Adaptação 3' rápida amplificação do CDNA termina para mapear transcritos em câncer

Resumo

A amplificação rápida dois diferentes 3' extremidades do cDNA (3' corrida) protocolos descrito aqui fazem uso de dois diferentes polimerases de DNA para mapear sequências que incluem um segmento de quadro de leitura aberta (ORF), o códon de parada e o inteiro 3' UTR de uma transcrição de usando o RNA obtidos de linhagens celulares de cancro diferentes.

Resumo

Maturação dos mRNAs eucarióticos envolve 3' formação de ponta, que envolve a adição de uma cauda poli (a). A fim de mapear a extremidade 3' de um gene, o tradicional método de escolha é 3' amplificação rápida das extremidades do cDNA (3' corrida). Protocolos para 3' corrida requerem o design cuidadoso e seleção de primers aninhadas dentro da região 3' untranslated (3' UTR) do gene alvo de interesse. No entanto, com algumas modificações, o protocolo pode ser usado para incluir o inteiro 3' UTR e sequências dentro do quadro de leitura aberta (ORF), fornecendo uma imagem mais abrangente da relação entre a ORF e a 3' UTR. Isto está além da identificação do sinal de poliadenilação (PAS), assim como o decote e poliadenilação site fornecido pelo convencional 3' corrida. Expandida de 3' corrida pode detectar incomum 3' UTRs, incluindo fusões gene dentro a 3' UTR, e as informações de sequência podem ser usadas para prever potenciais locais obrigatórios de miRNA, bem como AU rico desestabilizando a elementos que possam afectar a estabilidade da transcrição.

Introdução

A formação da extremidade 3' é um passo crítico na maturação do mRNA que compreende a clivagem do pre-mRNA a jusante de um PAS, seguido pela adição de 250 ~ untemplated adenines, que formam a cauda de poli^1,2. Proteína de ligação a poli (PABP) vincula-se à cauda poli (a), e isso protege a transcrição do mRNA de degradação e facilita a tradução¹.

As estimativas atuais sugerem que 70% dos genes humanos têm Passe múltiplo e, portanto, submeter-se poliadenilação alternativa, resultando em múltiplos 3' extremidades³. Assim, é importante identificar onde a cauda poli (a) atribui ao resto do 3' UTR, bem como identificar o PAS usado por qualquer transcrição determinada. O advento da próxima geração de sequenciamento resultou na identificação simultânea de 3' UTRs e a passagem de milhares de genes. Este aumento na capacidade de sequenciamento exigiu o desenvolvimento de algoritmos de bioinformatic para analisar os dados envolvendo poliadenilação alternativa da extremidade 3'. Para a detecção de novo ou validação do PAS e, portanto, mapeamento da extremidade 3' de genes individuais de dados de sequenciamento em larga escala, 3' corrida continua a ser o método de escolha^4,5. As sequências incluídas em produtos de cDNA de 3' corrida normalmente incluem apenas uma parte do 3' UTR que contém a cauda poli (a), o local de clivagem, o PAS, sequências e o montante do PAS. Ao contrário do PCR, que requer a concepção e utilização do gene específico para diante e reverso primeiras demão, 3' corrida requer apenas duas gene específico aninhado frente primeiras demão. Daí, a PCR requer um conhecimento mais detalhado da sequência de nucleotídeos de uma grande região do gene sendo amplificado^4,6. Desde 3' corrida usa o mesmo inverter a primeira demão que metas a poli (a) cauda para todos polyadenylated RNA transcritos, somente os primers para a frente devem ser gene específico, assim, exigindo apenas conhecimento de uma região significativamente menor do mRNA. Isso permite que a amplificação das regiões cujas sequências não são inteiramente caracterizado^4,7. Isto permitiu 3' corrida para ser usado não somente para determinar a extremidade 3' de um gene, mas para também determinar e caracterizar regiões grandes montante do PAS que formam uma parcela significativa de 3' UTR. Combinando 5' corrida com o modificado 3' corrida que inclui porções maiores de 3' UTR e flanqueiam regiões, é possível totalmente sequenciar ou clonar uma transcrição de mRNA inteira da extremidade 5' para seus 3' final⁸.

