CRISPR-mediata di perdita di funzione di analisi in granuli cerebellari cellule utilizzando nell'Utero basati su elettroporazione trasferimento del Gene

Riepilogo

Studi convenzionali di perdita di funzione di geni mediante animali knockout sono stati spesso lunghe e costose. Basato su elettroporazione mutagenesi somatica CRISPR-mediata è un potente strumento per capire il gene funziona in vivo. Qui, segnaliamo un metodo per analizzare i fenotipi di knockout in cellule di proliferazione del cervelletto.

Abstract

Malformazione del cervello è spesso causato da mutazioni genetiche. Decifrare le mutazioni in tessuti derivati dal paziente ha identificato potenziali fattori causali delle malattie. Per convalidare il contributo di una disfunzione dei geni mutati per lo sviluppo della malattia, la generazione di modelli animali che trasportano le mutazioni è un approccio più ovvio. Mentre germline geneticamente modelli murini (GEMM) sono popolari strumenti biologici e mostrano risultati riproducibili, è limitato dal tempo e costi. Nel frattempo, non di germline GEMM consentono spesso esplorare funzione del gene in un modo più fattibile. Poiché alcuni cervello malattie (ad es., tumori cerebrali) sembrano derivare da somatico ma non le mutazioni di germline, modelli di topi chimerici non germinale, in cui convivono le cellule normali e anormali, potrebbero essere utile per analisi rilevanti per la malattia. In questo studio, segnaliamo un metodo per l'induzione di mutazioni somatiche CRISPR-mediata nel cervelletto. In particolare, abbiamo utilizzato il condizionali topi knock-in, in cui Cas9 e GFP sono cronicamente attivati dal promotore CAG (CMV enhancer/pollo ß-actina) dopo Cre-mediata ricombinazione del genoma. La singolo-guida auto-progettata RNAs (sgRNAs) e la sequenza di Cre ricombinasi, sia codificato in un plasmide singolo costrutto, sono stati consegnati in cellule staminali/progenitrici cerebellari in una fase embrionale usando l'elettroporazione nell'utero . Di conseguenza, cellule trasfettate e loro cellule della figlia sono stati etichettati con la proteina fluorescente verde (GFP), facilitando così ulteriori analisi fenotipiche. Quindi, questo metodo è non solo risultati basati su elettroporazione genico in cellule embrionali cerebellare ma anche proponendo un nuovo approccio quantitativo per valutare CRISPR-mediata di fenotipi di perdita-de-funzione.

Introduzione

Malattie del cervello sono una delle più terribili malattie mortali. Risultano spesso dalle mutazioni genetiche e disregolazione successive. Per comprendere i meccanismi molecolari delle malattie del cervello, perenne sforzi per decifrare il genoma dei pazienti umani hanno scoperto una serie di geni causativi potenziali. Finora, sono stati utilizzati modelli animali geneticamente costruiti di germline per in vivo guadagno di funzione (GOF) e perdita di funzione (LOF) analisi di tali geni candidati. Dovuto lo sviluppo accelerato di studi di validazione funzionale, è auspicabile un più fattibile e flessibile in vivo gene sistema di analisi per lo studio della funzione genica.

L'applicazione di un sistema di trasferimento del gene basati su elettroporazione in vivo per lo sviluppo del cervello del mouse è adatto allo scopo. Infatti, parecchi studi usando l'elettroporazione in utero hanno indicato il loro potenziale per condurre analisi funzionali nel cervello in via di sviluppo^1,2,3. In realtà, diverse regioni del cervello del mouse, come la corteccia cerebrale⁴, retina⁵, diencefalo⁶, hindbrain⁷, cervelletto⁸e del midollo spinale⁹ stati presi di mira dalla consegna genica somatica approcci, finora.

