Método de triagem para micropartículas em transfusões de plaquetas de rotina

Resumo

Gestão de inventário de plaquetas com base no conteúdo de micropartículas em concentrados de plaquetas de rastreio é uma nova iniciativa de melhoria de qualidade em bancos de sangue do hospital. O objetivo é diferenciar registrados de plaquetas não está ativado para otimizar o uso de plaquetas. Fornecimento de plaquetas não está ativado para pacientes de Hematologia-Oncologia pode reduzir seu risco elevado para se tornar refratários.

Resumo

Gestão de inventário de plaquetas com base no conteúdo de micropartículas em concentrados de plaquetas de rastreio é uma nova iniciativa de melhoria de qualidade para os bancos de sangue do hospital. Fragmento de células fora de micropartículas (MP), quando estão estressadas. Sangue e os componentes sanguíneos podem conter fragmentos celulares de uma variedade de células, mais notavelmente de plaquetas activadas. Ao executar seus papéis como células do sistema imune inatas e grandes jogadores na coagulação e hemostasia, plaquetas mudam de forma e geram micropartículas. Com Difusão dinâmica da luz (DLS)-com base em micropartículas deteção, é possível diferenciar ativado (microparticulado alto) de plaquetas não está ativado (microparticulado baixa) em transfusões e otimizar o uso deste produto escasso sangue. Pesquisas anteriores sugerem que fornecendo as plaquetas não está ativado para uso profilático em pacientes de Hematologia-Oncologia pode reduzir seu risco de se tornar refratários e melhorar o atendimento ao paciente. O objetivo deste método de triagem é rotineiramente diferenciar ativado de plaquetas não está ativado. O método descrito aqui descreve as etapas a serem executadas para a gestão de inventário de plaquetas de rotina em um banco de sangue do hospital: obtenção de uma amostra de uma transfusão de plaquetas, carregando a amostra no capilar para medição de DLS, realizando o DLS teste para Identifica micropartículas e usando o conteúdo relatado micropartículas para identificar as plaquetas ativadas.

Introdução

O interesse em micropartículas tem girava principalmente em torno de sua participação em processos de comunicação e biológico celular para celular. ^{1 , 2 , 3} mais recentemente, micropartículas também atraíram interesse como potenciais marcadores de diagnósticos precoce das doenças cardiovasculares e auto-imunes. ^{4 , 5} micropartículas, também conhecido como extracelulares vesículas ou exosomes, têm sido amplamente investigadas por citometria de fluxo. Infelizmente, apesar dos esforços para padronizar os protocolos de citometria de fluxo convencional não há nenhum consenso sobre o protocolo ideal para usar. ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10}

Apesar de citometria de fluxo convencional pode caracterizar subpopulações específicas de MP,¹¹ tem vários relatados limitações. ^{11 , 12 , 13 , 14} algumas destas limitações foram abordadas usando lasers de potência maiores e detectores em um so-called "opção de pequenas partículas",^15,16 , bem como a detecção na frente de 15 ° - 25 ° ângulo de dispersão e modificado pressão bainha . ^{17 , 18} , no entanto, um método de rastreio rápido e fácil de usar que pode ser combinado com estes métodos sofisticados é ainda necessários para utilizar micropartículas como marcadores de diagnósticos precoce. Os níveis elevados de micropartículas são detectáveis em cerca de um terço dos doadores de sangue normal¹⁹ e podem indicar condições subclínicos. Por conseguinte, microparticulado altos níveis em produtos de sangue doado podem ser incompatíveis com os destinatários vulneráveis. ²⁰

Quando fornecer transfusões de plaquetas, existe um risco de refratariedade não imune - uma condição em que o corpo do paciente rejeita transfusões consecutivas e não permite que uma parcela significativa de plaquetas para circular. ^{21 , 22} refratariedade Non-imunes pode resultar em desperdício transfusões, complicações de saúde para os pacientes e estendido hospital fica. ²³ contendo números elevados de micropartículas de transfusões de plaquetas podem ser um fator que contribui para o desenvolvimento de refratariedade não imune em doentes de Hematologia-Oncologia vulnerável. ²⁰ é possível gerenciar o estoque de plaquetas de acordo com a composição de transfusão de plaquetas por rastreio de micropartículas, reduzindo o risco para os pacientes vulneráveis. No entanto, a maioria dos testes de micropartículas exigem isolamento de micropartículas de plaquetas^5,12 ou caso contrário são muito trabalho intensivo^24,25 e, portanto, não pode ser implementada rotineiramente no hospital bancos de sangue.

