Mediada por CRISPR perda de função de análise no grânulo cerebelar células usando no Utero Electroporation Gene transferência baseada

Resumo

Estudos convencionais de perda-de-função de genes usando animais nocaute foram frequentemente dispendioso e demorado. Baseado em Electroporation mutagênese mediada por CRISPR somática é uma ferramenta poderosa entender gene funciona em vivo. Aqui, nós relatamos um método para analisar os fenótipos de nocaute nas células em proliferação do cerebelo.

Resumo

Malformação do cérebro é frequentemente causada por mutações genéticas. Decifrar as mutações nos tecidos derivados de paciente identificou potenciais fatores causais das doenças. Para validar a contribuição de uma disfunção dos genes mutantes para o desenvolvimento da doença, a geração de modelos animais carregando as mutações é uma abordagem óbvia. Enquanto germline geneticamente modelos do rato (GEMMs) são populares ferramentas biológicas e apresentam resultados reprodutíveis, é restrito pelo tempo e custos. Entretanto, GEMMs não-germline frequentemente permitem explorar função do gene de uma forma mais viável. Desde o cérebro algumas doenças (por exemplo, tumores cerebrais) aparecem como resultado de somático mas não germline mutações, modelos de não-germline quimérico do rato, em que coexistem células normais e anormais, podem ser útil para análise de doenças relevantes. Neste estudo, nós relatamos um método para a indução de mutações somáticas CRISPR-mediada no cerebelo. Especificamente, utilizamos o condicionais bater-em camundongos, no qual Cas9 e GFP são cronicamente ativado pelo promotor CAG (CMV realçador/frango ß-actina) após Cre-mediada recombinação do genoma. O single-guia auto-concebidos RNAs (sgRNAs) e a sequência de recombinase Cre, ambos codificados em um plasmídeo único construto, foram entregues em células tronco/progenitoras cerebelar numa fase embrionária usando eletroporação no útero . Consequentemente, células transfectadas e suas células-filhas foram rotuladas com proteína verde fluorescente (GFP), facilitando ainda mais as análises fenotípicas. Portanto, este método é não só mostrando entrega baseada em electroporation gene em células embrionárias Cerebelares mas também propõe uma nova abordagem quantitativa para avaliar mediada por CRISPR fenótipos de perda-de-função.

Introdução

Doenças do cérebro são uma das mais terríveis doenças mortais. Muitas vezes resultam de mutações genéticas e desregulação subsequente. Para entender os mecanismos moleculares de doenças cerebrais, eterno esforços para decifrar os genomas dos pacientes humanos descobriram um número de genes causadores potenciais. Até agora, modelos animais germline geneticamente modificado têm sido utilizados para na vivo ganho-de-função (GOF) e perda de função (LOF) análises de tais genes candidatos. Devido ao acelerado desenvolvimento de estudos de validação funcional, um mais viável e flexível na vivo gene ensaio sistema para estudar a função dos genes é desejável.

A aplicação de um sistema de transferência de gene electroporation-baseado na vivo para o cérebro de rato em desenvolvimento é apropriada para esta finalidade. Na verdade, vários estudos utilizando no utero electroporation mostraram seu potencial para realizar análises funcionais no desenvolvimento cerebral^1,2,3. Na verdade, várias regiões do cérebro do rato, tais como o córtex cerebral⁴retina⁵, diencéfalo⁶, rombencéfalo⁷, cerebelo⁸e medula espinhal⁹ têm sido alvo de entrega genética somática abordagens, até agora.

De fato, expressão do gene transitória por eletroporação na vivo no cérebro de rato embrionárias tem sido muito utilizado para análise GOF. Recentes tecnologias de integração de genômica transposon-baseado mais habilitado a longo prazo e/ou condicional a expressão de genes de interesse^10,11, que é uma vantagem para dissecar a função dos genes de uma forma espacial e temporal durante desenvolvimento. Em contraste com a análise do GOF, análise LOF tem sido mais difícil. Enquanto transfection transiente de siRNAs e plasmideos shRNA de transporte realizou-se, a longo prazo efeitos de LOF dos genes não são garantidos devido à eventual degradação dos ácidos nucleicos exogenamente introduzidas, como plasmídeos e dsRNAs. No entanto, a tecnologia CRISPR/Cas fornece uma quebra-através de análises LOF. Genes que codificam proteínas fluorescentes (por exemplo, as boas práticas agrícolas) ou proteínas bioluminescentes (por exemplo, luciferase de vaga-lume) tem sido co transfected com CRISPR-Cas9 e sgRNAs para rotular as células expostas a mutações somáticas CRISPR-Cas9-mediada. No entanto, esta abordagem pode ter limitações em estudos funcionais em pilhas proliferating, desde genes marcadores exógenos são diluídos e degradados após proliferação a longo prazo. Enquanto as células transfectadas e suas células-filhas passam por mutações induzidas pelo CRISPR em seus genomas, suas pegadas podem se perder ao longo do tempo. Assim, abordagens genéticas de rotulagem seria adequadas para superar esse problema.