Infatti, l'espressione genica transitoria mediante elettroporazione in vivo su cervelli embrionali del mouse lungo è stato usato per analisi GOF. Recenti tecnologie di integrazione genomica basata su trasposone ulteriormente abilitata a lungo termine e/o condizionale espressione dei geni di interesse^10,11, che è vantaggioso per sezionare la funzione del gene in modo spaziale e temporale durante sviluppo. In contrasto con analisi GOF, analisi LOF sono stato più impegnativo. Mentre è stata eseguita la trasfezione transiente di siRNA e che trasportano shRNA plasmidi, effetti a lungo termine di LOF di geni non sono garantiti a causa di eventuale degradazione degli acidi nucleici esogenicamente introdotti, quali plasmidi e dsRNA. Tuttavia, la tecnologia CRISPR/Cas fornisce un'innovazione nelle analisi di LOF. Geni codificanti proteine fluorescenti (ad es., GFP) o bioluminescente proteine (ad es., luciferasi firefly) sono stato co-trasfettati con CRISPR-Cas9 e sgRNAs di etichettare le cellule esposte a mutazioni somatiche CRISPR-Cas9-mediata. Tuttavia, questo approccio potrebbe avere limitazioni negli studi funzionali su cellule proliferanti, poiché i geni marcatori esogeni sono diluiti e degradati dopo proliferazione a lungo termine. Mentre le cellule trasfettate e loro cellule figlie subiscono CRISPR-indotto mutazioni nel loro genoma, le loro impronte potrebbero perdersi nel tempo. Così, approcci genetici etichettatura sarebbe adatti per superare questo problema.

Recentemente abbiamo sviluppato un metodo basato su CRISPR LOF in cellule cerebellari del granello che subiscono a lungo termine proliferazione durante la loro differenziazione¹². Per etichettare geneticamente le cellule transfettate, abbiamo costruito un plasmide che trasportano un sgRNA insieme a Cre e introdusse il plasmide cervelletti di Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP topi¹³ usando l'elettroporazione nell'utero . A differenza di vettori del plasmide regolare codifica EGFP, questo approccio correttamente etichettato trasfettato granello precursori del neurone (PNL) e loro cellule della figlia. Questo metodo fornisce grande sostegno nella comprensione in vivo funzione dei geni di interesse in cellule proliferanti nello sviluppo normale del cervello e uno sfondo tumore-incline.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo norme sul benessere degli animali e sono stati approvati dalle autorità competenti (Regierungspräsidium Karlsruhe, i numeri di omologazione: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 e 14/G133).

