Адаптация 3' Быстрая амплификация CDNA заканчивается для сопоставления стенограммы в раке

Резюме

Два разных 3' быстрого амплификация cDNA концы (3' гонки) протоколы описанных здесь делают использование двух разных ДНК полимеразы для сопоставления последовательности, которые включают сегмент кадр открытом чтения (ORF), стоп-кодон, и всего 3' УТР Стенограмма с помощью РНК полученные от разных рак клеточных линий.

Аннотация

Созревание эукариотические мРНК включает в себя 3' конца образование, которое включает в себя добавление poly(A) хвост. Для того, чтобы карта 3' конца гена, традиционным методом выбора является 3' быстрого амплификация cDNA концы (3' гонки). Протоколы для 3' гонки требуют тщательного проектирования и выбора вложенных грунтовки в течение 3' непереведенные региона (3' УТР) целевого гена интереса. Однако с несколькими изменениями протокол может использоваться для включения всего 3' УТР и последовательности в рамках открытого чтение (ORF), обеспечивая более полное представление о взаимосвязи между ОРФ и 3' УТР. Это в дополнение к идентификации сплайсингу сигнала (ССА), а также на сайте расщепления и сплайсингу, предоставляемый обычных 3' гонки. Расширенный 3' РАСЫ может обнаружить необычные 3' необычных, включая гена сплавливания в течение 3' УТР, и последовательность информация может использоваться для прогнозирования потенциальных Мирна привязки сайтов, а также AU богатые дестабилизирующих элементов, которые могут повлиять на стабильность транскрипт.

Введение

Формирование 3' конца является важнейшим шагом в мРНК созревания, который включает расщепления пре мРНК вниз по течению ПА с последующим добавлением ~ 250 untemplated adenines, которые составляют^1,хвост poly(A)². Poly(A) привязки белка (РАВР) связывается с poly(A) хвост, и это защищает мРНК Стенограмма от деградации и облегчает перевод¹.

Текущие оценки показывают, что 70% генов человека несколько перевал и таким образом пройти альтернативный сплайсингу, что приводит к несколько 3' конца³. Таким образом важно определить, где хвост poly(A) придает остальной части 3' УТР, а так же определить PAS, используемые любой данной транскрипт. С появлением следующего поколения секвенирования привело к одновременной идентификации 3' необычных и перевал тысяч генов. Это увеличение возможности виртуализации требуется разработка bioinformatic алгоритмов для анализа данных, связанных с альтернативными сплайсингу 3' конца. Для обнаружения de novo или проверки системы служебной аттестации и следовательно сопоставления 3' конца отдельных генов из последовательности данных большого объема 3' гонки остается метод выбора^4,5. Последовательностей, обычно включаются в cDNA продукции 3' РАСЫ включают только часть 3' УТР, содержащий poly(A) хвост, на сайте расщепления, ССА и последовательности вверх по течению ССА. В отличие от PCR, который требует разработки и использования конкретных прямого и обратного праймеров гена, 3' гонка требует только два гена конкретных вложенных вперед грунтовки. Следовательно PCR требует более детального знания нуклеотидной последовательности гена, усиленные^4,6большого региона. С 3' гонка использует то же обратный грунтовка, что цели, poly(A) хвост для всех polyadenylated РНК стенограммы, только вперед грунтовки должны быть ген конкретные, таким образом, только требует знания значительно меньше региона мРНК. Это позволяет амплификацию регионов, чьи последовательности не являются полностью характеризуется^4,7. Это позволило 3' гонки использоваться не только для определения 3' конца гена, но также определить и охарактеризовать крупных регионах вверх по течению ССА, которые составляют значительную часть 3' УТР. Объединив 5' гонки с модифицированных 3' раса, которая включает в себя большие части 3' УТР и фланкируя регионов, можно полностью последовательности или клонировать весь мРНК Стенограмма от 5' конца его 3' конца⁸.

