Fabricação de dispositivos de refração-índice-combinada para microfluídica biomédica

Resumo

Este protocolo descreve a fabricação de dispositivos microfluídicos de MY133-V2000 eliminar artefatos que surgem frequentemente em microcanais devido os índices de refracção incompatível entre estruturas microchannel e uma solução aquosa. Este protocolo utiliza um suporte de acrílico para comprimir o dispositivo encapsulado, melhorando a adesão tanto quimicamente e mecanicamente.

Resumo

O uso de dispositivos microfluídicos tem emergido como um instrumento decisivo para aplicações biomédicas. Quando combinado com técnicas de microscopia modernas, estes dispositivos podem ser implementados como parte de uma plataforma robusta e capaz de fazer medições complementares simultâneas. O principal desafio criado pela combinação destas duas técnicas é a incompatibilidade no índice de refração entre os materiais tradicionalmente usados para fazer dispositivos microfluídicos e as soluções aquosas, normalmente usadas em biomedicina. Essa incompatibilidade pode criar artefatos ópticos perto das bordas do canal ou dispositivo. Uma solução é reduzir o índice de refração do material usado para fabricar o dispositivo usando um polímero fluorado, tais como MY133-V2000 cujo índice de refração é semelhante da água (n = 1,33). Aqui, a construção de um dispositivo microfluidic feito de MY133-V2000 usando técnicas de litografia macia é demonstrada, usando plasma de O₂ em conjunto com um suporte de acrílico para aumentar a adesão entre o dispositivo MY133-V2000 fabricado e o substrato de polidimetilsiloxano (PDMS). O dispositivo é então testado incubando-lo preenchido com meio de cultura celular para 24 h demonstrar a capacidade do dispositivo para manter as condições de cultura celular no decurso de uma típica experiência de imagem. Finalmente, microscopia de fase quantitativa (QPM) é usada para medir a distribuição de massa no interior das células aderentes ao vivo no microchannel. Desta forma, a maior precisão, habilitado por fabricar o dispositivo a partir de um polímero de baixo índice de refração como MY133-V2000 substituem materiais tradicionais litografia macia como PDMS, é demonstrado. Globalmente, esta abordagem para fabricar dispositivos microfluídicos pode ser facilmente integrada os fluxos de trabalho existentes litografia macia para reduzir artefatos ópticos e aumentar a precisão de medição.

Introdução

O desenvolvimento da tecnologia microfluidic permitiu uma ampla gama de novas técnicas biomédicas que aproveitam a única física da escala microscópica fluxos^1,2. Isso inclui as técnicas de diagnósticos construídas em plataformas microfluidic que quantificam biomarcadores clinicamente relevantes, incluindo a célula rigidez³, marcadores de superfície⁴e crescimento⁵. Manipulando células únicas, dispositivos microfluídicos também podem ser usados para medir a heterogeneidade de biomarcador, por exemplo como indicador de malignidade⁶. A habilidade de combinar microfluidic aplicações com microscopia aumentou ainda mais a utilidade destas plataformas, permitindo que dispositivos que medem vários biomarcadores simultaneamente⁷.

QPM é uma técnica de microscopia que mede a mudança de fase, como a luz atravessa e interage com a matéria dentro de amostras transparentes. A massa de células individuais pode ser calculada a partir de medições de QPM, usando a conhecida relação entre o índice de refração e a densidade de biomassa^8,9. Trabalhos anteriores tem mostrado que QPM é capaz de medir parâmetros clinicamente relevantes, tais como célula crescimento^10,11 e célula propriedades mecânicas através de força¹²de desordem. Quando combinado com microfluídica, QPM potencialmente pode ser usado para medir o comportamento da célula em um ambiente altamente controlado em vitro. Um dos principais desafios combinando QPM com microfluídica é o alto índice de refração da maioria dos polímeros utilizados para construir microfluidic canais através de litografia macia¹³.

