낮은 복용량 유독 배아 노출의 장기 행동 및 생식 결과

요약

유독 환경 노출 수 심하게 장기 효과와 개발에 영향을. 자세한 프로토콜 bisphenol a.에 초기 배아 노출의 효과 연구 하는 효과적인 실험실 모델을 사용 하는 전략을 설명 하기 위해 제공 됩니다. 통치 우리의 toxicant 노출 바이오-분석 실험의 효과 모니터링 하는 행동 분석 제공.

초록

비스 페 놀 A (BPA)와 같은 Bisphenols 및 bisphenol S (BPS) 플라스틱 및 수많은 일상-사용 제품의 생산에서 널리 이용 되는 대리인 polymerizing는. 그들의 화학 구조와 estradiol 같은 생물 학적 속성을 기반으로, 그들은 내 분 비 방해 화합물 (EDC)로 분류 되어 있다. 낮은 복용량 에서도 EDCs, 장기 노출 암, 행동 장애 및 불 임, 초기 발달 기간 동안 표시 된 큰 취약점 등 다양 한 건강 결함에 연결 되었습니다. 꼬마 선 충 유전자 온순한 선 충 모델 세포질이 고 분자 연구 BPA에 노출 하면 apoptosis, 배아 치 사 율 및 중단 DNA 수리 메커니즘을 증명 하고있다. 우리 이전 다른 bisphenols 감소 통치의 낮은 복용량을 선 충 C. 배아의 노출을 보고 있다. 또한, 우리는 개발의 아주 초기 단계에서 노출의 효과 habituation 동작, 연관 학습의 형태를 측정 하 여 분석으로 성인으로 지속 나타났습니다. 여기, 우리는 낮은 복용량 EDCs 관련된 통치 뿐만 아니라 고 앞쪽에 배아 노출에 대 한 자세한 프로토콜 터치 habituation 분석 실험, 대표적인 결과 함께 제공 합니다.

서문

환경 유독 노출 특히 그 개발을 방해 하는 경향이, 최근 몇 년 동안에서 주의 과학 감시 받고 있다 화합물. 매일 사용 화학 물질 보다 더 천 내 분 비 방해 화합물 (EDC)¹로 분류 됩니다. 급속 한 성장 및 개발, 배아, 유아를 포함 하는 유년기 단계, 기간도 낮은 복용량 EDC에 해로운 효과에 특히 취약 한 것으로 지적 되었습니다. 그들의 효과 생식과 neurodevelopmental 장애²되도록 표시 되었습니다. 미국 환경 보호 기구와 미국 국가 독물학 프로그램 패널 지침 당 낮은 복용량 관찰 생물 학적 변경 시키거나 손상³보고 되었습니다 한 수준 아래 모든 복용량으로 정의할 수 있습니다. 외에 개별 EDCs의 낮은 복용량 효과, 다양 한 EDCs 환경에서 낮은 농도에서 발견의 혼합물 실질적인 누적 효과⁴를 일으킬 가능성이 있다.

비스 페 놀 A (BPA 또는 4,4'-(propane-2,2-diyl)) 물병, 저장소 영수증, 치과 밀봉, 음료의 라이닝 등 일반적으로 사용된 하는 항목에는 polymerizing 에이전트 이며 식품 캔⁵. 17 β Estradiol (E₂)에 그것의 구조상 상사 성 및 ERα 및 ERβ 에스트로겐 수용 체에 그것의 선호도, BPA는 내 분 비 방해 화학 (EDC)^,56으로 분류 되었습니다. 비록 약한, 에스트로겐 수용 체에 BPA의 선호도 남녀의 생식 시스템에 영향을 미칠 안전한^7,8으로 간주 되는 복용량에서 신경 기능을 중단을 표시 되었습니다. Epigenetically 규제 메커니즘을 통해 DNA 메 틸 화에 변경 BPA⁹에 드러낸 쥐에서 장기적인 신경 결함 원인을 관찰 되었습니다. 특히, BPA는도 연루 되어 과다, 주의 결핍 및 약물 만성 노출 후 마우스 변 개에서 D1 도파민 수용 체에서 본 증가 때문에 증가 된 감도의 증가 속도 대 한 가능한 범인으로 ^{9 , 10}. 인간의 건강에 EDCs의 해로운 영향에 대 한 중요 한 증거의 낮은 복용량⁵; 에서도 환경 유독 인구가 만성 노출에 주로 초점을 맞추고 상관 관계 연구 기반 그러나, 인간 연구에서 추론 및 실험적인 컨트롤 조작 한계 입증된과 대^11,12의 비판을 해결 하는 동안 허용 되었습니다.

