Um rápido prata coloração protocolo permitindo simples e eficiente deteção de SSR marcadores usando um Gel de Polyacrylamide Non-desnaturação

Resumo

Aqui, nós relatamos uma prata simples e de baixo custo que mancha o protocolo que requer apenas três reagentes e 7 min de processamento e é apropriado para a geração rápida de dados do SSR de alta qualidade em análise genética.

Resumo

Repita sequência simples (SSR) é um dos marcadores mais eficazes utilizados na pesquisa genética vegetal e animal e programas de reprodução molecular. Coloração de prata é um método amplamente usado para a detecção de marcadores SSR em gel de poliacrilamida. No entanto, os protocolos convencionais para coloração de prata são tecnicamente exigente e demorado. Como muitos outro laboratório biológico técnicas, prata, protocolos de coloração foram constantemente otimizadas para melhorar a eficiência da deteção. Aqui, nós relatamos um método que reduz custos de reagente e aprimora a clareza de resolução e imagens de deteção de coloração de prata simplificada. O novo método requer duas etapas principais (impregnação e desenvolvimento) e três reagentes (formol, hidróxido de sódio e nitrato de prata) e apenas 7 minutos de processamento para um gel de poliacrilamida não-desnaturação. Comparado com protocolos relatados anteriormente, este novo método é mais fácil, mais rápido e usa menos reagentes químicos para a deteção de SSR. Portanto, esta prata simples, barata e eficaz que mancha o protocolo beneficiará mapeamento genético e reprodução assistida por marcador, por uma geração rápida de dados marcador SSR.

Introdução

O desenvolvimento de marcadores baseados em PCR revolucionou a ciência da genética vegetal e de reprodução¹. Sequência simples repetição (SSR) marcadores são entre os marcadores de DNA mais usados e mais versátil. Sua cobertura ampla do genoma, abundância, especificidade do genoma e repetibilidade são alguns dos méritos de marcadores SSR, além de sua herança codominant para a detecção de genótipos homozigóticos². Vários estudos utilizaram marcadores SSR para investigar a diversidade genética, rastrear ascendência, construir mapas genéticos de ligação e mapear os genes para características economicamente importantes,^3,4.

Produtos PCR dos marcadores SSR comumente são separados usando electroforese de agarose ou gel de poliacrilamida e depois visualizadas com coloração de prata ou sob luz UV, após coloração com brometo de etídio. Coloração prata de fragmentos de DNA em gel de poliacrilamida é mais sensível do que a outra coloração métodos^5,6 e tem sido amplamente utilizada para detectar os fragmentos do ADN como marcadores SSR⁷.

Como muitas técnicas de laboratório biológico, prata coloração dos géis de poliacrilamida constantemente melhorou desde o seu primeiro sendo relatado como uma técnica de visualização do fragmento em 1979⁸. A técnica foi modificada inicialmente para a deteção de fragmentos de DNA por Bassam et al ⁶ em 1991 e depois aperfeiçoado por Sanguinetti e colegas de trabalho⁹ em 1994. O método foi otimizado ainda mais no passado poucas décadas^{6,7,9,10,11,12,13,14 , 15}. no entanto, a maioria dessas versões atualizadas dos protocolos ainda tem alguns inconvenientes como alta demanda técnica e longo tempo para fixação de processamento e montagem de⁶, que limitam a aplicação destes protocolos^{7, 11}. Um protocolo ideal que combina baixo custo com alta eficácia da detecção de fragmento de DNA é urgentemente necessária para aplicação rotineira de prata coloração em pesquisas biológicas.

Além disso, gel de poliacrilamida podem ser dividido em gel de poliacrilamida desnaturação e não-desnaturação, e ambos podem ser usados para a detecção de marcadores SSR, usando o método de coloração de prata. O efeito e a resolução dos quais não diferem significativamente, mas não-desnaturação géis de poliacrilamida são mais fáceis de processo e tomar menos tempo¹⁶.