Um importante desafio que se coloca a combinação de microfluídica com várias técnicas de microscopia é a incompatibilidade entre o índice de refração do material dispositivo em relação ao índice de refração da água^14,15. Um método de resolver isso é através da utilização de um polímero de baixo índice de refração como CYTOP¹⁶ ou MY133-V2000¹³. O último é um fluorados ultravioleta (UV)-polímero de acrilato curável que tem um índice de refração semelhante da água (n = 1,33) e é compatível com as técnicas de litografia macia, permitindo uma integração suave em muitos microfluidic estabelecida fluxos de trabalho fabricação de dispositivo. Isso torna o MY133-V2000 não somente apropriado para fabricação de dispositivos microfluídicos, mas também lhe permite ser facilmente combinado com QPM e outras abordagens de microscopia, para medir o comportamento da célula na colônia e em uma escala de célula única. MY133-V2000 elimina artefatos devido à fase de desembrulhar, produzindo pouco, se houver, mudança de fase como a luz passa através da interface água-MY133.

Apesar de eliminar a incompatibilidade no índice de refração, um grande desafio associado com os dispositivos fabricados a partir de polímeros fluorados, tais como MY133-V2000, é a baixa aderência a outros materiais como o vidro ou PDMS. O presente trabalho demonstra a fabricação de um dispositivo de MY133-V2000 microfluidic usando litografia macia. Usando o plasma de₂ O para tratar a superfície de ambos o canal e o PDMS substrato combinado com um suporte de acrílico personalizado-fabricadas garante que o dispositivo adota o substrato, criando um canal fechado. Este dispositivo é adequado para cultura de células e QPM, para medir a massa de células no canal, que tem aplicações importantes para medir o crescimento de células vivas e o transporte intracelular de biomassa celular, ambos os quais têm relevância clínica no diagnóstico descoberta de medicamentos e drogas.

Protocolo

1. a fabricação do Polydimethylsiloxane negativo

1. Preparação de polidimetilsiloxano
   1. Medida 18 g de elastômero de silicone PDMS e 1,8 g de reagente de cura. Despeje o reagente de curando em um barco de medição contendo o elastômero.
   2. Misture o elastômero e o reagente curando vigorosamente durante 1 minuto e coloque a mistura em uma câmara de vácuo por 30 min.
   3. Remover o PDMS do vácuo, deitar 15 g para o negativo, usando um cortador de biscoitos (raio = 3,8 cm) para impedir que o PDMS correndo do lado e cubra a restante mistura PDMS.
   4. Coloca o molde contendo o PDMS na câmara de vácuo por 10 min.
   5. Remover o molde contendo o PDMS da câmara de vácuo, coloque-o sobre uma chapa quente, situada a 150 ° C por 60 min curar e cubra com papel alumínio.
   6. Despeje o restante PDMS para um vidro invertido de Petri (10 cm de diâmetro), usando um cortador de biscoitos como um molde, para criar um bloco de PDMS. Ponha isto na câmara de vácuo, até o negativo PDMS é completamente curado.
   7. Transferi a placa de Petri com o PDMS do vácuo para o prato quente pré-aquecido para curar a 150 ° C por 60 min.
2. Tratamento de superfície de plasma de polidimetilsiloxano
   1. Inserir uma afiada lâmina de barbear debaixo do PDMS e o cortador de biscoitos para retirar cuidadosamente o PDMS do negativo.
   2. Use uma faca afiada passatempo para cortar o negativo da maior parte de PDMS; Ele deve ser cortado com bastante área de buffer para anexar outro pedaço de PDMS em cima dela, sem obstruir o negativo.
   3. Inserir uma afiada lâmina de barbear debaixo do PDMS curado com o negativo para remover cuidadosamente o PDMS da caixa de Petri.
   4. Uso uma faca de passatempo para cortar um pedaço de PDMS do pad que é do mesmo tamanho que o pedaço cortada para o negativo. Em seguida, corte um retângulo do novo pedaço de PDMS com espaço suficiente para caber em torno do microchannel quando é colocado em cima do negativo.
   5. Coloque os dois pedaços de PDMS (o negativo e o retângulo) sobre um substrato plano (como um slide feito de vidro, quartzo, poliestireno ou outro material) e inseri-los em um plasma de radiofrequência (RF), líquido de limpeza. Feche a porta e veda a câmara por evacuar o ar usando uma bomba de vácuo. Injete o ar até uma pressão de 400 mTorr usando um controlador de pressão de vácuo digital.
      Nota: Se o substrato utilizado para a limpeza de plasma não tiver sido utilizado no plasma líquido de limpeza, colocá-lo em plasma líquido de limpeza por si só para 60 antes de s para tratar o negativo, para evitar que a camada de base acrílica aderindo ao substrato.
   6. Gire o ajuste de RF de alta, e um plasma rosa ar deve aparecer na janela de visualização. Plasma-tratar os dois pedaços de PDMS por 30 s, em seguida, desligue o ajuste de RF. Permitir que o ar lentamente, reentrar na câmara para evitar que um fluxo de ar turbulento perturbar o conteúdo da câmara.
   7. Remover o PDMS do plasma líquido de limpeza e coloque-o sobre uma bancada. Então, cuidadosamente, inverta o retângulo PDMS sobre o negativo e pressioná-lo com um par de pinças. Deixe descansar por 10 minutos permitir que os dois pedaços de PDMS para aderir uns aos outros.
3. Fluorosilane tratamento de superfície do negativo de polidimetilsiloxano
   1. Usar um conta-gotas para colocar 2 gotas de silano tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-octil) (PFOTS) em um pequeno barco de pesar e inseri-lo em uma câmara de vácuo de vidro.
   2. Inverter o PDMS em um pedaço de papel alumínio (de modo que o negativo microchannel voltado para cima) e colocá-lo na câmara de vácuo de vidro. Em seguida, evacue a câmara continuamente por 24 h.