Um exemplo desta aplicação de modificado 3' corrida é a identificação recente de um romance CCND1-MRCK transcrição de gene de fusão de linhas de células do linfoma de células do manto e pacientes com câncer. O 3' UTR consistia de sequências de genes de ambos os CCND1 e MRCK e foi recalcitrantes a miRNA Regulamento⁹. Os dois aninhados CCND1 específicos frente primers foram complementares à região imediatamente adjacente e a jusante do CCND1 códon de parada. Embora toda transcriptoma sequenciamento juntamente com ferramentas de bioinformatic específico pode ser usado para detectar fusões gene dentro do 3' UTR¹⁰, muitos laboratórios podem não ter os recursos financeiros ou bioinformatic perícia para fazer uso desta tecnologia. Portanto, 3' corrida é uma alternativa para novo de identificação e validação de genes de fusão novela envolvendo a 3' UTR. Considerando o drástico aumento no número de genes de fusão relatados, bem como ler as transcrições, 3' corrida tornou-se uma poderosa ferramenta na caracterização de gene sequências^11,12. Além disso, estudos recentes demonstraram que diferentes sequências dentro a 3' UTR, bem como o comprimento de 3' UTR pode afetar a estabilidade de transcrição do mRNA, localização, Traduzibilidade próprios e função¹³. Devido em parte ao crescente interesse no mapeamento da transcriptoma, tem havido um aumento no número de diferentes polimerases de DNA, sendo desenvolvido para uso em laboratório. É importante determinar que tipos de modificações podem ser feitos para o 3' protocolo de corrida em a fim de utilizar o repertório disponível de polimerases de DNA.

Este trabalho de adaptação 3' corrida para mapear o inteiro 3' UTR de relatórios, o PAS e 3' final local de clivagem da transcrição de ANKHD1 usando aninhados cartilhas dentro da seção de ANKHD1 de transcrição e dois diferentes polimerases de DNA.

Protocolo

Vestir um jaleco, luvas e óculos de segurança em todos os momentos durante a execução de todos os procedimentos no presente protocolo. Certifique-se que recipientes/tubos contendo o reagente de isotiocianato de fenol e guanidina só são abertos em um capuz certificada e descarte de resíduos de fenol em um recipiente designado. Use os reagentes, dicas e tubos estéreis DNAse/RNAse-livre.

1. cultura de pilha

1. Crescer a linhagem de células HeLa e dois suspensão manto linfoma célula linhas celulares, Granta-519 e Jeko-1, em DMEM contendo 10% FBS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina em uma incubadora umidificada com 5% CO₂ a 37 ° C. Diluir as células 01:10... e contar usando um contador de partículas¹⁴.
2. Para a extração de RNA, placa 500.000 células/poço em um prato bem 6 (mídia de 2 mL por alvéolo). Após incubação de 24h, colete o RNA das células.