Recentemente desenvolvemos um método LOF CRISPR-baseado em células grânulo cerebelar que se submetem a proliferação de longo prazo durante sua diferenciação,¹². Para rotular geneticamente as células transfectadas, temos construído um plasmídeo carregando um sgRNA juntamente com Cre e introduzido o plasmídeo a cerebella de Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP de ratos¹³ usando no utero electroporation. Ao contrário dos vetores de plasmídeo regular codificação EGFP, essa abordagem com êxito rotulado grânulo transfectado precursores do neurônio (PNB) e suas células-filhas. Este método fornece grande apoio na compreensão função in vivo de genes de interesse nas células em proliferação no desenvolvimento normal do cérebro e um fundo propensas a tumor.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com normas de bem-estar animal e tenham sido aprovados pelas autoridades responsáveis (Regierungspräsidium Karlsruhe, números de aprovação: G90/13 G176/13, 14/G32, G48/14 e G133/14).

1. gerar plasmídeos pU6-sgRNA-Cbh-Cre

1. Desenha o sgRNA para o alvo de um gene de interesse de acordo com o protocolo anteriormente publicado¹⁴.
   Nota: Neste experimento, dois sgRNAs são projetados para direcionar o gene Top2b de rato e um sgRNA de controle não específico (tabela 1). A nocaute genes usando a tecnologia CRISPR, sgRNAs precisa ser projetado para atingir ou a sequência da código da região 5' ou o domínio essencial funcional da proteína. Um ponto de partida conveniente é testar sequências sgRNA pre-projetados publicamente disponíveis, como o GeCKO v2 rato nocaute piscina biblioteca¹⁵ do laboratório Zhang. Alternativamente, sgRNAs pode ser projetado usando software público disponível, tais como o seguinte Web site: crispr.mit.edu.
2. Clone o sgRNAs no vetor pU6-sgRNA-Cbh-Cre.
   Nota: O vetor pU6-sgRNA-Cbh-Cre¹² utilizado neste estudo é derivado do original de plasmídeo pX330¹⁶ , substituindo a sequência de código de SpCas9 com o Cre recombinase.
   1. Dois DNA oligos sintetiza como segue. Sentido: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisentido: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
      Nota: A 20 N é mostrado acima stand para a sequência de sgRNA.
   2. Digerir pU6-sgRNA-Cbh-Cre com BbsI por 30 min a 37 ° C, usando os seguintes reagentes, carregar a amostra digerida para um gel de agarose a 1% e purificá-los usando um kit de gel-extração. Uso 3 µ g plasmídeo; 3 µ l Bbseu; 1 µ l FastAP; 5 µ l 10 x buffer de digestão; Adicione ddH₂O para trazer o volume total de 50 µ l.
   3. Fosforilar e recoze a cada par de oligos sgRNA usando os seguintes reagentes (volume total de 10 µ l): 1 µ l Customized sentido oligo (100 mM); 1 µ l personalizado antisentido oligo (100 mM); 1 µ l 10 x T4 ligadura Buffer; µ L 6.5 ddH₂O; 0,5 Μ L T4 PNK. Incubar em um thermo-cycler por 30 min a 37 ° C e 5 min à 95 ° C e em seguida a rampa até 25 ° C a 5 ° C/min.
   4. Configurar a seguinte reação de ligadura e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (volume total de 10 µ l): X µL Bbseu digerido do plasmídeo (50 ng); 1 µ l fosforilada e recozido, oligo duplex (diluição de 1: 200); 5 µ l 2 x buffer de ligadura; X µL ddH₂O; Ligase rápida de 1 µ l.
   5. Adicione 2 µ l do produto ligadura em 50 µ l de células quimicamente competentes de DH5α Escherichia coli . Após 30 min de incubação no gelo, calor choque da amostra para 90 s a 42 ° C e incubar por 2 min no gelo. Adicione 100 µ l de meio LB e placa-lo em uma placa LB contendo 100 ampicilina µ g/mL.
      Nota: A integração da sequência de sgRNA para o plasmídeo pU6-sgRNA-Cbh-Cre é realizada de acordo com as etapas de clonagem para a pX330 do plasmídeo¹⁴.
   6. Inocular dois colônias, cada um em 2 mL de meio LB a 37 ° C por um período mínimo de 6 h e realizar um isolamento de DNA de mini-preparação usando um kit.
   7. Sanger sequenciar o DNA de prep mini usando o primer hU6-Forward e identificar colônias com a inserção correta de sgRNAs, alinhando com a sequência mostrada na etapa 1.2.1. A sequência da primeira demão é mostrada na tabela 1. Plasmídeos utilizados neste estudo foram nomeados pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre e pU6-sgControl-Cbh-Cre.
   8. Inocular colônias corretamente identificados e purificar o livre de endotoxinas plasmídeo para eletroporação no útero usando um kit, por exemplo, da Qiagen. Eluir o DNA com endotoxina livre TE-tampão diluído em ddH₂O às 01:10 (reserva de 10% TE). A concentração de DNA do plasmídeo precisa ser superior a 2 mg/mL.
      Nota: Não utilize um kit de maxi-prep regular para preparação de DNA. Loja do plasmídeo-soluções a 4 ° C para uso regular de curto prazo (até 4 semanas), ou alíquota um volume adequado de cerca de 25 µ l e manter a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.

