Indução e Fenotipagem de Insuficiência Cardíaca Aguda Direita em um Grande Modelo Animal de Hipertensão Pulmonar Tromboembolic Crônica

Resumo

Apresentamos um protocolo para induzir e fenótipo uma insuficiência cardíaca direita aguda em um grande modelo animal com hipertensão pulmonar crônica. Este modelo pode ser usado para testar intervenções terapêuticas, desenvolver métricas cardíacas certas ou para melhorar a compreensão da fisiopatologia aguda de insuficiência cardíaca direita.

Resumo

O desenvolvimento de insuficiência cardíaca direita aguda (ARHF) no contexto da hipertensão pulmonar crônica (AP) está associado a desfechos de curto prazo ruins. O fenotipagem morfológica e funcional do ventrículo direito é de particular importância no contexto do comprometimento hemodinâmico em pacientes com ARHF. Aqui, descrevemos um método para induzir ARHF em um modelo animal de PH crônico previamente descrito, e ao fenótipo, dinamicamente, função ventricular direita usando o método padrão-ouro (ou seja, loops PV de volume de pressão) e com um método clinicamente disponível não invasivo (ou seja, ecocardiografia). A AP crônica é induzida pela primeira vez em suínos por ligação da artéria pulmonar esquerda e embolia do lobo inferior direito com cola biológica uma vez por semana durante 5 semanas. Após 16 semanas, o ARHF é induzido pelo carregamento sucessivo de volume usando soro fisiológico seguido de embolia pulmonar iterativa até que a razão da pressão pulmonar sistólica sobre a pressão sistêmica atinja 0,9 ou até que a pressão sistêmica sistólica diminua abaixo de 90 mmHg. A hemodinâmica é restaurada com infusão de dobutamina (de 2,5 μg/kg/min a 7,5 μg/kg/min). Os ciclos fotovoltaicos e a ecocardiografia são realizados durante cada condição. Cada condição requer cerca de 40 minutos para indução, estabilização hemodinâmica e aquisição de dados. Dos 9 animais, 2 morreram imediatamente após embolia pulmonar e 7 completaram o protocolo, que ilustra a curva de aprendizado do modelo. O modelo induziu um aumento de 3 vezes na pressão média da artéria pulmonar. A análise pv-loop mostrou que o acoplamento ventriculo-arterial foi preservado após o carregamento de volume, diminuiu após embolia pulmonar aguda e foi restaurado com dobutamina. Aquisições ecocardiográficas permitiram quantificar parâmetros ventriculares certos de morfologia e função com boa qualidade. Identificamos lesões isquêmicas ventriculares direitas no modelo. O modelo pode ser usado para comparar diferentes tratamentos ou para validar parâmetros não invasivos de morfologia ventricular direita e função no contexto do ARHF.

Introdução

A insuficiência cardíaca direita aguda (ARHF) foi recentemente definida como uma síndrome rapidamente progressiva com congestionamento sistêmico resultante do enchimento ventricular direito (RV) prejudicado e/ou redução da saída de fluxo de ^RV1. ArHF pode ocorrer em várias condições, como insuficiência cardíaca do lado esquerdo, embolia pulmonar aguda, infarto agudo do miocárdio ou hipertensão pulmonar (PH). No caso do PH, o início do ARHF está associado a um risco de 40% de mortalidade a curto prazo ou transplante de pulmão ^urgente2,3,4. Aqui, descrevemos como criar um grande modelo animal de ARHF no cenário de hipertensão pulmonar crônica e como avaliar o ventrículo direito usando ecocardiografia e loops de volume de pressão.