A técnica descrita aqui usa Difusão dinâmica da luz (DLS) - também conhecida como espectroscopia de correlação de fótons ou espalhamento de luz quase elástico. Durante décadas, difusão dinâmica da luz tem foi usado extensivamente na indústria farmacêutica para caracterizar lipossomal drogas formulações ou emulsões onde tamanhos de partícula estão na faixa de submícron. ^{26 , 27} no entanto, ferramentas desenvolvidas para esses aplicativos não são otimizadas para produtos derivados de sangue de tela. Um novo sistema DLS foi desenvolvido para superar as limitações técnicas e tornar dinâmico luz espalhamento útil para triagem de transfusão de plaquetas. ²⁸

Difusão dinâmica da luz medições são feitas iluminando as partículas em suspensão com luz laser e analisando a variação do tempo de dispersas a intensidade da luz que é uma consequência de partículas em movimento em suspensão. Além disso, que este método usa a relação inversa entre a velocidade da partícula e tamanho - pequenas partículas movem-se rapidamente e grandes partículas movem-se lentamente - para fornecer informações sobre as distribuições de tamanho e concentração relativa dos componentes da amostra. Raio de conteúdo e médio do componente microparticulado usando DLS, as micropartículas média pode ser quantificado. O conteúdo de micropartículas através do sangue é dada como % MP baseada a área no histograma medido por raios da partícula de 50-550 nm. Enquanto as partículas com raios abaixo de 50 nm são detectados pelo DLS e relatado pelo sistema DLS, eles não são incluídos em % MP. Em vez de isolar micropartículas de plaquetas, a heterogeneidade de transfusão de plaquetas é determinada com base no conteúdo relativo de micropartículas e plaquetas em uma amostra. Na verdade, a razão entre os picos de plaquetas e micropartículas pode ser usada para calcular a concentração absoluta de MP quando a contagem de plaquetas é conhecida. ¹⁹

O sistema DLS fornece a profissionais de saúde com informações qualitativas e quantitativas sobre micropartículas encontradas em amostras de derivados do sangue ou produtos sanguíneos. A principal vantagem da técnica descrita DLS sobre técnicas alternativas tais como citometria de fluxo, microscopia eletrônica, nanopartículas de²⁹ análise³⁰ ou sintonizável pulso resistivo sensoriamento³¹ de rastreamento é a preparação da amostra: alíquotas de concentrados de plaquetas podem ser medidas diretamente sem a necessidade de isolar o MP de plaquetas, diluição da amostra ou outras modificações. ^{9 , 17} além disso, DLS é um método de dimensionamento absoluto e não sofre com a falta de grânulos de calibração com índice de refração adequado. ^{14 , 32}

Uma correlação entre Ativação plaquetária e conteúdo do MP tem sido mostrada anteriormente por microscopia^33,20 e pode ser inferida o aumento no conteúdo de MP em condições patológicas^{15,34, 35 , 36} e condições em vitro conhecido para ativar as plaquetas. ^{19 , 37 , 38} no entanto, mais estudos são necessários para compreender a relação de ativação de conteúdo e plaquetas de micropartículas DLS-medido. Com base no nosso conhecimento atual que as plaquetas ativadas contêm números elevados de micropartículas, eles são melhores utilizados para tratamento terapêutico de sangrando ativamente pacientes³⁹, enquanto pacientes de Hematologia-Oncologia beneficiam não está ativado plaquetas com n ou níveis baixos de micropartículas²⁰. Recentemente foi relatado que em vitro capacidade de resposta das plaquetas do doador não significativamente afetar a recuperação e a sobrevivência destas plaquetas no única transfusões para pacientes estáveis, principalmente não-sangramento Hematologia-Oncologia⁴⁰ . Partir desta constatação, pode concluir-se que a ativação plaquetária, identificada pelo alto teor de MP também não desempenha nenhum papel significativo no tratamento profilático de pacientes. No entanto, devido à estreita seleção dos pacientes, este estudo não abordou o impacto dos fatores de doador para complexos pacientes febris (excluídos do estudo), não está estável e receber muitos mais que uma transfusão de plaquetas. A questão de como a complexidade desses casos a paciente pode ser reduzida - que mantém a promessa de reduzir a refratariedade - permanece sem resposta.

Micropartículas são primeiros marcadores de inflamação^41,42,,^43,44 e plaquetária ativação⁴⁵ e, portanto, são detectadas em muitos doadores normais. ¹⁹ , por conseguinte, as plaquetas ativadas e micropartículas estão presentes nas doações de plaquetas. É razoável a hipótese de que pacientes com febre, ou seja, um totalmente ativado sistema imune inato, não podem tolerar o desafio adicional de uma transfusão de plaquetas activadas. No entanto, são necessários estudos para provar essa hipótese. Rastreio de micropartículas pode aliviar a atual incerteza sobre o conteúdo das transfusões de plaquetas e reduzir a complexidade do tratamento do paciente.