2. extração do RNA

1. Colheita de células
   Nota: Com exceção da etapa de centrifugação, execute todas as etapas listadas em um capuz de cultura de tecidos para manter a esterilidade.
   1. Para células de suspensão (Jeko-1 e Granta-519):
      1. Transfira as células (juntamente com 2 mL de mídia) para um tubo de 15 mL e centrifugar a 1.725 x g, durante 5 min. Aspire a mídia e deixar o centrifugado no fundo do tubo.
      2. Ressuspender as células em 50 µ l de 1 x salino de tampão fosfato (PBS). Adicione 500 µ l de reagente de isotiocianato de fenol e guanidina monofásico para cada amostra no tubo de microcentrifuga de 1,5 mL. Misture bem e deixe em temperatura ambiente (RT) por 5 min enquanto inversão do tubo microcentrifuga cada 1 min.
   2. Para células aderentes (HeLa):
      1. Aspire o meio de cultura celular de cada poço. Adicione 1 mL de PBS a cada poço para lavar fora os detritos.
      2. Remova a PBS e adicione 500 µ l de reagente de isotiocianato de fenol e guanidina monofásico para cada poço.
      3. Incube a RT por 5 min com balanço suave. Transfira para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
2. Lise celular
   1. Congele a mistura de célula isotiocianato fenol e guanidina a-20 º C por 1h.
      Nota: A mistura pode ser deixada a-20 ° C durante a noite ou até que seja necessário.
   2. Descongele o fenol e guanidina isotiocianato mistura de células no gelo. Adicione 100 µ l de clorofórmio para o tubo de microcentrifugadora em uma capa PCR. Vórtice a amostra para 10-15 s até que a mistura é opaco e cor de rosa. Incube a amostra no gelo (a 4 ° C) por 15 min.
   3. Centrifugar a amostra por 15 min a 20.800 x g e 4 ° C. Remova cuidadosamente a fase aquosa incolor superior (~ 200 µ l) e a transferência para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
3. Precipitação do RNA
   1. Adicione um volume igual de isopropanol para cada amostra. Adicione 1 µ l de coprecipitant (consulte a Tabela de materiais) para cada amostra para agir como um portador para o RNA e ajudar a visualizar o RNA em etapas subsequentes. Incube a amostra a-80 ° C durante pelo menos 4 h. Para melhores resultados, incubar durante uma noite a-80 ° C.
   2. Transferi a amostra para uma centrífuga de refrigeração. Centrífuga para 35 min a 20.800 x g / 4 ° C; o RNA aparecerá como uma mancha azul na parte inferior do tubo. Remova cuidadosamente o isopropanol da amostra. Adicionar 500 µ l de etanol 80% e resuspenda o pellet vortexing brevemente por 3 s.
   3. Centrifugue a amostra a 20.800 x g em RT 5 min. Retire todo o etanol da amostra. Deixe a amostra secar ao ar por cerca de 10 min. Ressuspender a amostra em 35 µ l de água livre de RNAse. Coloque em um bloco de calor (65 ° C) por 5 min garantir que o RNA é totalmente em solução e imediatamente colocar o tubo no gelo.
   4. Determine a concentração de RNA total usando um spectrophotometer conforme descrito anteriormente, exceto o uso de 1,5 µ l da amostra do RNA em vez de 1 µ l¹⁵. Opcionalmente, execute 1 µ g de RNA total em um gel de agarose a 1% para determinar a integridade do RNA.

3. DNase tratamento

1. Após a quantificação do RNA, realizar o tratamento de DNAse sobre o RNA total de degradar qualquer DNA genômico. Para cada amostra, adicione os seguintes reagentes do kit de DNAse RNAse-livre para fazer uma reação de total de 20 µ l misture em um tubo de microcentrifugadora separada:
   1. Misture 2 µ l de DNase 10 X amortecedor da reação com 4,4 µ g de RNA total. Trazer para um total de 14 µ l com água.
   2. Adicione 2 µ l de RNase-livres DNAse. Incube a 37 ° C por 30 min na presença de 2 µ l de inibidor de RNase (do Kit de transcrição reversa).
   3. Adicione 2 µ l da solução de paragem e calor em um bloco de calor por 10 min a 70 ° C para inativar a enzima DNAse.
      Nota: O tratamento de DNAse é opcional.

4. síntese de cDNA

Para um volume final de reação de 50 µ l:

1. Para um volume final de reação de 50 µ l: transferência 22 µ l do DNase tratados RNA para um novo tubo ou transferência 4 µ g de RNA total com água adicionada a um volume total de 22 µ l para um novo tubo. Adicione 2 µ l da T7 oligo dT₂₅ primeira demão da solução de primer 10 µM. A sequência para o primer de₂₅ T7 oligo dT é 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
2. O kit de transcrição reversa adicione 2 µ l do inibidor de RNase (20 U / µ l), 8 µ l de tampão de reação a 5x, 4 µ l de dNTPs 10 mM e 2 µ l da transcriptase reversa (200 U / µ l).
   Nota: Configure uma reação sem transcriptase reversa para atuar como um controle negativo.
3. Incube a 42 ° C por 1 h. transferência diretamente para o gelo. Aqueça o tubo a 75 ° C por 5 min e colocar o tubo no gelo.