2. testar a eficiência do sgRNAs usando o sistema do plasmídeo EGxxFP

Nota: A eficiência do sgRNAs normalmente é testada pelo topógrafo ou T7E1 (T7 endonuclease eu) ensaios. Neste protocolo, é usada uma abordagem alternativa fácil e eficiente. A chave desta abordagem é usar o plasmídeo pCAG-EGxxFP, que contém fragmentos de EGFP sobrepostos, separados por uma sequência de DNA que contém o sgRNA segmentação local¹⁷. Sobre a expressão de pCAG-EGxxFP, juntamente com o sgRNA e Cas9 nas células transfectadas, a ruptura de mediada por Cas9 fita dupla (DSB) na sequência de destino é reparada por endógenos mecanismos dependentes de homologia, que reconstitui a expressão EGFP gaveta.

1. Desenho de primers para amplificar a região genômica centralizada com o sgRNA como alvo sequências. O amplicon PCR é aproximadamente 500 bp. Neste experimento, aplicou-se um conjunto de DNA para clonar um fragmento amplificado por PCR para o plasmídeo pCAG-EGxxFP.
   Nota: Como alternativa, sites de restrição apropriada podem ser adicionados à extremidade 5' dos primers PCR. Sites de restrição disponíveis no vetor pCAG-EGxxFP são BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI e EcoRV.
2. Amplifica o DNA genômico com primers projetados usando o formulário e PCR parâmetros abaixo. Carregar a amostra (19.7 µ l H₂O; 0,3 µ l de 10 ng / µ l do mouse DNA genômico; 2,5 µ l 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2,5 µ l 10 µM EGxxFP-Top2b-R; 25 µ l 2 X mestre mistura PCR; volume total de 50 µ l) para um agarose 1% gel e gel-purificar os fragmentos PCR usando um kit de gel-extração. Use a seguinte reação condições: 95 ° C por 3 min; Então 35 x ciclos de 98 ° C por 20 s, 60 ° C durante 15 s, 72 ° C durante 20 segundos e 72 ° C por 1 min; 4 ° C, por tempo indeterminado.
   Nota: Neste experimento, uma região Top2b exon 1 foi amplificada; Encontre as sequências de cartilha na tabela 1.
3. Digerir o vetor de pCAG-EGxxFP com enzimas de restrição BamHI e EcoRI por 2 h a 37 ° C, em seguida carregar a amostra para um agarose 1% gel e gel-purificar a espinha dorsal de vetor usando um kit de gel-extração. Use os seguintes reagentes (volume total de 50 µ l): X µL plasmídeo (3 µ g); BamHI 2 µ l; 2 µ l EcoRI; 5 µ l 10 x Buffer; X µL ddH₂O.
4. Configurar o DNA montagem reação¹⁸ de acordo com as instruções do fabricante e transformar em DH5α competente Escherichia coli.
5. Inocular duas colónias, cada em 2 mL de meio LB a 37 ° C por um período mínimo de 6 h, executar um isolamento de DNA de mini-preparação usando um kit, por exemplo, da Qiagen e identificar colônias com a inserção correta (doravante referida como pCAG-EG-Top2b-FP) usando Sanger sequenciando com o primer EGxxFP-Top2b-F.
6. Transfect HEK293T células.
   1. Células de semente a HEK293T em uma placa de 24 24 h antes do transfection.
      Nota: As células foram cultivadas em uma incubadora de célula de 37 ° C com 5% CO_2, em DMEM com suplemento de glutamina contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina. Certifique-se de que as células são 60% de confluencia no dia do transfection. Neste experimento, costumávamos self-made HEK293T células expressando estàvel SpCas9 para testar pU6-sgRNA-Cbh-Cre. No entanto, sua HEK293T células podem ser usadas se um vetor de expressão SpCas9 é fornecido.
   2. Transfect as células HEK293T usando o reagente o polyethylenimine (PEI). Transfect as células com 120 ng/poço do plasmídeo pCAG-EG-Top2b-FP¹² e 120 ng/poço de pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre ou pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre em uma placa de 24. Misture o DNAs plasmideo e o 1,8 µ l de reagente de PEI em 80 µ l de unsupplemented meio DMEM com glutamina suplemento e incube por 15 min à temperatura ambiente após a utilização do vortex.
   3. 6 h após o transfeccao, remover o meio e substitua por meio fresco.
   4. Monitore a presença de células vivas de GFP⁺ 48 h após a transfeccao usando um microscópio de fluorescência na ampliação de 20 x.
      Nota: O número de células GFP⁺ indica a eficiência de direcionamento do sgRNA. Resultados da sgRNAs eficaz e não eficazes (sgTop2b-1 e sgTop2b-2, respectivamente) são mostrados na Figura 2A.