O rácio de plaquetas ativadas para não está ativado em um banco de sangue do hospital depende principalmente da população de doadores e em muito menor grau, dos transportes, irradiação, inativação de patógenos e outros processos que possam aumentar a ativação plaquetária em concentra-se. ¹⁹ dados de bancos de sangue grande hospital nos Estados Unidos mostram que a composição média do estoque de plaquetas é 49% ativado e 51% não está ativado (intervalo para plaquetas activadas: 38-62%, comunicação pessoal). Se os fornecedores de produtos de sangue ou de bancos de sangue do hospital quer saber quantos concentrados de plaquetas ativadas e não está ativado que produzem ou recebem e para gerenciar seu inventário baseiam na Ativação plaquetária, conforme indicado por micropartículas conteúdo, isto protocolo pode ser apropriado para eles.

Com base na composição de plaquetas, um banco de sangue do hospital será capaz de dirigir as plaquetas não está ativado, homogêneas para profilaxia usam e ativado, plaquetas heterogêneas para uso terapêutico. Seleção de plaquetas permite hospitais maximizar o uso do inventário disponível que melhora o atendimento ao paciente e diminui o custo. Este protocolo destina-se ao pessoal de laboratório que estão familiarizado com a manipulação básica e manipulação de produtos de sangue.

Apresentado aqui é um método de triagem para micropartículas em transfusões de plaquetas que podem ser aplicadas rotineiramente para gerenciar inventário de banco de sangue do hospital onde selecionar o produto com base no conteúdo de micropartículas é desejável. O objectivo do presente protocolo é delinear a implementação e avaliação de DLS para rastreio de plaquetas doadas. O protocolo descrito aborda as perguntas comuns de acesso não-invasivo para amostras, integração do teste para o fluxo de trabalho do banco de sangue e características de desempenho.

Protocolo

O seguinte protocolo tem sido realizado em conformidade com todas as orientações de serviços de sangue canadense (CBS). Voluntários deram consentimento que suas doações poderiam ser usados para realizar esses estudos. Concentrados de plaquetas foram preparados de acordo com os procedimentos habituais de funcionamento CBS. Todos os testes de desempenho descrito aqui foi realizado no centro para pesquisa de sangue na Universidade de British Columbia, Vancouver, Canadá com aprovação do Conselho de ética de pesquisa institucional.

1. verificação de controle de qualidade

1. Execute uma verificação de controle de qualidade pelo menos uma vez por dia para verificar o bom funcionamento do sistema de DLS de teste. Medir os grânulos de controle fornecido (raio de 50 nm), seguindo as instruções do fabricante para uso.
2. Recuperar o frasco de controlo do armazenamento frio e permitir 15 min aquecer a temperatura ambiente. Os grânulos devem equilibrar a temperatura ambiente antes de usar.
3. Ligue o sistema DLS antes da preparação da amostra para que o período de aquecimento de laser 15 min é concluído no momento em que a primeira amostra está pronta para o teste.
4. Uma vez que o console foi iniciado, siga as instruções na tela de toque para entrar e selecione a opção de teste de sistema para medir a amostra de controle.
5. Vórtice misturar o frasco de 10 s para garantir uma amostra representativa.
6. Encha um capilar com os grânulos de controle usando uma pipeta de volume fixo µ l 100, ponta da pipeta e capilar do kit de teste.
7. Quando o teste é concluído, siga as instruções na tela do sistema de DLS.
   Nota: Os resultados de teste do grânulo do controle são automaticamente em comparação com as informações armazenadas na etiqueta de código de barras controle do grânulo e um passe ou notificação de falha, bem como informações de amostra são mostradas na tela do sistema DLS no final do teste.

2. a obtenção de uma amostra de um concentrado de plaquetas

Nota: Estes passos descrevem o processo de amostragem não-invasivo da transfusão de plaquetas para o DLS teste capilar para gerenciamento de estoque de plaquetas de rotina. Uma visão geral é mostrada na Figura 1. Necessário Acessórios: tubo aferidor, stripper de tubo manual, tesoura e protetor do respingo.