포유류에 관하여 꼬마 선 충의 유전자의 보존으로 인해, 포함의 스테로이드 호르몬 수용 체 유전자, 연구원 EDCs의 기능과 기계적 효과 해명 하기이 유전자 그러므로 실험실 모델 활용 ¹³. 선 충 C. 실험은 BPA 등 BPS이이 화합물이 이중 가닥 DNA 틈 수리 메커니즘 및 신경 기능^{14,15 apoptosis, 배아 치 사 율, 중단을 발생할 수 있습니다 나타났습니다 ,16}.

우리 실험실은 이전 초기 embryogenesis 제한도 낮은 복용량 노출 살아남은 성인¹⁵행동 적자와 낮춘된 통치에 이르게 표시 됩니다. 반복 자극 요법이 니 연관 학습의 형태에서 C. 선 충를 포함 하 여 모델 시스템 이며 우리의 방법론을 사용 하 여이 양식을 연관 학습의 행동 출력으로 배아 노출의 장기 효과 분석 결과 유독¹⁷ 특히, 상세한 프로토콜에 대 한 제공 C. 선 충, 배아 치 사 율에 미치는 즉각적인 영향 및 성인 행동에 장기적인 효과 포함 하 여 에 묘사 된 전체 회로도와에 BPA 노출 공부 그림 1. 통치와 연관 학습 분석 실험에서 대표적인 결과 우리의 방법론의 효과 강조 하기 위해 제공 됩니다.

프로토콜

프로토콜 아래에 주어진 초기 embryogenesis 동안 BPA 노출의 효과 테스트를 표준화 하 고 BPS, BPF 또는 다른 EDCs 및 선 충 C. 태아에 유독 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다.

1. 소재 설정

1. NaCl의 1.5 g, 펩의 1.25 g 및 물 500 mL에 한 천의 8.5 g을 용 해 하 여 선 충 류 성장 미디어 (NGM)¹⁸ 미디어의 500 mL를 준비 합니다. 압력가 마로 소독 (121 ° C, 15 PSI, 20 분), 후 추가 (5 mg/mL에 에탄올), 콜레스테롤의 0.5 mL 0.5 mL 1 M MgSO₄, 0.5 mL 1 M CaCl₂ 와 12.5 mL 1 M 칼륨 인산 염 버퍼, pH 7.4 (108.3 g KH₂포₄ 의의 의 K₂HPO₄, 물 1 L에 35.6 g).
2. 1 N 코의 25 mL, 표 백제, 4 mL 및 물 71 mL를 혼합 하 여 차 아 염소 산 솔루션을 준비 합니다. 신선한이 솔루션을 확인 합니다.
3. M9 버퍼 KH₂포₄의 3 세대, 나₂HPO₄6 g, NaCl의 5 g, MgSO₄, 및 1 나 물 1 M의 5 mL를 혼합 하 여 준비
4. 0.02 M K₂HPO₄의 129 mL, KH₂포₄, 871 mL와 NaCl의 5.85 g을 혼합 하 여¹⁸ S 버퍼 준비 합니다.
5. 압력가 마로 소독 하 여 M9 및 S 버퍼를 소독.
6. 대장균 (스트레인 OP 50) 20 mL Luria 국물 (파운드)의에서의 숙박 문화를 성장.
7. 1 m m 재고 솔루션 10% 에탄올에 BPA를 분해. S 버퍼에서 0.1 µ M, 0.5 µ M, 1 µ M, 5 µ M 및 10 µ M의 후속 희석을 확인 합니다.
   참고: 수성 S 버퍼에 희석 크게; 에탄올의 농도 감소 예를 들어,이 프로토콜 (10 µ M)에 설명 된 가장 높은 BPA 농도에서 에탄올의 농도 0.1 %v / v입니다.