Пример этого применения модифицированных 3' гонка является недавнее идентификация Роман CCND1-MRCK фьюжн гена Стенограмма от линии Мантия клеточная лимфома клетки и больных раком. 3' УТР состояла из последовательностей из как CCND1 , так и MRCK генов и был непокорным Мирна правила⁹. Два вложенных CCND1 конкретных вперед грунтовки дополняют региона непосредственно прилегающих и вниз по течению от CCND1 остановки кодон. Хотя весь транскриптом последовательности вместе с конкретными bioinformatic инструменты могут использоваться для обнаружения гена сплавливания в течение 3' УТР¹⁰, многие лаборатории могут не хватает финансовых ресурсов или bioinformatic опыт, чтобы сделать использование этой технологии. Следовательно 3' гонка является альтернативой для de novo идентификации и проверки Роман фьюжн генов, связанных с 3' УТР. Учитывая резкое увеличение числа зарегистрированных фьюжн генов, а также прочитать транскрипты, 3' гонка стала мощным инструментом в характеристике генных последовательностей^11,12. Кроме того недавние исследования показали, что различные последовательности в течение 3' УТР, а также длина 3' УТР может повлиять на стенограмму стабильность мРНК, локализации, переводимости и функции¹³. Отчасти объясняется повышенный интерес в сопоставлении транскриптом, наблюдается увеличение числа различных ДНК-полимеразы, разрабатываются для использования в лаборатории. Важно определить, какие типы изменений можно внести 3' гонка протокола для того, чтобы использовать доступные репертуар полимераз.

Эта работа, доклады адаптации 3' гонки на карте всего 3' УТР, PAS и 3' конца расщепления сайт ANKHD1 транскрипт с помощью вложенных грунтовки в рамках секции ANKHD1 транскрипт и два разных полимераз.

протокол

Носите пальто лаборатории, перчатки и защитные очки во все времена во время выполнения всех процедур в этом протоколе. Убедитесь, что контейнеры/пробирки, содержащие фенол и гуанидина реагент Изотиоцианаты открыт только в сертифицированных капот и утилизации отходов фенола в указанный контейнер. Используйте DNAse/РНКазы свободный стерильных трубок, советы и реагенты.

1. клеточная культура

1. Растут линии клетки HeLa и два подвеска мантии Сотовый лимфома клеточных линий, Granta-519 и Jeko-1, в среде DMEM, содержащие 10% FBS и 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина в увлажненные инкубатор с 5% CO₂ при 37 ° C. Разбавьте 1:10 клеток и рассчитывать, с помощью счетчика частиц¹⁴.
2. Для извлечения РНК тарелка 500000 клеток/хорошо в 6 хорошо пластины (2 мл СМИ за хорошо). После инкубации в течение 24 ч Соберите РНК из клеток.