1. Remova o concentrado de plaquetas de inventário não testado.
2. Obter a amostra do produto de plaquetas ou de uma bolsa de amostragem não utilizados (avance para o passo 2.3) ou um segmento de tubo (vá para a etapa 2.4 se vazio ou passo 2.5 se não vazio).
   Para desconectar a bolsa tubo ou tubagem segmento use um aferidor do tubo. Para operar o aferidor do tubo, siga as instruções do fabricante. Brevemente, fixe o tubo para ser selado em uma posição exata entre duas mandíbulas aquecidas. Em um dispositivo portátil, pressione o tubo fundido juntos e cool sob alta pressão enquanto pressiona a alavanca (a duração é indicada pela luz verde) resultando em um selo permanente, à prova de vazamentos.
3. Amostragem de uma mala
   1. Misturar o conteúdo do saco plaquetas bem suave movimento horizontal para 5 s (derrubada de ponta a ponta cinco vezes).
   2. Abra a pinça para a bolsa. A bolsa é evacuada e vai encher-se por si só. Não é necessário encher a bolsa completamente como apenas 100 µ l da amostra será necessária para o teste de DLS.
   3. Desconecte o malote do saco de tubulação de calor-selagem a conexão com um aferidor do tubo. Continue com o passo 3.
4. Amostragem de tubo vazio
   1. Verificar que as plaquetas do saco foi armazenado tubo vazio e o bloco de tubulação é ainda no lugar. Inspecione visualmente a tubulação para verificar que não há uma quantidade significativa de concentrado de plaquetas na tubulação. Se o tubo não está vazio continue com etapa 2.5.
   2. Feche a stripper do tubo do tubo como perto do bloco de tubulação possível comprimindo as alças para apertar o tubo entre os rolos.
   3. Pendure o saco verticalmente e manter comprimindo as alças de stripper.
   4. Enquanto mantendo a stripper fechada, libere o bloco de tubulação.
   5. Puxe lentamente o stripper para baixo o tubo vazio, permitindo ao tubo para encher-se lentamente para trás a stripper. Continue até a seção abaixo a stripper tem inflado totalmente ou até a stripper é dentro de 1 polegada da extremidade do tubo.
   6. Uma vez atingido o ponto de parada com o stripper, uso o aferidor do tubo de calor selar o tubo de 1 polegada acima da stripper.
   7. Libere as alças do stripper tubo manual.
   8. Calor selar novamente 1 a 2 polegadas acima do selo anterior para criar o segmento de teste.
   9. Corte o segmento de teste da unidade de plaquetas. Este segmento será usado para testes de DLS.
5. Amostragem da tubulação que não está vazia
   1. Pendure o saco verticalmente e liberar o bloco de tubulação em caso de lugar.
   2. Inspecione visualmente a tubagem para determinar se há qualquer significativos aglomerados sólidos. Se existem grupos sólidos, selo acima deles tal que eles não podem ser desmontados em saco.
   3. Feche a stripper do tubo do tubo como perto da extremidade selada da tubulação quanto possível.
   4. Tira o conteúdo do tubo dentro do saco, comprimindo as alças para apertar o tubo entre os rolos e, mantendo a força de aperto, avançar a stripper de tubo ao longo da tubulação para o saco.
   5. Retire o saco de plaquetas o gancho de suspensão e misture suavemente o saco para 5 s incliná-lo de ponta a ponta cinco vezes, mantendo a stripper fechado.
   6. Pendure o saco verticalmente, mantendo fechado o stripper.
   7. Puxe lentamente o stripper para baixo o tubo vazio, permitindo ao tubo para encher-se lentamente para trás a stripper. Continue até a seção abaixo a stripper tem inflado totalmente ou até a stripper é dentro de 1 polegada da extremidade do tubo.
   8. Uma vez atingido o ponto de parada com o stripper, uso o aferidor do tubo de calor selar o tubo de 1 polegada acima da stripper.
   9. Lançamento do stripper.
   10. Calor selar novamente 1 a 2 polegadas acima do selo anterior para criar o segmento de teste.
   11. Corte e elimine a última porção do tubo.
   12. Corte o segmento de teste da unidade de plaquetas. Este segmento será usado para testes de DLS.

3. encher a amostra para o DLS teste capilar

1. Usando um protetor do respingo e tesoura limpa, seca, corte uma extremidade da bolsa tubulação ou segmento de teste.
   Nota: O capilar usado para testes de DLS deve ser preenchido imediatamente.
2. Preencha o capilar usando a ferramenta de amostragem (pipetas de volume fixo montado µ l 100, ponta da pipeta e capilar) para retirar a amostra diretamente a bolsa aberta ou segmento de tubulação em capilar.
3. Sele o fundo do capilar enchido empurrando suavemente o capilar preenchido para o vedador de tubo capilar, aplicando um toque suave e um pouco de pressão contra a bandeja.
4. Desconecte a 100 µ l pipetas de volume e ponta do capilar, garantindo o capilar permanece fixo firmemente inserida no vedador de tubo capilar.
5. Remova a bandeja de vedador de tubo capilar capilar, limpe com uma compressa embebida em álcool isopropílico e certifique-se de que não há bolhas de ar são presos por agredir suavemente a parte inferior do capilar.
6. Lugar do capilar para o sistema DLS.