5. primer busca de transcrição do Gene de fusão

1. Projeto da primeira demão
   1. Baixar a sequência do cDNA do navegador genoma Ensemble (ENST00000360839.6/NM_017747) e identificar uma região dentro a ORF da transcrição alvo (ANKHD1) montante do códon de parada. Copie e cole a toda a região (até 700 nucleotídeos) que contêm sequências montante do códon de parada para a região de entrada de sequência de software do projeto da primeira demão (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
   2. Selecione a opção de design personalizado exibir e selecionar 10 para o número de primers que o sistema deve gerar (resultados retorno) e deixar todos os outros parâmetros definidos como padrão.
   3. Escolha cinco primers para a frente e duas primeiras demão reversos que não se sobreponham. Ordenar as primeiras demão e reconstituir com água RNAse/DNAse-livre para uma concentração final de 10 µM. Mais detalhes sobre o projeto da primeira demão geral para PCR são cobertos em outro lugar¹⁶.
2. PCR para identificar potenciais primers para uso em subsequentes 3' corrida
   Nota: Para determinar os finais frente primers para usar na reação, teste os primers projetados pela criação de combinações diferentes de primers para diante e reversos para o PCR regular em uma capa PCR.
   1. Transferi o cDNA (2 µ l) para um tubo PCR de 0,5 mL. Adicione 1 µ l do primer para a frente e 1 µ l do primer reverso (a partir de uma solução de primeira demão de 10 mM). Fazer até 12,5 µ l adicionando 8,5 µ l de água livre de nuclease. Adicione 12,5 µ l do 2 x Gel-para-PCR Master Mix.
   2. Use as seguintes condições ciclagem térmicas de PCR: 95 ° C por 2 min, seguido por 29 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 1 min. definir o ciclo final a 68 ° C por 7 min.
   3. Após a PCR, execute os produtos em um gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. Detalhes de eletroforese são como descritos anteriormente com algumas modificações¹⁷.
      1. Dissolva 1 g de agarose em 100 mL de tampão Tris-Acetato (TAE) em um balão de 250 mL. Ferver no microondas.
      2. Deixar arrefecer durante 1 min e adicionar 7,5 µ l de solução de brometo de etídio (estoque de 10 mg/mL) em uma coifa. Misturar bem, agitando o frasco e despeje em um aparelho de gel horizontal. Deixe às RT a coifa pelo menos 30 min permitir que o gel solidificar.
      3. Cubra o gel com 1 x TAE de buffer e carregar 10 µ l do produto do PCR para o gel de agarose juntamente com 3 a 5 µ l de escada do peso molecular de ADN. Em 175 V por 10 min. Visualizar os produtos usando um gerador de imagens ou se ainda mais a separação de produtos for necessária, execute o gel para um adicional 5-10 min.
3. Seleção de primers aninhados para 3' corrida
   1. Analise os resultados do gel do agarose PCR para selecionar primários que têm uma banda única, distinta e forte do PCR. Usar o primer mais 5' (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') juntamente com a primeira demão₂₅ oligodT T7 em PCR primeiro executar.
   2. Selecione o primer aninhado que está localizado a jusante do primeiro primer (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') e usá-lo com o primer T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') no segundo conjunto de reações de PCR.

6. otimização 3' corrida para mapear o 3' UTR usando duas enzimas diferentes

Nota: Tem havido um aumento na diversidade de polimerases de DNA usado para PCR; Portanto, nós queríamos determinar condições padrão que podem ser aplicadas mesmo quando usando enzimas diferentes para reações de PCR de corrida de 3'. Primers para qualquer transcrição reversos são mantidos constantes; as únicas mudanças são nos primers frente aninhados que são específicos para a transcrição do alvo.