1. generare plasmidi pU6-sgRNA-Cbh-Cre

1. Progettare il sgRNA per indirizzare un gene di interesse secondo il protocollo precedentemente pubblicati¹⁴.
   Nota: In questo esperimento, due sgRNAs sono progettati per indirizzare il gene Top2b del mouse e un controllo non mirati sgRNA (tabella 1). Di geni knockout utilizzando la tecnologia CRISPR, sgRNAs bisogno di essere progettato per essere destinati la sequenza codificante della regione 5' o il dominio funzionale essenziale della proteina. Un comodo punto di partenza è di testare pubblicamente disponibile pre-progettati sgRNA sequenze, come il GeCKO v2 topo knockout piscina biblioteca¹⁵ dal laboratorio Zhang. In alternativa, sgRNAs può essere progettato utilizzando software pubbliche disponibili come ad esempio il seguente sito Web: crispr.mit.edu.
2. Clonare il sgRNAs nel vettore pU6-sgRNA-Cbh-Cre.
   Nota: pU6-sgRNA-Cbh-Cre vettoriale¹² utilizzato in questo studio è derivata dall'originale pX330 plasmide¹⁶ sostituendo la sequenza codificante di SpCas9 con la ricombinasi Cre .
   1. Sintetizzare due DNA oligos come segue. Senso: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisenso: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
      Nota: 20 N di riportati sopra stand per la sequenza di sgRNA.
   2. Digerire pU6-sgRNA-Cbh-Cre con BbsI per 30 min a 37 ° C, utilizzando i seguenti reagenti, caricare il campione digerito da un gel di agarosio all'1% e purificarle utilizzando un kit di estrazione del gel. Uso 3 µ g plasmide; 3 µ l BbsI; 1 µ l FastAP; 5 µ l 10 x buffer di digestione; aggiungere ddH₂O per portare il volume totale di 50 µ l.
   3. Fosforilare e tempri ogni coppia di sgRNA oligos usando i seguenti reagenti (10 µ l di volume totale): 1 µ l su misura senso oligo (100 mM); 1 µ l su misura oligo antisenso (100 mM); 1 µ l 10 x T4 legatura Buffer; µ L 6,5 ddH₂O; 0,5 Μ L T4 PNK. Incubare in un termo-cycler per 30 min a 37 ° C e 5 min a 95 ° C e poi la rampa fino a 25 ° C a 5 ° C/min.
   4. Impostare la seguente reazione di legatura e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (10 µ l di volume totale): X µL Bbsho digerito plasmide (50 ng); 1 µ l fosforilato e ricotto, oligo duplex (diluizione 1: 200); 5 µ l 2 x buffer di legatura; X µL ddH₂O; Ligasi rapido di 1 µ l.
   5. Aggiungere 2 µ l di prodotto legatura in 50 µ l di cellule DH5α Escherichia coli chimicamente competenti. Dopo 30 min di incubazione in ghiaccio, calore shock il campione per 90 s a 42 ° C ed incubare per 2 min sul ghiaccio. Aggiungere 100 µ l di terreno LB e piatto si su un piatto LB contenente ampicillina di 100 µ g/mL.
      Nota: L'integrazione della sequenza sgRNA nel plasmide pU6-sgRNA-Cbh-Cre è effettuata secondo la procedura di clonazione per il plasmide pX330¹⁴.
   6. Inoculare due colonie, ciascuno in 2 mL di terreno LB a 37 ° C per un minimo di 6 h ed eseguire un isolamento di DNA mini-prep utilizzando un kit.
   7. Sanger sequenza DNA mini-prep utilizzando il primer hU6-Forward e identificare le colonie con il corretto inserimento di sgRNAs allineando con la sequenza indicata al punto 1.2.1. Sequenza del primer è mostrata nella tabella 1. Plasmidi utilizzati in questo studio sono stati denominati pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre e pU6-sgControl-Cbh-Cre.
   8. Inoculare le colonie correttamente identificato e purificare il plasmide privo di endotossina DNA per elettroporazione nell'utero utilizzando un kit, ad esempio, da Qiagen. Eluire il DNA con TE-amplificatore senza endotossina diluito in ddH₂O alle 01:10 (10% buffer di TE). La concentrazione di DNA del plasmide deve essere superiore a 2 mg/mL.
      Nota: Non utilizzare un normale maxi-prep kit per la preparazione di DNA. Plasmide-soluzioni a 4 ° C per uso regolare a breve termine (fino a 4 settimane), o aliquota magazzini un volume adeguato di circa 25 µ l e conservare a-20 ° C per la conservazione a lungo termine.

2. testare l'efficienza di sgRNAs utilizzando il sistema di plasmide EGxxFP

Nota: L'efficienza del sgRNAs normalmente è controllata da geometra o T7E1 (T7 endonucleasi io) saggi. In questo protocollo, viene utilizzato un approccio alternativo facile ed efficiente. La chiave di questo approccio consiste nell'utilizzare il plasmide pCAG-EGxxFP che contiene frammenti EGFP sovrapposti separati da una sequenza di DNA contenente il sgRNA targeting per sito¹⁷. Al momento l'espressione di pCAG-EGxxFP insieme alla sgRNA e Cas9 in cellule transfected, la rottura di Cas9-mediata doppio filamento (DSB) nella sequenza di destinazione viene riparata da meccanismi endogeni di omologia-dipendente, che ricostituisce l'espressione di EGFP cassetta.