3. executar no Utero eletroporação

1. 6 a 8 semanas os ratos se reproduzem e preparar as ferramentas para eletroporação no útero . Cruzar um macho homozigoto Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP ratos com ratos fêmeas CD-1. Tempo a gravidez dos ratos CD-1 desde o dia em que o plugue vaginal é detectado (E0.5). Os embriões são electroporated no dia E13.5.
   1. Puxe os capilares de vidro de borosilicato (diâmetro interno: 0.6-0.8 mm) com um puxador de micropipeta. Use as seguintes configurações: P = 500, calor = 560, Pull = 150, Vel = 75, tempo = 250. Rotule a ponta capilar com tinta preta, para melhor visualização durante a injeção. Aparar o atarraxamento capilar sob um estereomicroscópio usando uma régua e pinças de agulha em ponto e apare a ponta em um comprimento de cerca de 6 mm.
   2. Manter a unidade dos capilares para manter o experimento pode ser reproduzido. Crie uma borda chanfrada unilateral durante o corte. A ponta deveria ser mais nítida possível para fácil penetração da parede uterina e para evitar danos nos tecidos do embrião.
      Nota: Como alternativa, use um micro moedor para ajustar um ângulo de 35°¹⁹. Os capilares podem ser armazenados à temperatura ambiente em um prato de Petri, sob condições isentos de agentes patogénicos de 10 cm.
   3. Autoclave os instrumentos cirúrgicos.
   4. Misture os sgRNA-plasmídeos em partes iguais com Luc-pT2K-IRES a uma concentração final de pelo menos 1 µ g / µ l para cada cor e plasmídeo a plasmídeo-solução com verde rápido (concentração final de 0.05%). Prepare a solução-mãe 1% rápido verde com água destilada livre de endotoxinas e filtrar através de um filtro de 0,22 µm para remover partículas de corante da solução.
      Nota: Transfection co de pT2K IRES-Luc é opcional, mas permite a identificação dos animais electroporated viável após o nascimento, utilizando imagens de bioluminescência. Por favor, consulte a etapa 3.5. Prepare uma quantidade suficiente de plasmídeo-mistura para o número total de ratos grávidas para ser operado. Use sobre 15-20 µ l misturar por rato (~ 12 embriões). Imediatamente com a cirurgia.
2. Prepare os ratos para a cirurgia.
   1. ANESTHETIZE ratos CD-1 grávidas com isoflurano. Induzir a anestesia em uma caixa com 3-4% vol isoflurano (taxa de fluxo de oxigênio: 1,5 L/min) e mantê-lo com 2 vol-% durante a cirurgia através do cone de nariz.
      Nota: A cirurgia completa não deve demorar mais do que 30 min. reduzir o número de injetado e electroporated embriões, se necessário. Use luvas esterilizadas para cirurgia.
   2. Coloque o mouse sobre as costas de uma almofada de aquecimento e ajuste a anestesia.
   3. Injetar analgésico (Metamizol, 800 mg/kg peso de corpo, por via subcutânea (s.c.), depósito de 24 h).
      Nota: Você pode usar outros analgésicos autorizados que Metamizol.
   4. Aplica a pomada para evitar ressecamento do olho durante a cirurgia.
   5. Corrigir os membros com fita e esterilizar o abdômen com um desinfectante. Cobrir o mouse com gaze, deixando apenas a área cirúrgica exposta. Espalhe o etanol a 70% sobre gaze e área cirúrgica.
   6. Fazer uma incisão na pele de cerca de 2 cm de comprimento e alargar o fosso suavemente com tesoura cirúrgica reta. Localize o linea alba e fazer uma segunda incisão ligeiramente menor através do peritônio, utilizando tecido tesoura com ponta romba.
   7. Umedeça a cavidade abdominal aberta com 1 estéril pré-aquecido x PBS.
   8. Cuidadosamente, extrai os cornos uterinos da cavidade abdominal, usando pinça de anel. Puxe suavemente, agarrando a parede uterina unicamente na gap entre os sacos de gema dos dois embriões vizinhos. Evite qualquer pressão sobre o embrião enquanto puxa-lo através da incisão. Ampliar a incisão, se necessário e tome cuidado extra para posicionar os cornos uterinos no abdômen enquanto não comprimir o fluxo de sangue através da artéria uterina.