2. РНК добыча

1. Клетки для сбора урожая
   Примечание: За исключением шаг центрифугирования, выполните все перечисленные в культуре ткани капюшоном для поддержания стерильности.
   1. Для подвески клеток (Jeko-1 и Granta-519):
      1. Передать 15 мл, клетки (совместно с 2 мл СМИ) и центрифуги в 1725 x g 5 мин аспирата СМИ и оставьте ячейку Пелле в нижней части трубки.
      2. Ресуспензируйте Пелле клеток в 50 мкл 1 x Buffered фосфатный (PBS). Добавьте 500 мкл Реагента Изотиоцианаты фенола и гуанидина монофазные каждого образца в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Хорошо перемешать и оставить при комнатной температуре (RT) за 5 мин при этом инвертирование пробки microcentrifuge каждые 1 мин.
   2. Для адэрентных клеток (HeLa):
      1. Аспирационная СМИ культуры клеток от каждой скважины. Добавьте 1 mL PBS в каждой скважине смыть мусора.
      2. Удаление PBS и добавьте 500 мкл Реагента Изотиоцианаты фенола и гуанидина монофазные каждой скважины.
      3. Инкубируйте на RT на 5 мин с плавное покачивание. Переезд в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
2. Лизис клеток
   1. Заморозить смесь клеток Изотиоцианаты фенола и гуанидина при-20 ° C для 1 h.
      Примечание: Смеси можно оставить при-20 ° C на ночь или пока он не понадобится.
   2. Оттепель фенола и гуанидина смесь Изотиоцианаты клеток на льду. Добавьте 100 мкл хлороформ microcentrifuge трубки в капюшоне ПЦР. Вихрь образца для 10-15 s до тех пор, пока смесь не розовый и непрозрачным. Проинкубируйте образцы на льду (при 4 ° C) для 15 мин.
   3. Центрифугуйте образцы для 15 мин при 20800 x g и 4 ° C. Осторожно удалите верхний бесцветный водной фазе (~ 200 мкл) и передачи в новые пробки microcentrifuge 1,5 мл.
3. РНК осадков
   1. Добавьте равное количество изопропиловый спирт для каждого образца. 1 мкл coprecipitant (см. Таблицу материалы) для каждого образца в качестве носителя для РНК и помогают визуализировать РНК в последующих шагах. Инкубируйте образца при температуре-80 ° C для по крайней мере 4 ч. Для достижения наилучших результатов Инкубируйте на ночь-80 ° c.
   2. Передать образец охлажденной центрифуге. Центрифуги для 35 мин при 20 800 x g / 4 ° C; РНК будет отображаться как голубое пятнышко на нижней части трубки. Осторожно удалите изопропиловый спирт из образца. Добавьте 500 мкл 80% этанола и Ресуспензируйте гранулы, кратко vortexing для 3 s.
   3. Центрифуга образца на 20 800 x g на RT на 5 мин удалить все этанола из образца. Пусть пример воздушно-сухой для около 10 мин Ресуспензируйте образца в 35 мкл РНКазы свободной воды. Место на блоке тепла (65 ° C) на 5 минут, чтобы обеспечить полностью РНК в растворе и сразу же поместить трубку на льду.
   4. Определите концентрацию общего РНК с помощью спектрофотометра, как описано ранее, за исключением использования 1.5 мкл пример РНК вместо 1 мкл¹⁵. При необходимости выполните 1 мкг всего РНК на геле агарозы 1% для определения целостности РНК.

3. DNase лечение

1. После количественного определения РНК выполните DNAse лечение всего РНК ухудшить любые геномной ДНК. Для каждого образца добавьте следующие реагенты из комплекта свободных РНКазы DNAse сделать 20 мкл общая реакция Смешайте в отдельной microcentrifuge трубки:
   1. Смешайте 2 мкл DNase 10 X буфер реакции с 4,4 мкг всего РНК. Довести до в общей сложности 14 мкл с водой.
   2. 2 мкл DNAse РНКазы бесплатно. Инкубируйте при 37 ° C за 30 минут в присутствии 2 мкл АБС битор РНКазы (от обратного транскрипции Кит).
   3. Добавьте 2 мкл стоп решения и тепла на блоке тепла для 10 мин при 70 ° C для инактивации ферментов DNAse.
      Примечание: DNAse лечение является обязательным.

4. синтез cDNA

Для окончательной реакции объем 50 мкл:

1. Для окончательной реакции объем 50 мкл: 22 передачи мкл DNase лечение РНК к новой пробке или передачи 4 мкг всего РНК с добавлением воды до общего объема 22 мкл к новой пробке. 2 мкл T7 oligo dT₂₅ грунт, от 10 мкм грунтовочный раствор. Последовательность для dT₂₅ T7 oligo грунтовка 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'.
2. От обратного транскрипции Кит добавить 2 мкл АБС битор РНКазы (20 U/мкл), 8 мкл буфера реакции 5 x, 4 мкл дНТФ 10 мм и 2 мкл обратной транскриптазы (200 U/мкл).
   Примечание: Настройка реакции без обратной транскриптазы в качестве отрицательного контроля.
3. Инкубируйте на 42 ° C в течение 1 ч. передачи прямо на льду. Тепловые трубки при 75 ° C за 5 мин и поместить трубку на льду.