2. 선 충 C. Culturing 및 동기화

1. NGM 미디어 100 mm 접시 (약 25 mL/접시)에 부 어 하 고 공고히 하 있습니다. 경화, 일단 하룻밤 성장 액체 문화에서 대장균 OP50의 150 µ L를 확산 하 여 판 씨. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
2. 다음 날, 새로운 접시에 N2 웜 전송 청크 1 cm 광장의 대략적인 슬 래 브. 벌레 접시 보이는 배아를 포함 하는 잘 먹이 성숙한 어른으로 채워집니다 때까지 20 ° C에서 3 일 동안 성장 하는 것을 허용 한다.
3. 동기화 할 각 접시 접시에 걸쳐 M9 버퍼의 최대 5 mL를 pipetting으로 세척. 살 균 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 액체를 전송.
   참고: 동기화 성인 벌레를 죽 일 하 여 상대적으로 같은 무대는 배아를 수집 이루어집니다.
4. 어른 벌레의 느슨한 펠 렛을 얻기 위해 상 온에서 4 분 동안 3000 x g에서 원심.
5. 10 mL 피 펫을 사용 하는 펠 릿을 그대로 있도록 상쾌한 조심 스럽게 제거. 차 아 염소 산 솔루션의 5 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합.
6. 4 분 동안 실 온에서 3000 x g 에서 원심.
7. 10 mL 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 M9 버퍼의 7 mL로 씻어. 이 단계를 두 번 반복 합니다.

3. 웜 BPA에 노출

1. 위의 단계 2.7에서에서 마지막 세척 후 M9 버퍼와 계란의 약 100 µ L를 일시 중단 합니다. 이미 BPA S 버퍼에 희석 하는 적절 한 농도 포함 하는 2 mL microfuge 관에 계란의 약 50 µ L를 전송 합니다. S-버퍼 튜브 당 BPA (0.0 µ M, 0.1 µ M, 0.5 µ M, 1.0 µ M, 5.0 µ M 및 10 µ M)의 올바른 최종 농도 위해의 양을 조정 합니다. 표 1에서는 이러한 희석 수 있도록 한 가지 방법은 보여 줍니다.

최종 BPA 농도 대 한	BPA를 재고 (100 μ M)	S 버퍼	동기화 된 웜
0.1 Μ M	1 Μ	949 Μ	50 Μ
0.5 Μ M	5 Μ	945 Μ	50 Μ
1 Μ M	10 Μ	940 Μ	50 Μ
5 Μ M	50 Μ	900 Μ	50 Μ
10 Μ M	100 Μ	850 Μ	50 Μ

표 1: 주식 BPA, S 버퍼 및 우리의 연구에 대 한 사용 원하는 농도 달성 하는 데 사용 하는 동기화 된 웜

2. 통에 튜브를 배치 하 고 부드럽게 회전 통에 대 한 25 rpm 또는 락 통에 대 한 25 젖 힌 채/min에서 20 ° C에서 4 h 흔들.
3. 4 h 후 튜브 튜브 홀더에 놓고 벌레 정착을 허용 합니다.
4. 상쾌한 무시 하 고 시드 판 (NGM 접시 OP50 대장균) 벌레를 전송. 1.5에서 제시 된 대로 액체 OP50 대장균 문화를 만들고 판 2.1에 명시 된 씨앗.
5. 20 ° C에 60 h에 대 한 성장 하는 벌레를 하자 매일 오염에 대 한 번호판을 검사 합니다. 오염된 NGM 접시는 보통 변색 하 고 개별 식민지와 함께. 과 밀에 대 한 현미경 벌레를 확인 합니다. OP50 대장균 잔디 및 작은 반점에 집중된 벌레의 부족과 밀을 의미 합니다.