      Nota: Em alguns casos, é aconselhável extrair um corno uterino de cada vez e substituí-lo antes de prosseguir com o segundo corno uterino.
3. Injeção e eletroporação de plasmídeo DNAs
   1. Aspire aproximadamente 15 µ l de plasmídeo-solução colorida com o capilar de vidro preparado. Evite quaisquer bolhas de ar durante este processo.
      Nota: A solução do plasmídeo pode entupir a ponta facilmente se sua concentração for elevada. Teste capilar liberando alguns DNA antes da injeção.
   2. Delicadamente segurar o embrião com pinça de anel e localizar a área do pescoço.
      Nota: Se o embrião está em uma posição difícil injetar, ignorá-lo e ir para o embrião do próximo. Aumento de reposicionamento do embrião pode aumentar as chances de dano a eles.
   3. Lentamente, perfurar com a ponta do capilar de vidro previamente preparado para o quarto ventrículo por penetrar o rombencéfalo dorsal e posteriormente injetar cerca de 1 µ l de mistura de plasmídeo. Confirme que o DNA tingido não é vazado do cérebro e é visível como um diamante em forma de estrutura.
      Nota: Como opção, use 2.5-fold lupas para melhor visualização do quarto ventrículo e ao redor dos vasos sanguíneos. Entrega os impulsos elétricos imediatamente depois da injeção para evitar a difusão da plasmídeo-solução para os outros ventrículos.
   4. Aplicar impulsos elétricos quadrados (5 pulsos, 32 mV, 50 ms-na, 950 ms-fora) com fórceps, como pinças de platina (ver Tabela de materiais). Coloque os eléctrodos lateralmente com o polo negativo, cobrindo a orelha e o polo positivo do primórdio cerebelar posicionados ao longo da parede uterina. Use placas de eletrodo 5 mm de diâmetro para eletroporação eficaz de embriões E13.5.
      Nota: Aumente a taxa de sobrevivência dos filhotes manipulando a menos de 2/3^rd do número total de embriões por barragem. Evite os embriões demasiado perto para o colo do útero. Se manipulado, eles podem causar complicações durante o parto e comprometer a ninhada inteira. Se os eletrodos são muito perto do coração do embrião, isto pode causar parada cardíaca.
4. Cuidados pós-electroporation e pós-operatório
   1. Coloque cuidadosamente os cornos uterinos volta na cavidade abdominal e preenchimento com pré aquecido estéril 1 x PBS. Deixe o slide de cornos uterinos em uma posição natural.
   2. Feche o peritônio e pele separadamente com uma sutura contínua simples.
      Nota: Tome cuidado extra para não perfurar a parede uterina quando suturar o peritônio.
   3. Encerramento da anestesia e coloque o animal de barriga para baixo numa jaula de nova.
   4. Monitore o animal durante a fase de vigília e novamente 24 h após a cirurgia. Coloque a gaiola sob uma lâmpada de aquecimento, se o tremor não melhora dentro de um tempo-frame de 15 min e o animal não inicia o aliciamento.
   5. Confirme o sucesso electroporation pela imagem latente do luciferase.
      1. Certifique-se que as barragens operadas cair embriões no tempo (na E19.5).
         Nota: A data de nascimento pode ser adiada para o dia seguinte provavelmente por causa da operação.
      2. Anestesiar os filhotes de electroporated (P5-P7) com 2,5% de isoflurano e injetar (intraperitoneal (i.p.)) com D-luciferina (3 mg/kg de peso corporal) 5 min antes da imagem latente.
      3. Detecta sinais de luciferase nos filhotes de electroporated usando o gerador de imagens de bioluminescência.
         Nota: Um tempo de exposição de 1 min é suficiente para detectar o sinal de luciferase. Radiance (p/s/cm²/sr) é aproximadamente > 1 x 10⁶.