4. realizar o teste DLS

1. Selecione a opção de teste de MP para iniciar um novo teste DLS para medir o teor de micropartículas de uma amostra de plaquetas.
2. Insira as informações da amostra (número de identificação da doação (ISBT), data de coleta/produção de expiração e código de produto) usando o scanner de código de barras ou manualmente.
3. Se nenhum código de produto está disponível, do qual o sistema DLS pode extrair as informações de meio fluidas, selecione o meio fluido apropriado manualmente (para a maioria das plaquetas concentrados selecione plasma mas para amostras contendo solução de aditivo de plaquetas (PAS), insira o percentagem de plasma residual).
   Nota: Um pequeno desvio no percentual PAS do nominal 65% fará com que um pequeno erro na viscosidade (calculada automaticamente pelo sistema DLS) que afecta minimamente o raio calculado de MP mas não % MP.
4. Coloque o capilar no sistema DLS quando instruído e iniciar o teste.
5. Quando o teste estiver concluído, remova a amostra do titular capilar e dispose dos consumíveis apropriadamente de acordo com as orientações de instalação. Retire a amostra do titular capilar e elimine os consumíveis apropriadamente de acordo com as orientações de instalação.
6. Tag-a bolsa de plaquetas com a cor correspondente ao resultado, por exemplo laranja para não está ativado (homogênea) com % MP igual ou abaixo de 15% e de cor rosa para ativado (heterogêneo) com % MP acima de 15%.

Figura 1 : Visão geral do método. Visão geral das etapas a serem executadas para a gestão de inventário de plaquetas de rotina em um banco de sangue do hospital: obtenção de uma amostra de uma plaqueta concentrado, carregando a amostra no capilar para medição de DLS, realizando o DLS teste para identificar micropartículas e usando a conteúdo de micropartículas relatada identificar ativado as plaquetas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Tempo médio de preparação
A plaqueta de rastreio de processo usando um sistema DLS está resumida na Figura 1. As plaquetas são testadas com o sistema DLS aquando da recepção ao fornecedor do sangue. Conforme detalhado na tabela 1 , o tempo médio de preparação para os usuários treinados é 2 min 23 s enquanto a limpar e tempos de trabalho pós-teste são 14 s e 46 s, respectivamente. No total, o usuário médio leva 3 min e 23 s de hands-on tempo por teste.

Atividade	Tempo ativo	Tempo de teste de caminhada de distância	TOTAL
Preparar o sistema DLS	14 s
Montar a ferramenta de amostragem	28 s
Obter o segmento	52 s
Preenchimento capilar e iniciar teste	49 s
		5 min
Limpar	14 s
Bolsa de plaquetas tag e inventário	46 s
Tempo total necessário por amostra	3 min 23 s	5 min	8 min 23 s

Tabela 1: esgotamento de tempo ativo teste. O teste em si é um teste de caminhada de longe com uma duração média de 5 min. O usuário médio leva 3 min 23 s para preparar o sistema DLS para um teste, obter uma amostra a seguir este protocolo de teste e marca o saco de plaquetas.

Precisão
A precisão do sistema DLS foi avaliada em três níveis de micropartículas, 0-7%, 12-25% e 28-75%. A gama clinicamente relevante de % MP é 3-75%. Dois operadores testaram amostras de controlo de baixa, média e alta para 16 dias de operação em dois sistemas DLS em paralelo. Amostras foram testadas em duplicado, mas em ordem aleatória em cada dia de teste.

A tabela 2 resume a precisão dentro-dispositivo de medição DLS por micropartículas de por cento (% MP) em relação as plaquetas.

	Conteúdo de micropartículas
	Baixa	Médio	Alta
Quer dizer % MP (%)	4.4	19,5	53.8
Desvio padrão (%)	1.8	2.6	5.8
CV (%)	40,4	13.2	10.6

Tabela 2: precisão dentro-dispositivo de micropartículas de por cento (% MP). Em micropartículas de muito baixo conteúdo pequenas plaquetas podem contribuir para % MP resultando em aumento variabilidade para amostras de micropartículas de baixo conteúdo.

A tabela 3 mostra a precisão dentro-dispositivo de medição DLS para raio de micropartículas média entre 50-550 nm.