As características fisiopatologológicas do ARHF incluem sobrecarga de pressão do RV, sobrecarga de volume, diminuição da produção de RV, aumento da pressão venosa central e/ou diminuição da pressão sistêmica. Em PH crônico, há um aumento inicial na contratude do RV permitindo preservar a produção cardíaca, apesar do aumento da resistência vascular pulmonar. Portanto, no contexto do ARHF sobre PH crônico, o ventrículo direito pode gerar pressões quase isossistêmicas, particularmente sob suporte inotrópico. Juntos, o ARHF sobre PH crônico e restauração hemodinâmica com inotropos levam ao desenvolvimento de lesões isquêmicas de RV agudas, como descrito recentemente em nosso grande modelo ^animal5. O aumento dos inotrópicos cria uma demanda energética crescente que pode desenvolver ainda mais lesões isquêmicas e, finalmente, levar ao desenvolvimento de disfunção de órgãos finais e desfechos clínicos ruins. No entanto, não há consenso sobre como gerenciar pacientes com ARHF em PH, principalmente no que diz respeito ao manejo de fluidos, inotropos e ao papel do suporte circulatório extra-corpóreo. Consequentemente, um grande modelo animal de insuficiência cardíaca aguda direita pode ajudar a fornecer dados pré-clínicos sobre o manejo clínico arhf.

Como primeiro passo para quantificar a resposta à terapia, são necessários métodos simples e reprodutíveis para fenótipo do ventrículo direito. Até o momento, não há consenso sobre como melhorar o fenótipo da morfologia rv e função dos pacientes com ARHF. O método padrão-ouro para avaliar a contratilidade do RV (ou seja, capacidade intrínseca de contração) e o acoplamento ventriculo-arterial (ou seja, contratilização normalizada por carga posterior ventricular; índice de adaptação ventricular) é a análise de loops de volume de pressão (PV). Este método é duas vezes invasivo porque requer cateterismo cardíaco direito e uma redução transitória na pré-carga rv usando um balão inserido na veia cava inferior. Na prática clínica, são necessários métodos não invasivos e repetitivos para avaliar o ventrículo direito. A ressonância magnética cardíaca (RMC) é considerada como padrão-ouro para avaliação não invasiva do ventrículo direito. Em pacientes com ARHF em AP crônica que são gerenciados em unidade de terapia intensiva (UTI), o uso de RMC pode ser limitado devido à condição hemodinâmica instável do paciente; além disso, as repetidas avaliações da RMC, várias vezes ao dia, inclusive à noite, podem ser limitadas devido ao seu custo e disponibilidade limitada. Por outro lado, a ecocardiografia permite avaliações não invasivas, reprodutíveis e de baixo custo da morfologia e função de RV em pacientes com UTI.

Grandes modelos animais são ideais para realizar estudos pré-clínicos com foco na relação entre parâmetros hemodinâmicos invasivos e parâmetros não invasivos. A grande anatomia de porcos brancos é próxima aos humanos. Consequentemente, a maioria dos parâmetros ecocardiográficos descritos em humanos são quantificáveis em suínos. Existem algumas pequenas variações entre o coração humano e o porco que devem ser levadas em conta para estudos ecocardiográficos. Os porcos apresentam uma dextrocardia constitucional e uma rotação ligeiramente anti-horário do eixo cardíaco. Como resultado, a visão apical de 4 câmaras torna-se uma visão apical de 5 câmaras e a janela acústica está situada abaixo do apêndice xifoide. Além disso, janelas acústicas de eixo longo e curto parasternal estão situadas no lado direito do esterno.

Aqui, descrevemos um novo método para induzir ARHF em um grande modelo animal de PH tromboembólico crônico e restaurar a hemodinâmica usando dobutamina. Também relatamos lesões isquêmicas de RV presentes no modelo dentro de 2-3 horas após restauração hemodinâmica com dobutamina. Além disso, descrevemos como adquirir loops RV PV e parâmetros de RV ecocardiográficos em cada condição fornecendo insights sobre as mudanças dinâmicas na morfologia e função da RV. Como o grande modelo animal de PH tromboembólico crônico e os métodos pv-loop foram descritos ^{anteriormente6}, essas seções serão brevemente descritas. Além disso, foram relatados resultados de avaliações ecocardiográficas que são consideradas potencialmente difíceis em modelos suínos. Explicaremos os métodos para alcançar repetidas ecocardiográficas no modelo.