1. Protocolo 1:3 ' corrida usando uma polimerase de DNA modificada de Pyrococcus furiosus (Pfu)
   1. Primeiro PCR
      1. Transferir 1 μL de cDNA para um tubo PCR e adicionar 5 µ l de buffer de reação 10 x Pfu . Adicione 1 µ l da primeira cartilha frente aninhada, 1 µ l do primer T7 oligodT₂₅ e 1 µ l de dNTPs (a partir de uma solução de 10 mM).
      2. Fazer o volume total de até 49 µ l adicionando 40 µ l de água. Adicione 1 µ l de Pfu DNA polimerase e misture bem. Execute o PCR usando o perfil PCR na tabela 1.
   2. Segundo PCR
      1. Transferir 2 µ l dos produtos de PCR primeiro para um novo tubo PCR e misturar com 5 µ l de buffer de reação Ultra II de Pfu10 x. Adicione 1 µ l do segundo primer PCR aninhado, 1 µ l do T7 primer e 1 µ l de dNTPs (solução de 10 mM).
      2. Fazer até 49 µ l total reaccional adicionando 39 µ l de água. Adicione 1 µ l de Pfu DNA polimerase. Execute o PCR usando o mesmo perfil PCR como a primeira instalação PCR (tabela 1).
2. Protocolo 2:3 ' corrida usando uma DNA polimerase quimérico, consistindo de um domínio de ligação do DNA fundido a um Pyrococcus-como revisão mistura de mestre polimerase PCR
   1. Primeiro PCR
      1. Transferi 1 μL de cDNA para um tubo PCR. Adicione 1 µ l do primeiro primer aninhado para a frente e 1 µ l do primer T7 oligodT₂₅ . Fazer até 25 µ l adicionando 22 µ l de água.
      2. Adicione 25 µ l de 2 x PCR Master Mix e misture bem. Use as condições PCR ciclismo descritas na tabela 2.
   2. Segundo PCR
      1. Transferi 2 µ l dos produtos de PCR primeiro para um novo tubo de PCR. Adicione 1 µ l do segundo primer PCR aninhado junto com 1 µ l do T7 primer reverso.
      2. Fazer até 25 µ l adicionando 22 µ l de água. Adicione 25 µ l de 2 X PCR Master Mix. Execute o PCR usando o mesmo perfil PCR como a primeira instalação PCR (tabela 2).

7. Verifique se o segundo produto PCR de 3' corrida.

1. Tome 5 a 10 µ l do segundo produto da PCR (bem como produto da primeira rodada de PCRs se a transcrição é abundantemente expressa) e executar em um gel de agarose. Configurar o gel e executar a eletroforese como descrito anteriormente (passos 5.2.3.1 para 5.2.3.3). Visualize resultados em uma imagem.

8. sequenciamento e purificação do produto

1. Purifica os produtos PCR gel de segunda PCR usando o Gel e sistema de Clean-Up do PCR fragmento de DNA, conforme o protocolo do fabricante.
2. Executar Sanger sequenciamento (em alternativa, enviar o gel purificada primers de sequenciamento adequado para um laboratório de sequenciamento e amostras de produtos PCR). Analisar os dados de sequenciamento Sanger após o sequenciamento.
3. Download de software de análise de sequência (ver Tabela de materiais) e importar os arquivos de rastreamento para o software. Uso o individual pura Base QVs (qualidade valores) para obter a Base chamar informações¹⁸. Baixe o cromatograma com traços de alta qualidade para visualização.
   Opcional: O produto purificado de gel pode ser clonado usando um kit de clonagem apropriado e os clones isolados enviados para Sanger sequenciamento.

Resultados

Pesquisa de Primer frente aninhados:

O gel de agarose de A Figura 1 mostra dois produtos distintos de gel PCR (faixas 1 e 2) que uso o mesmo encaminhar a cartilha mas diferentes cartilhas reversos. 3 Lane tem um produto PCR distinto e tem uma distinta cartilha frente e verso. Os primers ideais para usar para a reação de PCR com base são aqueles que dão um produto PCR distinto (faix...

Discussão

Apesar do advento das tecnologias de sequenciação paralelo maciço, numa base de gene-gene-por, 3' corrida continua a ser o método mais fácil e mais econômico para identificar o PAS e nucleotídeos adjacentes à cauda poli (a). A adaptação descrita aqui expande usando 3' corrida para amplificar e mapear sequências que incluem uma parte da ORF, o códon de parada e o inteiro 3' UTR a transcrição do mRNA de ANKHD1 . Uma grande vantagem do 3' corrida é que, com algumas adaptações menores, produtos de 3...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.