	Conteúdo de micropartículas
	Baixa	Médio	Alta
Quer dizer raio (nm)	331	161	188
Desvio padrão (mm)	133	41	25
CV (%)	40,1	25.2	13.5

Tabela 3: precisão dentro-dispositivo de raio microparticulado. Em micropartículas de muito baixa conteúdas plaquetas pequenas podem contribuir para micropartículas por cento (% MP) resultando em aumento da variabilidade para baixo microparticulado amostras de conteúdo.

A tabela 4 mostra a reprodutibilidade das medições de DLS por micropartículas de por cento (% MP).

	Conteúdo de micropartículas
	Baixa	Médio	Alta
Quer dizer % MP (%)	4.4	29,2	53,6
Reprodutibilidade (%)	1.5	2.3	5
CV (%)	35	11,8	9.4

Tabela 4: Reprodutibilidade das medições de espalhamento de luz dinâmica (DLS) de micropartículas de por cento (% MP).

Linearidade
A Figura 2 mostra que resultados DLS são lineares, ou seja, caber uma linha reta em relação as valores atribuídos das amostras. Sete amostras foram preparadas com diferentes conteúdos de micropartículas. Amostras com alta (MP₇) e baixo teor de micropartículas (MP₁) e a correspondente concentração de plaquetas foram elaboradas e misturadas em proporções diferentes para criar amostras intermediárias (MP_x). As amostras foram testadas com citometria de fluxo, conforme descrito anteriormente,¹⁹ e DLS e % MP resultados para cada concentração foram plotados como entrada e saída. O coeficiente de determinação foi encontrado para ser 0.985. Exemplos de histogramas DLS para conteúdo de micropartículas de baixa e alta são mostrados na Figura 3. Os resultados DLS foram confirmados por citometria de fluxo (Figura 3B).

Figura 2 : Comparação de citometria de fluxo e resultados DLS. Relação linear entre % MP determinada pela citometria de fluxo (entrada) e DLS (saída), os dados originais de DLS de duas amostras marcados por ○ o símbolo abertos são mostrados na Figura 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Conteúdo de micropartículas para diferenciar entre as plaquetas ativadas e não está ativado. (A) DLS resultados de conteúdo do MP em plaquetas ativadas (linha tracejada) foi de 57% contra 4% em plaquetas não está ativado (linha contínua). Testes foram realizados à temperatura de 37 ° C, medida ajuste de viscosidade do plasma de 1,06 x10^-3 pa · s e configurações de intensidade total entre 200-600 kHz. (B) fluxo cytometry resultados (conforme descrito anteriormente¹⁹) das mesmas amostras como mostrado em (A); os histogramas de dispersão para a frente, P1 e P2 representam os portões MP e plaquetas, respectivamente; para as plaquetas ativadas (esquerda) 76% dos eventos caiu o portão MP em comparação com 6% de plaquetas não está ativado (à direita). A linha de regressão linear sugere uma constante contribuição relativa de ruído de fundo para % MP por citometria de fluxo, conduzindo aos resultados consistentemente mais elevados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Especificidade/interferência
Organização internacional para Padronização (ISO) define a especificidade analítica como a capacidade de um procedimento de medição para detectar ou medir apenas o mensurando, embora existam outras quantidades presentes na amostra. A especificidade analítica do rastreio de micropartículas pode ser afetada por glóbulos vermelhos (RBC). DLS mede o conteúdo de MP em relação ao conteúdo de plaquetas. RBC pode interferir porque a contribuição do espalhamento da RBC está incluída na contribuição da dispersão de plaquetas, reduzindo a contribuição relativa do MP. Existem limites regulamentares para o teor de RBC admissível em produtos derivados de sangue; uma conversão conservador do limiar recomendada pela AABB de concentração permitida de RBC em concentrados de plaquetas-2ml de embalado RBC em uma unidade de plaquetas-resultou em 8.0 x10¹⁰ células/L (pressupostos: RBC volume é 8,5 x10^-14L, hematócrito de RBC embalado é de 68%, volume de unidade de plaquetas é de 200 mL). As concentrações de RBC residuais relatadas em diferentes produtos estão bem abaixo deste limiar⁴⁶.

Três diferentes doadores doaram plaquetas e glóbulos vermelhos (RBC) em dois dias diferentes, como elegíveis, para três experimentos independentes. O conteúdo inicial de RBC nos concentrados de plaquetas (amostra de referência) foi de 0,05 - 0,15 x10⁹ células/L conforme determinado com um hemocytometer. Cinco amostras adicionais foram criadas por cravação-no conhecido quantidades de RBC em alíquotas do concentrado de plaquetas; níveis-alvo RBC nestas amostras foram 1.0, 5.0, 10, 40 e 80 x10⁹ células/L.