1. Disegnare primers per amplificare la regione genomica centrata con il sgRNA sequenze di targeting. L'amplicone PCR è di circa 500 bp. In questo esperimento, un assemblaggio di DNA è stato applicato per clonare un frammento di PCR-amplificato nel plasmide pCAG-EGxxFP.
   Nota: In alternativa, siti di restrizione appropriato possono essere aggiunto all'estremità 5' degli iniettori PCR. Siti di restrizione disponibile nel vettore pCAG-EGxxFP sono BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI ed EcoRV.
2. Amplificare il DNA genomico con primer progettato utilizzando il formato e i parametri PCR qui sotto. Caricare l'esempio (19,7 µ l H₂O; 0,3 µ l di 10 ng / µ l del mouse DNA genomico; 2,5 µ l 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2,5 µ l 10 µM EGxxFP-Top2b-R; 25 µ l 2 X mix master PCR; 50 µ l di volume totale) su un 1% di agarosio gel e gel-purificare i frammenti PCR utilizzando un kit di estrazione del gel. Utilizzare il seguente reazione condizioni: 95 ° C per 3 min; quindi 35 x cicli di 98 ° C per 20 s, 60 ° C per 15 s, 72 ° C per 20 s e 72 ° C per 1 min; 4 ° C, a tempo indeterminato.
   Nota: In questo esperimento, una regione in essone Top2b 1 è stata amplificata; trovare le sequenze dell'iniettore nella tabella 1.
3. Digest è il vettore di pCAG-EGxxFP con enzimi di restrizione BamHI ed EcoRI per 2 h a 37 ° C, quindi caricare l'esempio su un 1% di agarosio gel e gel-purificare la spina dorsale di vettore utilizzando un kit di estrazione del gel. Utilizzare i seguenti reagenti (volume totale di 50 µ l): X µL plasmide (3 µ g); BamHI 2 µ l; EcoRI 2 µ l; 5 µ l 10 x Buffer; X µL ddH₂O.
4. Impostare il DNA Assemblea reazione¹⁸ secondo le istruzioni del fabbricante e trasformate in DH5α competente e. coli.
5. Inoculare due colonie, ogni in 2 mL di LB medium a 37 ° C per un minimo di 6 h, eseguire un isolamento di DNA mini-prep utilizzando un kit, ad esempio, da Qiagen e identificare le colonie con il corretto inserimento (in appresso pCAG-EG-Top2b-FP) utilizzando Sanger sequenziamento con il primer di EGxxFP-Top2b-F.
6. Transfect HEK293T cellule.
   1. Celle di seme il HEK293T in una piastra a 24 pozzetti 24 h prima di transfezione.
      Nota: Le cellule sono state coltivate in un incubatore a 37 ° C delle cellule con 5% CO_2, in DMEM con integratore di glutammina contenente 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina. Assicurarsi che le celle siano 60% confluenti il giorno della transfezione. In questo esperimento, abbiamo usato il self-made HEK293T cellule che esprimono stabilmente SpCas9 per testare pU6-sgRNA-Cbh-Cre. Tuttavia, wildtype HEK293T cellule possono essere utilizzate se non viene fornito un vettore di espressione SpCas9.
   2. Transfect le cellule HEK293T utilizzando il reagente polyethylenimine (PEI). Transfect le cellule con 120 ng/pozzetto di plasmide pCAG-EG-Top2b-FP¹² e 120 ng/pozzetto di pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre o pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre in una piastra a 24 pozzetti. Mescolare il plasmide DNAs e il 1,8 µ l di reagente di PEI in 80 µ l di DMEM senza aggiunte con glutamina supplemento e incubare per 15 min a temperatura ambiente dopo nel Vortex.
   3. 6 ore dopo la trasfezione, rimuovere il mezzo e sostituirli con medium fresco.
   4. Monitorare la presenza di cellule GFP⁺ vive 48 ore dopo la trasfezione usando un microscopio a fluorescenza a 20 ingrandimenti.
      Nota: Il numero di cellule GFP⁺ indica l'efficienza targeting della sgRNA. Risultati di sgRNAs efficace e non efficace (sgTop2b-1 e sgTop2b-2, rispettivamente) sono mostrati nella Figura 2A.