4. prepare Cryosections de Cerebella a Electroporated

1. Abater os filhotes de P7 electroporated e dissecar o cerebelo.
   Nota: O sinal GFP pode ser observado usando um estereoscópio epifluorescente.
2. Corrigir o cerebella durante a noite em 5 mL por cérebro de 4% PFA em PBS a 4 ° C.
3. Transferir o cerebella fixo durante a noite em 10 mL por cérebro de 30% de sacarose em PBS a 4 ° C.
   Nota: O tecido deve atingir o fundo de um tubo de 15 mL após incubação na solução de sacarose.
4. Após absorver o restante da solução de sacarose com um pedaço de papel de filtro de celulose, mergulhe o cerebelo em uma temperatura de corte ideal (OCT) composta em um molde de plástico descartável e congelá-lo em gelo seco. O bloco criogênico pode ser armazenado a-80 ° C até o uso.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
5. Corte o bloco criogênico em seções com 10 µm de espessura, usando um criostato e manter as secções a-80 ° C até o uso.
   Nota: Um pode confirmar a expressão de GFP nas seções, depois de lavar a OCT composto com PBS.

5. imunocoloração da Cryosections

1. Seca as lâminas no room temperature por 30 min e lave duas vezes por 10 min em PBS.
2. Circule as seções com uma caneta de bloqueador líquido e incubar as seções em uma solução de bloqueio (10% de soro normal burro em PBS contendo 0,1% Triton-X100) por 1h à temperatura ambiente.
3. Acrescente os anticorpos primários contra as moléculas de interesse (por exemplo, as boas práticas agrícolas e topoisomerase II beta (Top2B) neste estudo) na solução de bloqueio e incubar durante a noite a 4 ° C.
   Nota: Os nomes e as concentrações de anticorpos utilizados estão listadas na Tabela de materiais. Para melhorar os sinais GFP, um anticorpo anti-GFP opcionalmente pode ser usado juntamente com os outros anticorpos.
4. Lave os slides com 0.1% contendo Triton PBST 3 X 10 min. Incubar as secções por 1h à temperatura ambiente com um anticorpo secundário conjugado fluoróforo diluído na solução de bloqueio contendo DAPI.
5. Lavar as lâminas em PBS 3 X 10 min. Monte os slides e manter a 4 ° C até a imagem.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

6. geração de imagens e análise

1. As seções usando um microscópio confocal, ampliação de 20 x da imagem.
2. Conte o número de células positivas GFP, perdendo a expressão da proteína alvo. Uma imagem representativa é mostrada na Figura 2B.
3. Verifique se o fenótipo molecular após ablação do gene-alvo no PNB e suas progênies immuostaining¹².