4. 앞쪽 터치 Habituation 분석 결과

1. 약 10 동기화 된 젊은 성인 벌레 화재 소독 30 G 플래티넘 와이어를 사용 하 여 새로운 unseeded NGM 접시를 받아 전송 합니다. 벌레를 있도록 5 분 동안 그대로 두고 새로운 접시에 순응 하는 시간.
2. Habituation 응답 나무 꼬치 또는 이쑤시개의 끝에 연결 된 눈 썹 머리를 사용 하 고 70% 에탄올에 담그고, 소독 합니다. 깨끗 하 고 보풀 휴지로 닦 고 떨어져 증발 하는 에탄올에 대 일 분 동안 대기. 부드럽게 터치 (pharyngeal 전구의 앞쪽) 머리에 벌레 눈 썹 머리를 사용 하 여. 10 허용 접촉을 반복 벌레 복구를 할 수 있도록 접촉 사이 s.
3. 벌레는 더 이상 뒤로 이동 될 때까지 (10 s interstimulus 간격 허용) 터치를 계속 합니다. 이 시점에서, 벌레는 자극에 익혀 진다. 길 들을 벌레에 필요한 접촉의 번호를 기록 합니다.
4. Tukey의 포스트 hoc 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 치료 및 치료 컨트롤의 의미 요법이 니 속도 차이 분석 합니다.

5. 웜 통치 분석 결과

1. 백 금 선택을 사용 하 여 신선 하 고 시드 플레이트를 개별 L3 벌레를 전송 합니다. 그 하나의 벌레 접시 당 배치는 다는 것을 확인 하십시오.
   참고: L3 애벌레 단계 후 웜 L4 애벌레 단계와 성인으로 개발. 그들은 그들은 이미 카운트에서 놓친 것 이라고는 계란은 마련 하지는 보장 하면서 개별 동물의 전송을 위해 충분히 큰에 그들을 일찍 수확 하는 것이 편리 합니다.
2. 모든 12-24 h 누워 계란의 수를 계산 합니다. 후 새로운 접시에 부모 웜 전송. 웜은 일반적으로 5 일 후 계란, 누워 중지 될 때까지 반복 20 ° c.에서 알을 품을 때
   참고: 평균, 야생 타입 웜 수 알 최대 300; 따라서과 밀 방지 매일 새로운 접시에 부모를 전송 합니다.
3. Tukey의 포스트 hoc 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 치료 및 치료 컨트롤에 의해 계란의 평균 수의 차이 분석 합니다.

결과

C. 선 충 과 이전 연구는 배아 개발 및 성인 기에 걸쳐 높은 BPA 농도 (≥1 m m)에 지속적인 노출 통치¹⁴감소 보고 있다. 후속 연구 실험실에서 보고 실행 가능한 계란의 수에 있는 감소를 보여주었다 그들의 개발의 시작 단계에서 4 h의 제한 된 기간에 대 한 BPA에 노출 된 태아 성인¹⁵ (그림 2)으로 누워 나타났습니다. 방법론의 두 가지 주요 특징 (i) BPA 집중 사용 했다 상당히 낮은 (10 µ M 범위 0.1 µ M) 및 (ii) 노출은 이른 미 발달 기간을 제한 했다. 더 낮은 복용량에 조차 감소 통치, 게다가 우리의 habituation 분석 웜 배아 필요한 벌레에 비교 될 때 길 들 여가를 더 자극 BPA에 노출 차량 혼자¹⁵ (그림 3)에 노출 밝혔다. 이러한 효과 주목할 만한 그들은 낮은 복용량 BPA 노출, 형태학 상으로 명백한 되지 않을 수 있습니다 신경 기능에 영향을 미묘한 행동 변화를 통해 인지할 수 가능성이 있다는 근거에 따라 기반. 즉, 대표 결과 제시 여기 밑줄 배아에 BPA 노출의 해로운 효과 미치는 영향 C. 선 충에서 성인 행동 분석을 통해 평가 될 수 있다 신경 기능을 포함 하 여 그것의 발전 하는 사실. 다른 잠재적인 이용과 등 내 분 비 혼란을 일으키는 화합물의 낮은 복용량으로 장기적인 효과 테스트 하기 위해 여기에 제공 된 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