3. eseguire nell'Utero elettroporazione

1. 6 a 8-settimana-vecchi topi di razza e predisporre gli strumenti nell'utero elettroporazione. Croce uomo omozigotica Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP topi con i topi femminili CD-1. Ora la gravidanza dei topi CD-1 dal giorno che il plug vaginale è rilevato (0.5). Gli embrioni sono individulamente al giorno E13.5.
   1. Tirare tubi capillari in vetro borosilicato (diametro interno: 0,6-0,8 mm) con un estrattore micropipetta. Utilizzare le seguenti impostazioni: P = 500, calore = 560, Pull = 150, Vel = 75, tempo = 250. Etichettare la punta capillare con inchiostro nero per una migliore visualizzazione durante l'iniezione. Taglia il cono capillare sotto un microscopio stereoscopico utilizzando un righello e tagliente dell'ago pinzette e taglia la punta ad una lunghezza di circa 6 mm.
   2. Mantenere l'unità dei capillari per mantenere l'esperimento riproducibile. Creare un bordo smussato su un solo lato durante l'operazione di taglio. La punta deve essere tagliente come possibile per una facile penetrazione della parete uterina e per evitare danni ai tessuti dell'embrione.
      Nota: In alternativa, utilizzare una smerigliatrice per regolare un angolo di 35°¹⁹. I capillari possono essere conservati a temperatura ambiente in un 10cm di Petri in condizioni esenti da patogeni.
   3. Autoclave gli strumenti chirurgici.
   4. Mescolare i plasmidi sgRNA in parti uguali con pT2K-IRES-Luc a una concentrazione finale di almeno 1 µ g / µ l per ogni plasmide e colore il plasmide-soluzione con veloce verde (concentrazione finale di 0.05%). Preparare soluzione 1% veloce verde con acqua distillata priva di endotossina e filtro attraverso un filtro da 0,22 µm per rimuovere le particelle di colorante dalla soluzione.
      Nota: Co-transfezione di pT2K IRES-Luc è facoltativa, ma consente per l'identificazione degli animali individulamente praticabile dopo la nascita facendo uso di imaging di bioluminescenza. Vedi prego punto 3.5. Preparare una quantità sufficiente di plasmide-mix per il numero totale di topi incinto per essere operati. Utilizzare circa 15-20 µ l mescolare per topo (~ 12 embrioni). Procedere immediatamente con l'intervento chirurgico.
2. Preparare topi per la chirurgia.
   1. Anestetizzare i topi CD-1 incinto con isoflurano. Indurre l'anestesia in una scatola con 3-4% vol isoflurano (portata di ossigeno: 1,5 L/min) e mantenerla con 2 vol-% durante chirurgia via cono di naso.
      Nota: L'ambulatorio completo non dovrebbe richiedere più di 30 min. ridurre il numero di iniettato e individulamente embrioni, se necessario. Utilizzare guanti sterili per la chirurgia.
   2. Posizionare il mouse sulla relativa parte posteriore su una piastra elettrica e regolare l'anestesia.
   3. Iniettare analgesico (Metamizol, 800 mg/kg di peso corporeo, per via sottocutanea (s.c.), deposito di 24 h).
      Nota: È possibile utilizzare altri analgesici autorizzati di Metamizol.
   4. Applicare unguento oculare per evitare secchezza dell'occhio durante l'intervento chirurgico.
   5. Difficoltà membra con nastro e sterilizzare l'addome con un disinfettante. Coprire il mouse con una garza, lasciando solo l'area chirurgica esposto. Sviluppa etanolo al 70% su garza e area chirurgica.
   6. Fare un'incisione della pelle di circa 2 cm di lunghezza e ampliare il divario delicatamente con le forbici chirurgiche dritto. Individuare la linea alba e fare una seconda incisione leggermente più piccola attraverso il peritoneo usando il tessuto forbici con la punta smussata.
   7. Inumidire la cavità addominale aperta con pre-riscaldato sterile 1 x PBS.
   8. Estrarre delicatamente i corni uterini dalla cavità addominale utilizzando pinze anello. Tirare delicatamente afferrando la parete uterina esclusivamente presso il divario tra sac di tuorlo di due embrioni vicini. Evitare qualsiasi pressione sull'embrione mentre tirandola attraverso l'incisione. Ingrandire l'incisione se necessario e prendere la cura supplementare per posizionare i corni uterini sull'addome comprimendo non flusso di sangue attraverso l'arteria uterina.