O modelo de ARHF sobre PH crônico relatado neste estudo pode ser utilizado para comparar diferentes estratégias terapêuticas. Os métodos de fenotipagem rv podem ser usados em outros grandes modelos animais imitando situações clinicamente relevantes, como embolia pulmonar ^aguda7, infarto do miocárdio ^RV8, síndrome de angústia respiratória ^aguda9 ou insuficiência cardíaca direita associada à insuficiência ventricular ^esquerda10 ou suporte mecânico ventricular ^esquerdo11.

Protocolo

O estudo cumpriu os princípios do cuidado laboratorial em animais de acordo com a Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e foi aprovado pelo comitê de ética local para experimentos com animais no Hospital Marie Lannelongue.

1. PH tromboembólico crônico

1. Induzir a AP tromboembólica crônica como descrito ^{anteriormente6,12}.
2. Brevemente, induza um modelo de PH trombo-embólico crônico em cerca de 20 kg de suínos brancos grandes (sus scrofa). Realizar uma ligadura da ligadura pulmonar esquerda através de uma toracotomia esquerda na semana 0 (pericárdio fechado); e realizar semanalmente uma embolização da artéria pulmonar do lobo inferior direito (0,2 mL a 0,4 mL por semana) com uma solução mista composta com 1 mL de cola de tecido mole, incluindo N-butil-2-cianoacrilato e 2 mL de corante de contraste lipídico (lipiodol) por 5 semanas.
3. Realize uma xifoïdectomia na semana 0 no momento da ligadura da artéria pulmonar esquerda para melhorar a viabilidade da ecocardiografia. Para isso, realize uma incisão longitudinal de 4 cm em frente ao processo xifoide. Remova o processo xifoide usando uma faca de diatermia. Feche o plano subcutâneo e a pele com uma sutura em execução.
4. Realize uma embolia pulmonar adicional do lobo inferior direito na semana 10 usando o mesmo protocolo explicado acima (passo 1.2).
5. Realize o modelo de indução ARHF (seção 6) 6 semanas após a última embolização do lobo inferior direito (semana 16) a fim de evitar lesões agudas do coração direito induzidas por embolias pulmonares agudas.
   NOTA: Outro grande modelo animal de insuficiência cardíaca direita pode ser usado, ou outras condições patológicas podem ser induzidas no modelo PH crônica-tromboembólico.