그림 1: 실험적인 디자인의 도식 대표. 성숙한 벌레 수집 하 고 동기화 된 배아를 수집 하기 위해 차 아 염소 산 솔루션에 노출 했다. 배아 다음 4 h에 대 한 BPA의 다른 농도에 노출 되었다. 노출 된 태아 60 h 20 ° c.에 대 한 성장을 허용 된 시드 NGM 접시에 전송 개발의 초기 단계 동안 노출의 효과 테스트 하기 위해 L4 웜 개별 번호판 전송 되었고, 통치에 대 한 테스트 있으며 젊은 성인 앞쪽 터치 habituation 테스트 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: BPA에 의해 통치를 낮 췄 다. 1 µ M와 BPA의 높은 농도에 노출은 크게 (; 가로 선으로 표시 하는 컨트롤에 비해 누워 계란의 수 감소 n = 10, *p < 0.05). 오차 막대 SEM. 분석 한 ANOVA, Tukey의 포스트 hoc 테스트를 사용 하 여 나타냅니다. 이 그림은 Mersha 그 외 여러분, 2015¹⁵에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 배아 BPA 노출의 장기 효과 성인 행동에 반영 됩니다. 배아 BPA 농도 0.1 µ M에 영향을 미치는 성인 비연관 앞쪽 터치 habituation으로 낮은 노출 (n = 60, *p < 0.05). 오차 막대를 나타내는 SEM; ANOVA, Tukey의 특별 테스트 게시물. 이 그림은 Mersha 그 외 여러분, 2015¹⁵에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

급속 한 성장 및 embryogenesis 등 개발의 단계는 BPA를 포함 한 다양 일 분 비 방해 화합물의 해로운 효과에 특히 취약 합니다. BPA 또는 다른 이용과 다양 한 태아 생존 능력 (그림 2)에 미치는 영향을 평가 하는 농도의 편리한 적정 수 있는 선 충 C. 무척 추 동물 모델에서의 효과 연구에 대 한 자세한 프로토콜 제공 . 후속 행동 실험 했다 BPA의 낮은 노출된 복용 있도록 신경 기능 (그림 3)에 대 한 장기 효과 시 금 배아에서 개발 하는 성인 생존에. 이 종이의 중앙 아이디어, C. 선 충 모델에 초기 embryogenesis 기간 동안 다양 한 이용과 배아를 노출 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 하는 11.5 시간 배아 개발 기간 (20 ° C)에서 첫 번째 4 h 창 organogenesis에 따라 확산 기간에 해당 합니다. 이 끝에, 우리 통치와 연관 학습 분석 실험을 통해 끝점의 유효성 검사를 제공. BPA와 다른 bisphenols의 행동의 기계적으로 성배는 쪽으로이 분야에서 연구 목적으로, 우리는이 방법론 집중된 기사에 BPA의 행동에 대 한 기계적 설명을 하려고 하지. 그러나, 우리는 선 충 C. 모델 추가 행동의 메커니즘을 해 부 하기 위한 이상적인 시스템을 제공 지적 하 고 싶습니다. 예, 미래에 BPA 행동의 메커니즘을 해독에 일 C. 선 충 돌연변이 통로 해독을 위한 길을 따라서 고 BPA의 효과에 저항에 대 한 검사 생성 될 수 있습니다. 또한, 우리의 동반자 종이 조사 toxicant 효과¹⁹에 대 한 잠재적인 메커니즘에 대 한 기초를 이해 하는 또 다른 수단을 제공 하는 척추 동물에서 신경 네트워크 synchrony 수준에서 BPA의 효과 함께 다룹니다.