      Nota: In alcuni casi, si consiglia di estrarre un corno uterino alla volta e sostituirlo prima di procedere con il secondo corno uterino.
3. Iniezione ed elettroporazione del plasmide DNAs
   1. Aspirare circa 15 µ l di plasmide-soluzione colorata con il capillare di vetro preparato. Evitare eventuali bolle d'aria durante questo processo.
      Nota: La soluzione di plasmide possa ostruire la punta facilmente se la sua concentrazione è alta. Testare il capillare rilasciando alcuni DNA proprio prima dell'iniezione.
   2. Delicatamente, tenere l'embrione con una pinza anello e individuare la zona del collo.
      Nota: Se l'embrione è in una posizione difficile da iniettare, saltarla e passare per l'embrione successivo. Riposizionamento aumentata dell'embrione può aumentare la probabilità di danno a loro.
   3. Pierce con la punta del vetro precedentemente preparato capillare nel quarto ventricolo penetrando attraverso la dorsale hindbrain e successivamente iniettare lentamente circa 1 µ l del plasmide-mix. Confermare che il DNA tinto non è trapelato dal cervello e che è visibile come un diamante a forma di struttura.
      Nota: In alternativa, utilizzare 2,5 volte lenti di ingrandimento per una migliore visualizzazione del quarto ventricolo e che circondano i vasi sanguigni. Fornire impulsi elettrici immediatamente dopo l'iniezione per prevenire la diffusione della plasmide-soluzione ai altri ventricoli.
   4. Applicare elettrici impulsi quadrati (5 impulsi, 32 mV, 50 ms-su, 950 ms-off) con forcipe-come pinzette platino (Vedi Tabella materiali). Posizionare gli elettrodi lateralmente con il polo negativo che copre l'orecchio e il polo positivo posizionato presso il primordio cerebellare sulla parete uterina. Utilizzare elettrodi di 5 mm di diametro per elettroporazione efficace degli embrioni E13.5.
      Nota: Aumentare il tasso di sopravvivenza dei cuccioli manipolando meno di 2/3^rd del numero totale di embrioni per diga. Evitare gli embrioni troppo vicino alla cervice. Se manipolato, potrebbero causare complicazioni durante il travaglio e compromettere l'intera cucciolata. Se gli elettrodi sono troppo vicino al cuore dell'embrione, questo può causare arresto cardiaco.
4. Cura post-chirurgia e post-elettroporazione
   1. Posizionare con attenzione i corni uterini indietro nella cavità addominale e riempimento con pre-riscaldati sterile 1 x PBS. Far scorrere il corni uterini in una posizione naturale.
   2. Chiudere il peritoneo e pelle separatamente con una semplice sutura continua.
      Nota: Prestare particolare attenzione a non perforare la parete uterina durante la sutura del peritoneo.
   3. Spegnere l'anestesia e posto l'animale a pancia in giù in una nuova gabbia.
   4. Monitorare l'animale durante la fase di risveglio e ancora 24 h dopo l'intervento chirurgico. Posizionare la gabbia sotto una lampada di riscaldamento, se il tremore non migliora entro un tempo 15 min e l'animale non inizia a governare.
   5. Confermare l'elettroporazione successo da formazione immagine luciferasi.
      1. Assicurarsi che le dighe funzionate cadere gli embrioni in tempo (a e 19.5).
         Nota: La data di nascita può essere differita al giorno successivo probabilmente a causa dell'operazione.
      2. Anestetizzare i cuccioli individulamente (P5-P7) con 2,5% isoflurane e iniettare (intraperitoneale (i.p.)) con D-luciferina (3 mg/kg di peso corporeo) 5 min prima di formazione immagine.
      3. Rilevare i segnali di luciferasi in cuccioli individulamente utilizzando il dispositivo di imaging di bioluminescenza.
         Nota: Un tempo di esposizione di 1 min è sufficiente per rilevare il segnale della luciferasi. Radiance (p/s/cm²/sr) è circa > 1 x 10⁶.