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Resultados

Na vivo análise funcional, é fundamental para identificar as células em que foram introduzidos genes exógenos. Enquanto a expressão de um marcador, como o GFP na não-proliferação de células pode ser acompanhados por um longo período de tempo, o sinal se perde sequencialmente nas células em proliferação. Uma ilustração deste efeito é demonstrada na Figura 1. Para contornar a perder a pegada de células transfectadas em análises LOF, d...

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Discussão

Usando o exo utero electroporation, anteriormente informamos siRNA-baseado na vivo funcional análises de Atoh1 numa fase precoce do grânulo cerebelar celular diferenciação⁸. Devido à diluição de siRNA/degradação e exposição de embriões fora da parede uterina, análise fenotípica das células grânulo electroporated limitou-se a estágios embrionários. No entanto, o método atual habilitado para análise do fenótipo dos animais pós-natal.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 488 Goat anti-Chicken	ThermoFisher	A11039	1:400 dilution
Alexa 568 Donkey anti-Mouse	Life Technologies	A-10037	1:400 dilution
Alexa 594 Donkey anti-Rabbit	ThermoFisher	A21207	1:400 dilution
Alexa 647 Donkey anti-Rabbit	Life Technologies	A31573	1:400 dilution
Alkaline Phosphatase (FastAP)	ThermoFisher	EF0654
Autoclave band	Kisker Biotech	150262
BamHI (HF)	NEB	R3136S
BbsI (FastDigest)	ThermoFisher	FD1014
Cellulose Filter Paper (Whatman)	Sigma-Aldrich	WHA10347525
Cloth	Tork	530378
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM800
D-Luciferin	biovision	7903-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:1000 dilution
Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold)	VWR	4566
DMEM Glutamax	ThermoFisher	31966047
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
EcoRI (HF)	NEB	R3101S
Electro Square Porator	BTX	ECM830
Endofree Maxi Kit	Qiagen	12362
Ethanol	Merck	107017
Eye ointment (Bepanthen)	Bayer	81552983
Fast Green	Merck	104022
FBS	ThermoFisher	10270-016
Filter (0.22 µm)	Merck	F8148
Fluorescent cell imager (ZOE)	Biorad	1450031
Forceps straight	Fine Science Tools	91150-20
Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)	Fisher Scientific	15387311
GFP antibody	Abcam	ab13970	1:1000 dilution
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611S
Glass Capillary with Filament	Narishige	GD1-2
Heating Pad	ThermoLux	463265 / -67
Image Processing software (ImageJ and Fiji)	NIH	-
Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100)	Carl Roth	AKP0.1
Isoflurane	Zoetis	TU061219
IVIS Lumina LT Series III Caliper	Perkin Elmer	CLS136331
Kalt Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY mix	Kapa Biosystems	KK2601
Ki67 antibody	Abcam	ab15580	1:500 dilution
Light Pointer	Photonic	PL3000
Liquid blocker pen	Kisker Biotech	MKP-1
Metamizol	WDT	-
Microgrinder	Narishige	EG-45
Microinjector	Narishige	IM300
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Microscope software ZEN	Zeiss	-
Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm)	Fine Science Tools	18020-50
O.C.T. Compound (Tissue-Tek)	VWR	4583
p27 antibody	BD bioscience	610241	1:200 dilution
Paraformaldehyde	Roth	335.3
PBS (1x)	Life Technologies	14190169
pCAG-EGxxFP	Addgene	50716
Polyethylenimine	Sigma-Aldrich	408727
pX330 plasmid	Addgene	42230
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Quick Ligation Kit	NEB	M2200S
Ring Forceps	Fine Science Tools	11103-09
Slides (SuperFrost)	ThermoFisher	10417002
Software for biostatistics (Prism 7)	GraphPad Software, Inc	-
Spitacid	EcoLab	3003840
Stereomicroscope	Nikon	C-PS
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
Surgical scissors	Fine Science Tools	91460-11
Surgical scissors with blunt tip	Fine Science Tools	14072-10
Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))	SMI	220340
T4 DNA Ligation Buffer	NEB	B0202S
T4 PNK	NEB	M0201S
Tissue scissors Blunt (11.5 cm)	Fine Science Tools	14072-10
TOP2B antibody	Santa Cruz	sc13059	1:200 dilution
Trypsin (2.5 %)	ThermoFisher	15090046
Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum	Xceltis GmbH	CUY650P5
Vaporizer	Drägerwerk AG	GS186