Com base na pesquisa anterior¹⁵, do atual estudo tem como objetivo descrever uma otimizado prata que mancha o protocolo em detalhe para a deteção rápida, fácil e baixo custo de marcadores SSR em gel de poliacrilamida não-desnaturação.

Protocolo

1. preparação de produtos PCR dos marcadores SSR

1. Preparem-se todos os produtos químicos e reagentes para reações de PCR incluindo modelo DNA (30 ng / µ l), 2 × mistura mestre de PCR (contendo 2 × tampão PCR, 0,4 mM de cada dNTP, 3 mM de MgCl₂, 0,1 U / µ l de Taq DNA polimerase e corantes), 10 µ m de cada um para a frente e reverter as primeiras demão e água destilada ou desionizada (dH₂O).
   Nota: Os marcadores SSR, usados no presente estudo foram PT51333 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' e a sequência inversa da primeira demão: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') e PT50903 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' e inverter a sequência da primeira demão: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') para o tabaco e CX-43 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' e inverter a sequência da primeira demão: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') e CX-157 (encaminhar a sequência da primeira demão: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' e inverter a sequência da primeira demão: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') de repolho chinês de florescência.
2. Prepare-se 10 µ l de mistura PCR para amplificação adicionando 2 µ l do modelo de DNA, 5 µ l de 2 × mistura mestre de PCR, 0,2 µ l de cada primer para diante e reverso da primeira demão e 2,6 µ l de dH₂O.
3. Realizar a reação de amplificação do PCR em um thermocycler com uma etapa inicial de 94 ° C por 5 min, siga por 38 ciclos de 45 s a 94 ° C para desnaturação, 45 s a 55 ° C para recozimento da primeira demão e 1 min a 72 ° C para a extensão e uma etapa da extensão final de 10 min 72 ° C; em seguida, armazene os produtos de PCR a 4 ° C para uso posterior.

2. preparação de soluções de Polyacrylamide gel de fundição

1. Preparar 1 L de amortecedor de TBE 5 × 54g de Tris base e ácido bórico 27,5 g dH₂O de dissolução, adicionando 20 mL de EDTA 0,5 M (pH 8.0) e ajustar a solução para um volume final de 1 000 mL com dH₂O.
   Nota: Amortecedor de TBE pode ser armazenado em temperatura ambiente por meses.
2. Prepare 2 L de amortecedor de TBE 0,5 × adicionando-se 200 mL de amortecedor de TBE × 5 para dH₂O até um volume final de 2 L e armazenar à temperatura ambiente.
3. Preparar uma solução de gel de poliacrilamida 6% não-desnaturação dissolver 29 g de biologia molecular grau acrilamida e 1g de biologia molecular grau N, N'-methylenebisacrylamide no amortecedor de TBE 0,5 × até um volume final de 500 mL. Cobrir o frasco de solução com folha de alumínio e loja a 4 ° C para uso posterior.
   Cuidado: Acrilamida é considerada uma potente neurotoxina e deve ser manipulada com cuidado. Use sempre luvas quando pesando pó e manipulação de soluções que contêm-lo.
4. Prepare uma solução de (APS) de persulfato de amónio 20% pela dissolução de 2 g de APS com dH₂O até um volume final de 10 mL. Pode ser armazenado a-20 ° C durante meses.
   Nota: Para sua conveniência, 10 mL da solução APS 20% pode ser aliquotada em 1,5 mL ou 2 mL de tubos de centrífuga de armazenamento-20 ° c. Descongelar e misture bem antes de usar.
5. Prepare uma solução diluída vincular-silano dissolvendo 3 µ l de vincular-silano em 0,997 mL de etanol a 95% contendo 0,5% de ácido acético. Pode ser armazenado a 4 ° C durante semanas.
   Cuidado: Bind-silano é tóxica, use luvas quando manusear a solução e manter o quarto ventilado.