4. preparare Cryosections dai cervelletti individulamente

1. I cuccioli di P7 individulamente di eutanasia e sezionare il cervelletto.
   Nota: Il segnale GFP può essere osservato utilizzando un stereoscopio epifluorescente.
2. Difficoltà durante la notte i cervelletti in 5 mL al cervello del 4% PFA in PBS a 4 ° C.
3. Trasferire i cervelletti fissi pernottamento in 10 mL al cervello di saccarosio al 30% in PBS a 4 ° C.
   Nota: Il tessuto dovrebbe raggiungere il fondo di una provetta 15 mL dopo incubazione della soluzione di saccarosio.
4. Dopo l'immersione della soluzione di saccarosio rimanenti con un pezzo di carta da filtro cellulosa, immergere il cervelletto in una temperatura ottimale di taglio (OCT), composto in uno stampo di plastica usa e getta e congelare il ghiaccio secco. Il blocco criogenico possa essere memorizzato a-80 ° C fino all'utilizzo.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
5. Tagliare il blocco criogenico in sezioni con 10 µm di spessore utilizzando un criostato e mantenere le sezioni a-80 ° C fino all'utilizzo.
   Nota: Si può confermare l'espressione della GFP nelle sezioni, dopo il lavaggio fuori l'OCT composto con PBS.

5. Immunostaining della Cryosections

1. Asciugare i vetrini a temperatura per 30 min e lavare due volte per 10 min in PBS.
2. Le sezioni del cerchio con una penna di liquido bloccante e incubare le sezioni in una soluzione bloccante (10% di siero normale asino in PBS contenente 0,1% Triton-X100) per 1 h a temperatura ambiente.
3. Aggiungere gli anticorpi primari contro le molecole di interesse (ad es., GFP e topoisomerasi II beta (Top2B) in questo studio) nella soluzione di blocco e incubare per una notte a 4 ° C.
   Nota: I nomi e le concentrazioni di anticorpi utilizzati sono elencate nella Tabella materiali. Al fine di migliorare i segnali GFP, un anticorpo anti-GFP può essere utilizzato facoltativamente insieme con gli altri anticorpi.
4. Lavare i vetrini con 0,1% Triton-contenente PBST 3 X per 10 min. Incubare le sezioni per 1 h a temperatura ambiente con un anticorpo secondario coniugato fluoroforo diluito in soluzione bloccante contenente DAPI.
5. Lavare i vetrini in PBS 3x per 10 min. Mount le diapositive e conservare a 4 ° C fino a formazione immagine.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

6. imaging e analisi

1. Le sezioni utilizzando un microscopio confocale a 20 ingrandimenti dell'immagine.
2. Contare il numero di cellule positive GFP, perdendo l'espressione della proteina dell'obiettivo. Un'immagine rappresentativa è mostrata nella Figura 2B.
3. Verifica il fenotipo molecolare all'ablazione dei geni bersaglio in PNL e loro progenie di immuostaining¹².

