposição contínua a altas concentrações de BPA (≥ 1 mM) ao longo do desenvolvimento do embrião e a idade adulta diminui fecundidade¹⁴. Estudos subsequentes relatados do nosso laboratório mostraram que os embriões que foram expostos ao BPA durante um período limitado de 4h nos estágios iniciais do seu desenvolvimento mostrou uma diminuição no número de ovos viáveis definidos como adultos¹⁵ (Figura 2). Duas principais características da metodologia foram que (i) as concentrações de BPA usadas eram significativamente mais baixo (0.1 µM a intervalo de 10 µM) e (ii) a exposição foi limitada ao início do período embrionário. Além de diminuição da fecundidade, mesmo em doses mais baixas, nossos ensaios de habituação revelaram que vermes expostos ao BPA como embriões necessários mais estímulos para tornar-se hábito quando comparado aos vermes expostos ao veículo sozinho¹⁵ (Figura 3). Estes efeitos são dignos de nota, em que se baseiam na exposição BPA de baixa dose, seguindo a lógica que efeitos mais sutis na função neuronal que pode não ser morfologicamente aparente são prováveis ser discernível através de mudanças de comportamento. Em suma, os resultados representativos apresentados aqui sublinhado o fato de que os efeitos nocivos da exposição BPA para um embrião influencia seu desenvolvimento, incluindo a função neuronal que pode ser avaliada através de ensaios de comportamentais adultos em c. elegans. Protocolos fornecidos aqui podem ser usados para testar os efeitos de baixa dose, bem como a longo prazo de outros potenciais tóxicos incluindo compostos de interrupções do sistema endócrino.

Figura 1: representação esquemática do desenho experimental. Vermes adultos foram coletadas e expostas a solução de hipoclorito a fim de coletar embriões sincronizados. Os embriões foram então expostos a diferentes concentrações de BPA para 4 h. Os embriões expostos foram transferidos para placas NGM semeadas, onde eles foram autorizados a crescer para 60 h a 20 ° C. Para testar a eficácia de exposição durante os estágios iniciais de desenvolvimento, os vermes L4 foram transferidos para pratos individuais e testados para a fecundidade, e jovens adultos foram testados com toque anterior habituação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: fecundidade é abaixada pelo BPA. Exposição de 1 µM e maiores concentrações de BPA diminuiu significativamente o número de ovos postos em comparação ao controle (representado pela linha horizontal; n = 10, *p < 0,05). Barras de erro denotam SEM. análise feita utilizando ANOVA, teste post hoc de Tukey. Esta figura foi modificada de Mersha et al, 2015¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: efeitos a longo prazo da exposição BPA embrionária são refletidos no comportamento adulto. Os embriões expostos a concentrações de BPA tão baixas quanto 0,1 µM afeta habituação não-associativa toque anterior em adultos (n = 60, *p < 0,05). Barras de erro denotam SEM; ANOVA, teste post hoc de Tukey. Esta figura foi modificada de Mersha et al, 2015¹⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Fases de rápido crescimento e desenvolvimento como embriogênese são particularmente vulneráveis aos efeitos prejudiciais de vários compostos endócrinos, incluindo o BPA. Nós fornecemos protocolos detalhados para estudar os efeitos da exposição ao BPA ou outras substâncias tóxicas no modelo de invertebrados c. elegans , que permite a titulação conveniente de uma gama de concentrações, para avaliar seu efeito sobre a viabilidade do embrião (Figura 2) . Acompanhar experimentos comportamentais sobreviventes adultos que se desenvolvem de embriões que foram expostas a baixas doses de BPA permitem a análise do efeitos a longo prazo na função neuronal (Figura 3). A ideia central deste trabalho é fornecer protocolos detalhados para expor os embriões a várias substâncias tóxicas durante o período de embriogênese inicial no modelo de c. elegans ; a primeira janela de 4 h de seu período de desenvolvimento embrionário de 11,5 horas (a 20 ° C) corresponde ao período de proliferação, que é seguido por organogênese. Nesse sentido, nós fornecemos a validação dos pontos de extremidade através de fecundidade e de ensaios de não-aprendizagem associativa. Enquanto a base mecanicista da ação do BPA e outros bisfenóis é o Santo Graal para que destina-se a investigação neste campo, temos não uma tentativa de oferecer uma explicação mecanicista para a ação do BPA neste artigo focado de metodologia. No entanto, gostaríamos de salientar que o modelo de c. elegans oferece um sistema ideal para dissecar ainda mais o mecanismo de ação. Por exemplo, em um futuro trabalho para decifrar os mecanismos de ação do BPA, c. elegans mutantes podem ser gerados e projectado para uma resistência aos efeitos do BPA e, assim, pavimentar o caminho para decifrar o caminho. Além disso, o nosso papel de companheiro lida com o efeito do BPA no nível de sincronia da rede neural em vertebrados, fornecendo uma outra avenida para entender a base para investigar potenciais mecanismos para efeitos tóxica¹⁹.