3. preparação de géis de poliacrilamida para eletroforese

1. Lavagem de um conjunto de placas de vidro e espaçadores com detergente em água da torneira, seguida por uma lavagem completa com dH₂O. ar seco as placas por configuração-los em um prato de cavalete.
2. Disperse a 1 mL de solução de vincular-silano na superfície interna de uma placa de vidro retangular e seca por 5 min.
   Nota: Se a solução vincular-silane não é espalhada uniformemente sobre a superfície da placa, o gel pode ser destacado durante coloração e resultar em um efeito de coloração satisfatório.
3. Dispersar a 1 mL de repelir-silano na superfície interna de uma placa de vidro entalhado com um cotonete, limpe o excesso de repelir-silano com papel absorvente e ar seco por 5 min.
   Nota: Se o repel-silane não revestir a superfície da placa de vidro uniformemente, pode danificar o gel parcialmente descascando.
4. Montar as placas de vidro com espaçadores com a placa entalhada no topo e prenda os dois lados da assembleia com braçadeiras de fundição.
5. Despeje a quantidade adequada (40 mL) de solução de gel de poliacrilamida 6% não-desnaturação para um copo para o conjunto de placa de largura de 33 cm × 10 cm de altura e espaçador espessura de 1,5 mm, adicionar 20 µ l de tempted (TEMED) e 200 µLfresh 20% APS e misture delicadamente.
   Nota: A quantidade adequada (40 mL) de solução de gel foi calculada a partir do volume interno das duas placas com espessura de espaçadores (30 cm x 8,5 cm × 0.15 cm). Quanto a quantidade de TEMED e APS para a polimerização do gel, há uma relação padrão de solução de gel TEMED e APS, com base na referência¹⁷. A solução de gel descrita acima é armazenada em 4° C. Se a solução de gel é armazenada à temperatura ambiente, 20 µ l de TEMED e 100 µ l de 20% a APS deve ser usado. Misture delicadamente a mistura de solução de gel com uma vara de vidro para evitar bolhas de ar na solução.
6. Despeje a solução imediatamente e cuidadosamente para as placas de vidro montado ao longo da borda da placa entalhada, preencher o espaço quase ao topo e inserir o pente. Adicione um pequeno volume de solução de gel sobre o pente.
   Nota: Mantenha as placas de vidro horizontal para evitar que o gel vazando. Remova quaisquer bolhas com um gancho de bolha, se necessário.
7. Permitir que o gel definir por 30 min à temperatura ambiente.
   Nota: O tempo de polimerização pode mudar com temperaturas de solução de gel e ambiente.
8. Depois que o gel é totalmente polimerização, remova os grampos de fundição e posicione a placa de conjunto da unidade do tanque de eletroforese com a placa entalhada virada para o reservatório superior amortecedor, e uso de grampos grandes para anexar a placa definida como a unidade do tanque.
9. Despeje 1 litro de amortecedor de TBE 0,5 × em cada um da parte superior e as câmaras inferiores. Retirar o pente e lave todos os poços completamente com buffer usando uma pipeta ou seringa.
   Nota: Certifique-se que o sanduíche de gel na parte inferior da placa é completamente embebido na reserva sem quaisquer bolhas.

4. correr géis

1. Carrega cerca de 1 µ l de produto PCR em cada poço do gel de polyacrylamide. Carrega uma escada de tamanho de DNA de ambos os lados do gel juntamente com amostras de produtos PCR. Fixe a tampa de segurança para a câmara superior do amortecedor.
2. Ligar os fios à fonte de alimentação, combinando o código de cores para vermelho e preto para preto. Funcione o gel em uma constante tensão de 110 V, até que a tintura atinja uma posição definida, normalmente para ~ 70 min.
   Nota: O tempo de tensão e funcionando pode ser ajustado de acordo com o tamanho dos produtos do PCR.