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Per l'analisi funzionale in vivo , è fondamentale per identificare le celle in cui sono stati introdotti geni esogeni. Mentre l'espressione di un marcatore, come GFP in cellule non proliferanti possono essere continuati per un lungo periodo di tempo, il segnale si perde in sequenza nelle cellule proliferanti. Un'illustrazione di questo effetto è dimostrata nella Figura 1. Per ovviare a perdere l'impronta delle cellule transfected nelle analisi di L...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Usando l'elettroporazione exo utero , precedentemente abbiamo segnalato basati su siRNA in vivo analisi funzionali di Atoh1 in una fase iniziale di granuli cerebellari cellulari differenziazione⁸. A causa di siRNA diluizione/degradazione e l'esposizione di embrioni di fuori della parete uterina, l'analisi fenotipica delle cellule del granello individulamente era limitata a fasi embrionali. Tuttavia, il metodo corrente attivata analisi del fenotipo di animali postnatali.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa 488 Goat anti-Chicken	ThermoFisher	A11039	1:400 dilution
Alexa 568 Donkey anti-Mouse	Life Technologies	A-10037	1:400 dilution
Alexa 594 Donkey anti-Rabbit	ThermoFisher	A21207	1:400 dilution
Alexa 647 Donkey anti-Rabbit	Life Technologies	A31573	1:400 dilution
Alkaline Phosphatase (FastAP)	ThermoFisher	EF0654
Autoclave band	Kisker Biotech	150262
BamHI (HF)	NEB	R3136S
BbsI (FastDigest)	ThermoFisher	FD1014
Cellulose Filter Paper (Whatman)	Sigma-Aldrich	WHA10347525
Cloth	Tork	530378
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM800
D-Luciferin	biovision	7903-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:1000 dilution
Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold)	VWR	4566
DMEM Glutamax	ThermoFisher	31966047
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663
EcoRI (HF)	NEB	R3101S
Electro Square Porator	BTX	ECM830
Endofree Maxi Kit	Qiagen	12362
Ethanol	Merck	107017
Eye ointment (Bepanthen)	Bayer	81552983
Fast Green	Merck	104022
FBS	ThermoFisher	10270-016
Filter (0.22 µm)	Merck	F8148
Fluorescent cell imager (ZOE)	Biorad	1450031
Forceps straight	Fine Science Tools	91150-20
Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)	Fisher Scientific	15387311
GFP antibody	Abcam	ab13970	1:1000 dilution
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611S
Glass Capillary with Filament	Narishige	GD1-2
Heating Pad	ThermoLux	463265 / -67
Image Processing software (ImageJ and Fiji)	NIH	-
Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100)	Carl Roth	AKP0.1
Isoflurane	Zoetis	TU061219
IVIS Lumina LT Series III Caliper	Perkin Elmer	CLS136331
Kalt Suture Needles	Fine Science Tools	12050-02
KAPA HIFI HOTSTART READY mix	Kapa Biosystems	KK2601
Ki67 antibody	Abcam	ab15580	1:500 dilution
Light Pointer	Photonic	PL3000
Liquid blocker pen	Kisker Biotech	MKP-1
Metamizol	WDT	-
Microgrinder	Narishige	EG-45
Microinjector	Narishige	IM300
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Microscope software ZEN	Zeiss	-
Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm)	Fine Science Tools	18020-50
O.C.T. Compound (Tissue-Tek)	VWR	4583
p27 antibody	BD bioscience	610241	1:200 dilution
Paraformaldehyde	Roth	335.3
PBS (1x)	Life Technologies	14190169
pCAG-EGxxFP	Addgene	50716
Polyethylenimine	Sigma-Aldrich	408727
pX330 plasmid	Addgene	42230
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
Quick Ligation Kit	NEB	M2200S
Ring Forceps	Fine Science Tools	11103-09
Slides (SuperFrost)	ThermoFisher	10417002
Software for biostatistics (Prism 7)	GraphPad Software, Inc	-
Spitacid	EcoLab	3003840
Stereomicroscope	Nikon	C-PS
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016
Surgical scissors	Fine Science Tools	91460-11
Surgical scissors with blunt tip	Fine Science Tools	14072-10
Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0))	SMI	220340
T4 DNA Ligation Buffer	NEB	B0202S
T4 PNK	NEB	M0201S
Tissue scissors Blunt (11.5 cm)	Fine Science Tools	14072-10
TOP2B antibody	Santa Cruz	sc13059	1:200 dilution
Trypsin (2.5 %)	ThermoFisher	15090046
Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum	Xceltis GmbH	CUY650P5
Vaporizer	Drägerwerk AG	GS186