2. Posicionamento animal e colocações de cateter

1. Realize anestesia geral como descrito ^{anteriormente6}.
   1. Resumidamente, deixe o animal jejuar por 12 h. Em seguida, realize uma injeção intramuscular de cloridrato de cetamina (30 mg/kg) para premedicção. Realize um bolus intravenoso de fentanil (0,005 mg/kg), Propofol (2 mg/kg) e cisatracurium (0,3 mg/kg) por via intravenosa através de uma veia de ouvido e entubar não-seletivamente o porco com uma sonda francesa de 7.
   2. Mantenha anestesia geral com isoflurano inalado de 2%, infusão contínua de fentanil (0,004 mg/kg) e propofol (3 mg/kg).
2. Após indução geral da anestesia, posicione o porco nas costas com suas patas dianteiras em uma posição ligeiramente difundida para permitir a aquisição ecocardiográfica parasternal (seção 3).
3. Coloque os eletrodos do dispositivo nos braços e pernas (ecocardiograma, estação de trabalho para aquisições hemodinâmicas) antes da colocação dos campos estéreis.
4. Coloque uma bainha 8-francesa na veia jugular usando o método ^Seldinger13.
   1. Introduza um cateter IV de 18 G (1,3 mm x 48 mm) na veia jugular.
      1. Realize uma punção percutânea na linha média a 2 cm acima do manúbrio com orientação de 45°.
      2. Após obter um refluxo venoso, insira um fio-guia no cateter (0,035 polegadas / 0,089 mm, 180 cm, em ângulo).
      3. Verifique a colocação correta do fio-guia na veia cava superior com fluoroscopia e descarte a baia 8-francesa no fio-guia na veia cava superior.
         NOTA: O fio-guia é colocado corretamente quando passa pela veia cava inferior ao longo da borda direita da coluna vertebral.
5. Realize uma divisão dos vasos femorais direitos para introduzir um cateter preenchido com fluido na artéria femoral direita para monitoramento contínuo de pressão sistêmica e um cateter de dilatação de balão na veia cava inferior através da veia femoral da seguinte forma.
   1. Realize uma incisão transversal de 4 cm na virilha.
   2. Coloque um retrátil de Beckman e divida a face anterior da veia femoral e da artéria femoral usando um fórceps Debackey e uma tesoura Metzenbaum.
   3. Coloque um cateter de 20 G na artéria femoral sob controle visual direto e conecte-o a um transdutor descartável com um cateter cheio de fluido para obter monitoramento contínuo da pressão arterial sistêmica.
      NOTA: A pressão arterial média deve ser continuamente acima de 60 mmHg.
   4. Use um cateter de 18 G para inserir um fio-guia (0,035 polegadas / 0,089 mm, 180 cm, em ângulo) na veia femoral através da cava vena inferior sob controle fluoroscópico.
   5. Insira um cateter de dilatação de balão no fio-guia através da cava vena inferior no nível intraperiádico sob controle fluoroscópico.
6. Realize o controle fluoroscópico com um braço C usando uma visão anteroposterior. Coloque os marcadores visíveis do balão imediatamente acima do nível de diafragma sob controle fluoroscópico. Remova o fio-guia quando o balão estiver colocado.
7. Costuile uma bolsa com uma sutura de monofilamento de polipropileno 5.0 ao redor do cateter de balão de dilatação venosa para evitar sangramento da veia femoral.

3. Ecocardiografia

1. Realize a ecocardiografia logo após o posicionamento animal e a colocação do cateter (seção 2) em animais ainda sob anestesia geral e ventilação mecânica.
2. Adquira cada visão ecocardiográfica no formato cine loop por pelo menos 3 ciclos cardíacos durante a apneia expiratória final.
3. Adquira todas as visualizações nos modos 2-dimension e Tissue Doppler.
4. Adquira a visão apical de 5 câmaras sob o processo xiphoide.
5. Adquira as vistas parasternal curtas e longas do eixo no lado direito do esterno.
6. Adquira fluxo valvular usando modos Doppler contínuos e pulsados.
7. Adquira sinais de Tissue Doppler do anular tríptico lateral e anular mitral lateral e septal.
   NOTA: Utilize as últimas diretrizes para avaliação ecocardiográfica em humanos para aquisições e interpretações ecocardiográficas14.

4. Cateterismo cardíaco direito

1. Realize o cateterismo cardíaco direito após o eco cardíaco (seção 3) e antes das aquisições do loop de volume de pressão (seção 5)
2. Ligue o cateter Swan-Ganz ao transdutor descartável.
3. Introduza o cateter Cisne-Ganz na bainha jugular 8-francesa previamente inserida na veia jugular (seção 2.4) e adquira as pressões médias atrial, ventricular direita e artéria pulmonar. Coloque o cateter sob fluoroscopia, se necessário.
   NOTA: Verifique se os cateteres cheios de fluidos estão bem limpos com soro fisiológico e remova bolhas de ar para evitar o amortecimento do sinal de pressão.
4. Depois de colocar o cateter Cisne-Ganz na artéria pulmonar, meça a saída cardíaca com o método de termodiluição, conforme explicado pelas instruções do fabricante; medir simultaneamente a frequência cardíaca para o cálculo do volume do acidente vascular cerebral.
   1. Certifique-se de que o soro fisiológico está a 4 °C para evitar superestimação da saída cardíaca.
   2. Conecte o transdutor descartável à estação de trabalho PV-loop para aquisições ao vivo de pressões derivadas de cateteres cheios de fluidos.