5. prata coloração para a detecção de marcadores SSR em um não-Gel de poliacrilamida

1. Após a electroforese, drene o buffer da câmara superior em um copo grande através da válvula. Separar as pinças de lado, retirar as placas do aparelho, cuidadosamente separe a placa de vidro entalhado ao longo de um lado com uma espátula e certifique-se que o gel que permanece ligado à placa de vidro revestido com ligação silano.
2. Fazer 1 L de solução de impregnação fresco dissolvendo-se 1,5 g de AgNO₃ em 1 L de dH₂O. preparar 1 L de solução de desenvolvimento fresco pela dissolução de 10 g de NaOH em 900 mL de dH₂O, adicione 1 mL de formol 37% e ajustar até um volume final de 1 L com dH₂O.
   Nota: Usar luvas e lidar com os produtos químicos acima e soluções com cuidado. Não é necessário manter as soluções e as etapas correspondentes com as soluções no escuro.
3. Lave cuidadosamente a placa de gel e vidro com amplo dH₂O para remover o tampão de eletroforese, em seguida, coloque a placa com o gel virado para cima em uma bandeja de plástico e mergulhe o gel em 1 L de solução de impregnação. Coloque a bandeja em uma coqueteleira.
4. Agite a bandeja no 60 r/min. para 3-4 min.
   Nota: Apertar o tempo pode ser ajustado de acordo com a espessura do gel e a concentração de nitrato de prata na solução de impregnação.
5. Mova a placa fora da solução de impregnação e colocá-lo em outra bandeja. Enxágue a solução de impregnação residual fora da superfície da placa e o gel usando amplo dH₂O dobro para 3-5 s cada.
6. Coloque a placa com o gel para cima, em outra bandeja, mergulhe a placa em 1 L de solução de desenvolvimento, então agite a bandeja em 50 r/min ~ 3 min.. Monitor a aparência do DNA fragmentos e parar o desenvolvimento quando o rácio mais elevado do sinal do DNA de fragmentos para o ruído de fundo é observado (esta etapa leva ~ 3 min).
7. Lave a placa e o gel com amplo dH₂O duas vezes e secar a placa de gel com um papel absorvente.
8. Digitalize o gel usando um scanner apropriado. Uma resolução de 300 dpi dá uma clara visualização dos fragmentos de DNA. O gel também pode ser fotografado usando uma câmera.
9. O padrão de bandas de marcadores SSR pode ser marcou com base nos fragmentos de DNA na imagem.

Resultados

Os PCR amplicons foram produzidos usando os pares de cartilha SSR correspondentes em repolho chinês de florescência e tabaco. Após a eletroforese, o gel de poliacrilamida foram corado usando a prata acima que mancha o protocolo, que inequivocamente detectado os padrões de bandas de marcadores SSR (Figura 1).

Para comparar a eficiência de deteção de prata diferente protocolos de coloração, p...

Discussão

A lavagem do gel após a impregnação é uma etapa crítica. Volume de tempo e água de lavagem insuficiente pode causar a remoção incompleta de solução de impregnação na superfície da placa e o gel e resultar em um fundo escuro. O tempo de desenvolvimento adequado é mais um passo chave, desenvolvimento excessivo pode resultar em um fundo marrom escuro com imagem de baixo contraste de fragmentos de DNA. Além disso, a etapa de impregnação afeta significativamente coloração eficiência de fragmentos de DNA. A...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR master mix (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 DNA marker	Takara Bio Inc., Japan	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, China	#77-86-1
Boric acid	Sangon Biotech Shanghai, China	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#6381-92-6
Acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Ammonium persulfate	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7727-54-0
Bind-silane	Solarbio Beijing, China	#B8150
AgNO3	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#7761-88-8
Formaldehyde	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#50-00-0
NaOH	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#1310-73-2
Acetic acid	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#497-19-8
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-17-5
HNO3	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#1787-61-7
Plastic tray	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China	-
TS-1 Shaker	Qilinbeter JiangSu, China	-
BenQ M800 Scanner	BenQ, China	-
DYY-6C Power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	-
High throughout vertical gel systems, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China	-