5. грунтовка Поиск Транскрипт гена Fusion

1. Конструкция праймера
   1. Скачать последовательность кДНК из ансамбля генома браузер (ENST00000360839.6/NM_017747) и определить область в пределах ORF целевой Стенограмма (ANKHD1) вверх по течению стоп-кодон. Скопировать и вставить весь регион (до 700 нуклеотидов), содержащих последовательности вверх по течению стоп-кодон в регионе запись последовательности программного обеспечения дизайн праймера (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
   2. Выберите параметр пользовательский дизайн Показать и выберите 10 количество грунтовки система должна генерировать (результаты для возврата) и оставьте все остальные параметры присвоено значение по умолчанию.
   3. Выберите пять вперед грунты и два Обратный грунты, которые не перекрываются. Заказать грунты и воссоздания РНКазы/DNAse свободной водой до конечной концентрации 10 мкм. Подробнее об общих грунтовка дизайн для ПЦР покрыты других¹⁶.
2. ПЦР для выявления потенциальных Праймеры для использования в последующих 3' гонки
   Примечание: Чтобы определить окончательный вперед Праймеры для использования в реакции, тест разработан праймеры, создав различные сочетания прямых и обратных праймеров для регулярного ПЦР в капюшоне ПЦР.
   1. Передать свежие 0,5 мл ПЦР-пробирку cDNA (2 мкл). Добавьте 1 мкл вперед грунтовка и 1 мкл обратный праймера (от 10 мм грунтовочный раствор). Сделайте до 12,5 мкл, добавив 8.5 мкл воды, свободной от нуклеиназы. 12,5 мкл 2 x ПЦР гель Мастер микс.
   2. Используйте следующие тепловой Велоспорт условия PCR: 95 ° C в течение 2 мин, после чего 29 циклов 95 ° c за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 1 мин установлен окончательный цикл на 68 ° C за 7 мин.
   3. После ПЦР запустите продукцию на окрашенных бромидом ethidium гель агарозы 1%. Подробная информация о электрофореза как описано несколько модификаций¹⁷.
      1. Растворите 1 g агарозы в 100 мл буфера Tris-ацетат (ТЭ) в 250 мл флакон. Отварить в микроволновую печь.
      2. Оставить, чтобы охладить в течение 1 мин и 7,5 мкл раствора бромид ethidium (10 мг/мл бульона) в зонта. Смешайте хорошо закрученного колбу и вылить в горизонтальной гель аппарат. Оставьте на RT в вытяжной шкаф для по крайней мере 30 минут, чтобы позволить гель для закрепления.
      3. Покрытие гель с 1 x TAE буфера и загрузить 10 мкл продукта ПЦР на гель агарозы вместе с 3-5 мкл лестница ДНК молекулярной массой. На 175 V за 10 мин визуализировать и продуктов с использованием формирователь изображений и если необходима дальнейшая разделения продуктов, Побегите гель для еще 5-10 мин.
3. Выбор вложенных Праймеры для 3' гонки
   1. Анализировать результаты ПЦР геля агарозы для выбора грунты, которые имеют собственный, сильный, одной группы ПЦР. Используйте 5'-большинство грунт (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') вместе с T7 oligodT₂₅ грунт в первый PCR запуска.
   2. Выберите вложенные грунт, который расположен ниже по течению от первого праймера (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') и использовать его с праймером T7 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') во втором наборе реакций PCR.

6. Оптимизация 3' гонки на карте 3' УТР, с использованием двух различных ферментов

Примечание: Наблюдается увеличение разнообразия ДНК полимеразы используемые для ПЦР; Таким образом мы хотели, чтобы определить стандартные условия, которые могут применяться даже при использовании разных ферментов для 3' гонка ПЦР-реакции. Обратный Праймеры для любого Стенограмма являются неизменным; Единственные изменения находятся в вложенные вперед грунты, которые являются специфическими для целевого транскрипт.