O limiar de interferência das células vermelhas do sangue era aproximadamente 1.0 x10¹⁰ células/L (Figura 4), que também correlacionado com o nível no qual a presença de células vermelhas do sangue foi visualmente evidente (Figura 5). Acima desse nível, % MP foi subestimado que significa que visualmente vermelho amostras que contêm RBC, ao invés de micropartículas relatado hemoglobina, o conteúdo será muito baixo.

Figura 4 : Relação linear entre concentração RBC (células/L) e % MP (DLS). RBC concentrações crescentes de 0.1 x10⁹, 1.0 x10⁹, 5.0 x10⁹, 1.0 x10¹⁰, 4.0 x10¹⁰e 8.0 x10¹⁰ células/L (da esquerda para a direita) de 3 experimentos independentes (○ experimento 1, ● experimento 2, experimento □ 3, linhas de regressão linear são exibidas para cada experimento). Acima de 1.0 x10¹⁰ RBC/L leva à subestimação da % MP. A aparência visual das amostras contendo RBC é mostrada na Figura 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Aparência visual do RBC contendo amostras. Vermelhidão de plaquetas amostras contendo concentrações de RBC de 0.1 x10⁹, 1.0 x10⁹, 5.0 x10⁹, 1.0 x10¹⁰, 4.0 x10¹⁰e 8.0 x10¹⁰ células/L, da esquerda para a direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Precisão
Precisão é definida como a diferença entre um resultado de medição e um valor de verdadeiro quantidade atribuída para a amostra. Este erro de medição inclui um componente sistemático estimado pelo viés de medição e um componente aleatório estimados por um desvio-padrão. Assim, a precisão de um resultado de medição é uma combinação de precisão e veracidade.

Um grânulo padrão foi usado para determinar a precisão do teste de DLS. Precisão foi avaliada em duas concentrações clinicamente relevantes ao alcance do ensaio de MP 3-75%. Misturas de grânulo de referência foram usadas para preparar amostras de concentrações conhecidas porque referência grânulos têm um tamanho conhecido e concentração. Por conseguinte, grânulos de referência podem ser misturados para obter amostras com tamanhos de partícula desejado e concentrações.

Esferas de poliestireno padrão com um raio de 125 nm foram usadas para representar micropartículas e grânulos com raio de 1,5 µm foram usados para representar as plaquetas. A precisão do ensaio microparticulado foi avaliada com misturas de grânulo de aproximadamente 20% e 50% de conteúdo MP. A precisão dos raios de partículas medido foi comparada com os raios de partículas documentados sobre os certificados de análise para os grânulos de referência, conforme mostrado na tabela 5.

	grânulos de 125 nm			1,5 µm de grânulos
	Certificado de análise			Certificado de análise
		MP 20%	MP DE 50%		MP 20%	MP DE 50%
Quer dizer raio	122,0	113.8	124,4	1.5	1.6	1,60
STD Dev	4.5	2.83	3.6	0,035	0,06	0.07
CV	3,60%	2,48%	2,89%	2,20%	3,74%	4,05%
Precisão		6,70%	2,00%		6,50%	6,30%

Tabela 5: precisão das medições de espalhamento de luz dinâmica (DLS). Comparação de tamanho para DLS resultados contra certificado de análise para grânulos com 125 nm raio e raio 1,5 µm em misturas.

Discussão

Este protocolo descreve um método de difusão dinâmica da luz para rastreio de micropartículas otimizado para as concentrações de partículas de alta encontradas em amostras biológicas, tais como concentrados de plaquetas. O método de DLS é inerentemente padronizado para medir com precisão o tamanho. A concentração relativa de micropartículas pode ser convertida em uma concentração absoluta, se a concentração de plaquetas é conhecida e a área do pico de plaquetas é usada como a referência pico¹⁹. Como plaquetas concentrações geralmente são obtidas com analisadores de hematologia ou citômetros esses métodos podem ser considerados tecnologias de companheiro de DLS.

A funcionalidade do sistema DLS é segurada pela execução controle contas regularmente. Água destilada pode ser medida para verificar se o ruído de fundo é mínimo. Padrões de plaquetas comercialmente disponíveis podem ser analisados como controles de MP-negativo e, após a adição de 125 nm raio os grânulos, como controles de MP-positivo. Dentro as concentrações de variedade biológica de MP de interesse, os procedimentos são práticos e rápidos de executar como parte do banco de sangue de rotina.