이 문서에 자세히 설명 하는 방법론에서 해야 하는 중요 한 단계 중 일부는 추가 실행 신중 하 게 다음을 포함: 성인 성숙 해 부 현미경 아래 표시 된 결정적, 이다 잘 먹이 C. 선 충 으로 접시를 선택 하 고 이 단계를 수행 하는 데 실패 하는 것은 EDC 노출 실험에 대 한 배아의 부족 한 샘플 크기 귀 착될 것 이다. 그것은 또한 차 아 염소 산 솔루션을 수행 하는 BPA 노출 동안 초기 embryogenesis 능력을 방해할 것입니다 동기화 되지 않은 인구를 얻는 피하기 위해 신선한 만든 ㄴ 다는 것을 확인 하는 것이 중요. (차 아 염소 산 노출) 후 M9와 펠 릿을 세척 하는 것은 또한 매우 중요 한 단계입니다. 제대로 하지, 백제의 높은 농도 죽은 태아에 발생할 수 있습니다. 또한, 배아 시드 NGM 번호판 4 h 후 전송 한다. 시간의 연장된 기간에 대 한 BPA 솔루션에 남아, 경우 배아 긴 dauer 애벌레로 발전 가능성이 있다. 이 크게 통치 분석 결과 행동 분석 방해할 것 이다. 이 단계는 보고, 그것은 처음부터 절차를 시작 하는 것이 좋습니다. 어떤 이유로, 웜 NGM 플레이트는 오염지 않습니다 없는 경우 충분 한 음식, 그것은 그로 인하여 수집 된 데이터를 왜곡 하는 벌레에 스트레스를 추가 합니다. 이러한 판 무시 해야 하 고 실험에 사용할 수 없습니다.

이전, 놀라운 연구 성공적으로 선 충 C. 모델 염색체 이상이 생식¹⁴DNA 수리 기계 고장 때문 BPA 결과 의해 발생을 설명 하기 위해 사용. 그러나, 그것은 주목할 만한 위의 연구 설계 연속 BPA 노출 C. 선 충 의 그것의 수명에 걸쳐 BPA의 고용량을 사용 했다. 우리의 방법론은 시험의 그것의 미 발달 생존 능력에 영향 및 subtler 장기 효과 생존자를 위하여 초기 embryogenesis 동안 BPA 노출의 낮은 복용량을 공부 하도록 설계 되었습니다. 우리의 지식을 하려면, 아무 방법론; 지정된 기간을 제한 하는 BPA의 매우 낮은 복용량을 초기 단계 배아를 노출 하도록 개발 되었습니다. 따라서, 메서드를 만드는 소설 여기 제시.

또한, 프로토콜 제공 여기 embryogenesis의 확산 단계 다른 EDCs의 효과 연구를 쉽게 적용할 수 있습니다. 그러나, 늦은 배아 단계를 공부 하기 위하여 프로토콜 초점에서 개발의 중요 한 시간 창에 주요 수정이 필요 합니다. 또한, 우리의 프로토콜 되지 않습니다 toxicant 노출의 긴 시간을 필요로 하는 실험에 대 한 적당 한 대체 개발 통로 두 번째 탈피 주기, 수명이 긴 dauer 체포에서 결과의 가능성을 열어 가혹한 조건²⁰ 추가 수정 및 수정 toxicant 또는 EDC 예: 대사를 가능성 없는 음식 소스와 함께 보충을 통해 더 긴 노출 시간에 대 한 필요한 것입니다 압력가 대장균. 결론적으로, 우리의 방법론 무척 추 동물 모델 시스템에서 화학 물질은 통치와 신경 기능을 방해 하는 다양 일 분 비의 효과 평가 하기 위해 이용 될 수 있다 C. 선 충.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher	7647-14-5
Peptone	Fisher	S25761B
Agar	Fisher	BP1423-500
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
MgSO4	Fisher	7487-88-9
CaCl2	Fisher	C79-500
KH2PO4	Fisher	P286-1
K2HPO4	Fisher	7758-11--4
KOH	Fisher	1310-58-3
Bleach	Clorox	n/a
Na2HPO4	Fisher	BP332-500
LB	Fisher	BP1426-500
BPA	Sigma-Aldrich	239658-250g
BPS	Sigma-Aldrich	103039-100g
EtOH	Sigma-Aldrich	64-17-5
E.coli OP50	CGC		Repository at U of Minnesota
N2 (Wild-type C. elegans) worms	CGC		Repository at U of Minnesota
Platinum wire pick	Genesee Scientific	59-AWP
Petri plates	Fisher	07-202-011
Dissection Microscope	AmScope	SM-2TYY