5. Aquisição de loop de volume de pressão usando o método de condução

NOTA: Esta seção foi publicada ^{anteriormente15}.

1. Introduza o cateter de condução no ventrículo direito sob controle fluoroscópico.
   1. Verifique o sinal de qualidade usando a aquisição " ao vivo" de loops de volume de pressão.
2. Ativar eletrodos adequados para obter o sinal ideal (ou seja, loops PV no sentido anti-horário com forma fisiológica).
3. Acompanhamento das etapas de calibração de pressão e volume do fluxo de trabalho de acordo com a instrução do fabricante (condutividade sanguínea, volume paralelo, calibração do volume do traçado = calibração alfa).
   NOTA: O avc externo com o cateter Swan-Ganz pode ser repetido para cada condição; que as outras etapas de calibração só podem ser realizadas uma vez.
4. Adquirir famílias de ciclo pv em estados estáveis e durante a redução aguda da pré-carga (ou seja, oclusão aguda da veia cava inferior) durante a apneia expiratória final.
5. Realizar pelo menos 3 aquisições por condição (oclusão estável + IVC).

6. Indução de insuficiência cardíaca direita aguda por volume e sobrecarga de pressão (Figura 1).

1. Induzir sobrecarga de volume usando uma infusão salina de 3 passos (cerca de 2 h).
   1. Inicie a primeira infusão de 15 mL/kg de soro fisiológico com uma saída de infusão de fluxo livre.
   2. Realizar as medidas (cateterismo cardíaco direito, laços fotovoltaicos e ecocardiográfico) 5 minutos após estabilização hemodinâmica após o fim de cada infusão.
   3. Inicie a infusão do segundo volume de 15 mL/kg imediatamente após o término das medições.
   4. Inicie a infusão do terceiro volume de 30 mL/kg de soro fisiológico imediatamente após o término das medições.
      ATENÇÃO: O carregamento de volume pode induzir comprometimento hemodinâmico ou edema pulmonar, dependendo do modelo animal utilizado. Neste modelo, o carregamento de volume revelou uma resposta adaptativa caracterizada pelo aumento da produção cardíaca, pressão atrial direita estável e acoplamento ventriculo-arterial preservado.
      NOTA: O carregamento de volume pode ser interrompido em caso de baixa tolerância respiratória ou hemodinâmica.
2. Induzir sobrecarga de pressão com embolia pulmonar iterativa.
   1. Insira um cateter angiográfico francês 5 através da bainha jugular na artéria pulmonar do lobo inferior direito sob controle fluoroscópico.
   2. Embolize a artéria pulmonar do lobo inferior direito com um bolus de 0,15 mL de uma solução mista composta com 1 mL de cola de tecido mole, incluindo N-butil-2-cianoacrilato e 2 mL de corante de contraste lipídico. Lave o cateter com 10 mL de soro fisiológico.
   3. Avalie a resposta hemodinâmica 2 minutos após a embolização usando a pressão sistêmica e a pressão arterial pulmonar.
   4. Repita embolias de 0,15 mL a cada 2 minutos até obter compromisso hemodinâmico ( ou seja, pressão sistêmica sistólica <90 mmHg ou pressão pulmonar sistólica sobre a taxa de pressão sistêmica sistólica >0,9).
      ATENÇÃO: A embolia pulmonar pode induzir um grave comprometimento hemodinâmico, às vezes irreversível, levando à morte imediata. Antes de iniciar a etapa de embolização, esteja pronto para iniciar o suporte hemodinâmico (protocolo de dobutamina ou epinefrina em caso de parada circulatória). Esteja pronto para iniciar loops FOTOVOLTAICOS e monitoramento ecocardiográfico. Como este passo pode estar associado a um compromisso hemodinâmico grave, o cateterismo cardíaco direito usando o cateter Swan-Ganz pode ser evitado de modo a iniciar o suporte de dobutamina mais cedo.