1. Протокол 1:3 ' гонка с использованием измененных ДНК-полимераза из Pyrococcus furiosus (ОРП)
   1. Первый PCR
      1. Передача 1 мкл cDNA в ПЦР-пробирку и 5 мкл 10 x Pfu реакции буфера. Добавьте 1 мкл первого вложенного вперед праймера, 1 мкл T7 грунтовка oligodT₂₅ и 1 мкл дНТФ (из раствора 10 мм).
      2. Сделайте до 49 мкл общий объем, добавив 40 мкл воды. 1 мкл Pfu ДНК полимеразы и хорошо перемешать. Запустите PCR, используя профиль ПЦР в таблице 1.
   2. Второй ПЦР
      1. Передать новые ПЦР-пробирку 2 мкл продукции от первого ПЦР и смешать с 5 мкл 10 x PfuUltra II реакция буфера. Добавьте 1 мкл второй вложенных праймера PCR, 1 мкл T7 праймера и 1 мкл дНТФ (10 мм раствор).
      2. Сделайте до 49 мкл общая реакция тома путем добавления 39 мкл воды. 1 мкл Pfu ДНК полимеразы. Запустите PCR, используя один и тот же профиль PCR как первый PCR установки (Таблица 1).
2. Протокол 2:3 ' гонка с помощью химерных ДНК-полимеразы, состоящий из домена связывания ДНК сливается с Pyrococcus-как корректура полимеразы PCR Мастер микс
   1. Первый PCR
      1. Передача 1 мкл cDNA в ПЦР-пробирку. Добавьте 1 мкл первый грунтовочный слой вложенных вперед и 1 мкл T7 oligodT₂₅ праймера. Сделайте до 25 мкл, добавив 22 мкл воды.
      2. 25 мкл 2 x ПЦР мастер смесь и хорошо перемешать. Использование ПЦР Велоспорт условия, описанные в таблице 2.
   2. Второй ПЦР
      1. Передать 2 мкл продукции от первого ПЦР новый ПЦР-пробирку. 1 мкл второй вложенных праймера PCR вместе с 1 мкл T7 обратный праймера.
      2. Сделайте до 25 мкл, добавив 22 мкл воды. 25 мкл 2 X ПЦР Мастер микс. Запустите PCR, используя один и тот же профиль PCR как первый PCR установки (Таблица 2).

7. Проверьте второй продукт PCR 3' гонки.

1. Принимать 5-10 мкл второй продукт PCR (а также продукт от первого раунда ГКДЗ Если стенограмма обильно выражается) и запустите на геле агарозы. Настройка гель и запустить как описано электрофореза (шаги 5.2.3.1 для 5.2.3.3). Визуализируйте результаты на формирователь изображений.

8. продукт очистки и последовательности

1. Очищение геля продукты PCR от второй ПЦР с использованием геля и ПЦР фрагментов ДНК Clean-Up системы согласно протоколу производителя.
2. Выполнять Сэнгер последовательности (в качестве альтернативы, отправить гель очищенная образцы продуктов ПЦР и соответствующей последовательности грунтовки в лабораторию последовательности). Анализ последовательности данных после Сэнгер последовательности.
3. Скачать программное обеспечение анализа последовательности (см. Таблицу материалы) и импортировать файлы трассировки в программное обеспечение. Использование отдельных чистая база QVs (значения качества) для получения базы вызова информации¹⁸. Скачайте хроматограммы с высоким качеством трассировки для просмотра.
   Дополнительно: Гель очищенный продукт можно клонировать с помощью соответствующей клонирования kit и изолированные клоны, отправлены для Сэнгер последовательности.

Результаты

Поиск вложенных вперед грунтовка:

Гель агарозы от Рисунок 1 показывает два отдельных продуктов ПЦР гель (дорожки 1 и 2), которые используют то же вперед грунтовка, но разные обратный грунтовки. Майна 3 имеет собстве...

Обсуждение

Несмотря на появление массивной параллельной последовательности технологий, на основе гена в геном, 3' гонки по-прежнему остается наиболее простой и экономичный метод для идентификации PAS и нуклеотидов, прилегающих к poly(A) хвост. Адаптация, описанные здесь расширяется с помощью 3' гонки к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.