Em oposição a citometria de fluxo, este método não é baseado em comparar as intensidades de dispersão de partículas, mas prefiro a velocidade de seu movimento browniano. Assim, exosomes também podem ser detectadas, apesar de seu tamanho pequeno e são relatados separadamente do MP.

Projetado como uma ferramenta de triagem, as limitações deste método estão relacionadas com a incapacidade de diferenciar entre diferentes tipos de micropartículas. Há espaço potencial para melhoria se etapas adicionais de isolamento são utilizadas; as amostras podem ser testadas antes e após a remoção específica de micropartículas através de anticorpos acoplados a captação magnética do grânulo. Além disso, ele não pode ser considerado que todas detectadas micropartículas são células derivadas porque quilomícrons formadas em hiperlipidemia^47,48 e pequenas bactérias ou vírus⁶ também serão relatados na faixa de micropartículas. No entanto, outras garantias existem dentro do fornecimento de sangue para evitar altamente lipêmicas ou contaminadas plaquetas para entrar no inventário de banco de sangue do hospital.

A escolha do anticoagulante na amostra afeta o grau de Ativação plaquetária e, portanto, o conteúdo do MP⁴⁹. Para comparações de produtos diferentes, este fator precisa ser considerado. Além disso, a troca de plasma com mídia de suspensão grátis MP como PAS afetará o conteúdo da MP e o limiar para determinar a heterogeneidade-se apenas cerca de um terço do conteúdo original MP é deixado dentro do plasma residual no concentrado um Nesse sentido, limiar inferior de conteúdo MP indicará o mesmo nível de Ativação plaquetária como no plasma 100%. MP por cento é o conteúdo do MP em relação as plaquetas. Anteriormente foi noticiado que a contagem de plaquetas média do produto PAS foi menor que a média % MP ainda foi de 9,5%¹⁹. O limite de % MP para plaquetas PAS licenciado nos Estados Unidos está definido para 10%.

Enquanto a fonte primária do MP em concentrados de plaquetas é o doador, processos que causam stress de plaquetas aumentará o nível de MP dependendo da susceptibilidade das plaquetas de salientar-se as plaquetas são já altamente ativadas, menor estressores, tais como estendido o prazo de validade, inativação do agente patogénico, lavagem, irradiação ou transporte de longa distância pode levar a aumento significativo no conteúdo da MP. Nenhum desses estressores foram mostrados para afetar significativamente homogêneo, não está ativado plaquetas¹⁹. Além disso, atenção deve ser pago para a possibilidade de alterações na composição da amostra dentro do capilar se não testada imediatamente após o preparo (conclusão da etapa 3 deste protocolo).

O foco do presente protocolo é na determinação da composição de partículas presentes em transfusões de plaquetas e usar micropartículas como biomarcadores de Ativação plaquetária. As transfusões de plaquetas são marcadas como também não está ativado (laranja) ou ativadas (rosa) com base em um limite de porcentagem de micropartículas de 15%. O limite de 15% MP para plaquetas no plasma 100% foi determinada empiricamente como o percentil de^th média 66 de diversos sites.

O objectivo da gestão de inventário de plaquetas com base na rotineiro microparticulado triagem com DLS é melhorar eficiências de custo pacientes de cuidados e de carro, impedindo a refratariedade plaquetária não imune. A implementação do sistema de triagem de bolsas de plaquetas DLS permitirá que o usuário direcionar as plaquetas não está ativado para populações de pacientes mais em risco para o desenvolvimento de refratariedade plaquetária.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ThromboLUX-M	LightIntegra Technology Inc.	LPN120	DLS System
ThromboSight Software	LightIntegra Technology Inc.	LPN124	DLS analysis software
Capillaries	LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE)	LPN065	Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated
MiniPet	LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific)	LPN082	100 µL fixed volume pipette for sampling
MicroFlex 1-200 µL Pipette tips	LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific)	LPN080	Pipette tips for sampling
Critoseal	LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific)	LPN075	Capillary Tube Sealant
Dukal Alcohol Pad or equivalent	LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.)	LPN085	Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol)
Control beads, 50 nm radius	LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.)	LPN128	Control beads
Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µm	PolySciences Inc.	64060	Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm	PolySciences Inc.	64014-15	Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 - 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Genesis BPS RapidSeal II or equivalent	Genesis BPS	428-SE640	Tube sealer
Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent	Fresenius Kabi	6R4452	Manual tube stripper
Biohazard Shield - Cell Counter or equivalent	CardinalHealth	S1389-75	Splash Shield
Corning LSE Vortex Mixer or equivalent	Corning Incorporated	6775	Vortex mixer
FACSCanto II Flow cytometer  with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent	BD Biosciences	338960	Flow cytometer