7. Induzir a restauração da hemodinâmica sistêmica com dobutamina

1. Depois de atingir o compromisso hemodinâmico e realizar loops PV e aquisições ecocardiográficas, inicie a infusão de dobutamina a 2,5 μg/kg/min.
   NOTA: Outras drogas ou tratamentos podem ser iniciados neste momento.
2. Espere de 10 a 15 minutos para estabilização hemodinâmica.
3. Realize cateterismo cardíaco direito, loops FOTOVOLTAICOS e aquisições ecocardiográficas.
4. Aumente a dose de infusão de dobutamina para 5 μg/kg/min.
5. Espere 15 min para estabilização hemodinâmica e reincidente aquisições.
6. Repita o cateterismo cardíaco direito, loops PV e aquisições ecocardiográficas.
7. Aumente a dose de infusão de dobutamina para 7,5 μg/kg/min.
   NOTA: Outras doses, medicamentos ou tratamentos podem ser iniciados.

8. Eutanásia e colheita de tecido cardíaco

1. No final do protocolo, realize uma esternotomia mediana usando uma serra oscilante.
2. Abra o pericárdio e injete uma solução letal de cloreto de potássio (0,2 g/kg).
3. Colher o coração; selecionar amostras das paredes livres ventricular direita e esquerda para avaliações patológicas e moleculares.
   NOTA: Os métodos para as avaliações patológicas do ventrículo direito e para as estatísticas foram previamente ^relatados5.

Resultados

Viabilidade
Descrevemos os resultados de 9 procedimentos consecutivos de indução arhf em um modelo CTEPH animal de grande porte relatado ^{anteriormente5}. A duração do protocolo foi de cerca de 6 horas para ser concluída, incluindo indução de anestesia, instalação, colocações de acesso vascular/cateter, indução de sobrecarga de volume/pressão e restauração hemodinâmica, aquisição de dados e eutanásia. Cada condição hemodinâm...

Discussão

Descrevemos um método para modelar as principais características fisiodológicas do ARHF em PH crônico em um grande modelo animal, incluindo sobrecarga de volume e pressão e restauração hemodinâmica com dobutamina. Também relatamos como adquirir dados hemodinâmicos e de imagem para fenótipo das mudanças dinâmicas do ventrículo direito em cada condição criada durante o protocolo. Esses métodos podem fornecer dados de fundo para construir futuros protocolos de pesquisa no campo da ARHF, particularmente no q...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Radiofocus Introducer II	Terumo	RS+B80K10MQ	catheter sheath
Equalizer, Occlusion Ballon Catheter	Boston Scientific	M001171080	ballon for inferior vena cava occlusion
Guidewire	Terumo	GR3506	0.035; angled
Vigilance monitor	Edwards	VGS2V	Swan-Ganz associated monitor
Swan-Ganz	Edwards	131F7	Swan-Ganz catheter 7 F; usable lenghth 110 cm
Echocardiograph; Model: Vivid 9	General Electrics	GAD000810 and H45561FG	Echocardiograph
Probe for echo, M5S-D	General Electrics	M5S-D	Cardiac ultrasound transducer
MPVS-ultra Foundation system	Millar	PL3516B49	Pressure-volume loop unit; includes a powerLab16/35, MPVS-Ultra PV Unit, bioamp and bridge amp and cables
Ventricath 507	Millar	VENTRI-CATH-507	conductance catheter
Lipiodol ultra-fluid	Guerbet	306 216-0	lipidic contrast dye
BD Insyte Autoguard	Becton, Dickinson and Company	381847	IV catheter
Arcadic Varic	Siemens	A91SC-21000-1T-1-7700	C-arm
Prolene 5.0	Ethicon	F1830	polypropilene monofil