Na metodologia detalhada neste trabalho, algumas das etapas essenciais que devem ser executados extra cuidadosamente incluem o seguinte: escolha um prato com bem alimentados c. elegans adultos com ovos maduros visíveis sob o microscópio de dissecação é essencial, e Falha ao seguir esta etapa irá resultar em um tamanho de amostra insuficiente de embriões para o experimento Exposição EDC. Também é importante para se certificar de que a solução de hipoclorito é feita fresca para evitar a obtenção de uma população não sincronizada que irá interferir com a capacidade de realizar exposição BPA durante a embriogênese precoce. Lavagem de pelotas com M9 (após a exposição de hipoclorito) também é um passo muito importante. Se não for feito corretamente, a alta concentração de água sanitária pode resultar em embriões mortos. Além disso, os embriões devem ser transferidos para placas NGM semeadas após 4 h. Se deixada na solução de BPA por um período prolongado de tempo, os embriões são propensos a desenvolver para as larvas de dauer long-lived. Isto irá interferir significativamente com ensaio de fecundidade e ensaios comportamentais. Se qualquer uma dessas etapas é perdida, é aconselhável começar o procedimento desde o início. Se por qualquer motivo, a placa NGM com vermes está contaminada ou não tem comida suficiente, ele irá adicionar o stress sobre os vermes desse modo distorcer os dados coletados. Tais placas devem ser descartadas e não ser usadas no experimento.

Anteriormente, um notável estudo utilizado com sucesso o modelo de c. elegans para demonstrar que anomalias cromossómicas causaram pelo resultado BPA, devido a avaria da maquinaria de reparo de DNA no germline¹⁴. No entanto, é notável que o projeto de estudo acima tinha usado a exposição contínua do BPA de c. elegans a altas doses de BPA durante toda sua vida. Nossa metodologia foi projetada para estudar a baixas doses de exposição BPA durante a embriogênese precoce, a fim de ensaiar seus efeitos sobre a viabilidade embrionária e sutis efeitos de longo prazo sobre os sobreviventes. A nosso conhecimento, nenhuma metodologia foi desenvolvida para expor os embriões adiantados palco para muito baixas doses de BPA, limitado a um período especificado de tempo; assim, tornando o método apresentado aqui romance.

Além disso, os protocolos fornecidos aqui pode ser facilmente adaptado para estudar os efeitos de outros CDE durante a fase de proliferação da embriogênese. No entanto, a fim de estudar a tarde estágios embrionários, o protocolo exigirá modificações chaves para a janela de tempo crítico de desenvolvimento sob foco. Além disso, nosso protocolo não será adequado para experimentos que exigem tempos mais longos de exposição tóxica, como abre a possibilidade da via de desenvolvimento alternativo, resultando na detenção longeva dauer no segundo ciclo muda, que é resistente para condições severas de²⁰. Outras modificações e aperfeiçoamentos serão necessários para tempos mais longos de exposição através de suplemento com uma fonte de alimento que não tem potencial para metabolizar a toxicidade ou EDC por exemplo autoclavado Escherichia coli. Em conclusão, nossa metodologia pode ser utilizada para avaliar os efeitos de vários produtos químicos sobre a fecundidade e na função neuronal endócrinos no sistema de invertebrados modelo c. elegans.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher	7647-14-5
Peptone	Fisher	S25761B
Agar	Fisher	BP1423-500
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
MgSO4	Fisher	7487-88-9
CaCl2	Fisher	C79-500
KH2PO4	Fisher	P286-1
K2HPO4	Fisher	7758-11--4
KOH	Fisher	1310-58-3
Bleach	Clorox	n/a
Na2HPO4	Fisher	BP332-500
LB	Fisher	BP1426-500
BPA	Sigma-Aldrich	239658-250g
BPS	Sigma-Aldrich	103039-100g
EtOH	Sigma-Aldrich	64-17-5
E.coli OP50	CGC		Repository at U of Minnesota
N2 (Wild-type C. elegans) worms	CGC		Repository at U of Minnesota
Platinum wire pick	Genesee Scientific	59-AWP
Petri plates	Fisher	07-202-011
Dissection Microscope	AmScope	SM-2TYY