2. fabricação do MY133 Microchannel

1. Formando a estrutura de microchannel V2000-MY133
   1. Encha o PDMS negativo com 400 µ l de MY133-V2000.
      Nota: O negativo deve ser ligeiramente demasiado cheio.
   2. Coloque o PDMS MY133 V2000-cheio de negativo para a câmara de vácuo para 2h remover quaisquer bolhas.
   3. Remover MY133-V2000 do vácuo e pressione lentamente um slide de vidro contra o topo do negativo ligeiramente sobrecarregado para criar uma superfície plana de MY133-V2000 e impedir a inibir a polimerização de oxigênio.
      Nota: PDMS, na superfície do canal, parcialmente inibem a polimerização, permitindo a ligação em etapas posteriores. A lâmina de vidro tem uma transparência UV ligeiramente reduzida (35%) em comparação com o quartzo, o que ajuda a evitar qualquer amarelamento do dispositivo curado.
   4. Inserir um forno UV W 400 MY133-V2000 e defina a radiação UV para 50% da intensidade máxima de 300 s para curar o MY133-V2000 microchannel.
      Nota: O comprimento de onda do pico usado para curar o dispositivo é de aproximadamente 375 nm, com uma largura de banda de cerca de 25 nm. Aproximadamente 4.500 mJ/cm² do poder foi usado para curar a microchannel, que é um pouco mais do que dobro o mínimo recomendado pelo fabricante de poder de cura.
2. Construindo o suporte acrílico
   1. Desenhe a camada de base acrílica, usando um software de desenho vetorial. Certifique-se que a camada de base é um retângulo que é de 1,5 mm de espessura, 75 mm, comprimento e 25 mm de largura, com um retângulo centralizado que mede 25 x 11 mm.
   2. Desenhe a camada média acrílica usando um software de desenho vetorial. Certifique-se que a camada média é um retângulo (1,5 mm de espessura, 75 mm de comprimento e 25 mm de largura) com um quadrado centrado (5 mm x 5 mm) e dois círculos (ambos com um diâmetro de 3 mm) separados por 15 mm.
   3. Desenhe camada acrílica superior usando um software de desenho vetorial. Certifique-se que a camada superior é um retângulo (espessura de 3 mm, 30 mm de comprimento e 25 mm de largura) com um quadrado centrado (5 mm x 5 mm) e dois círculos (ambos com um diâmetro de 3 mm) separados por 15 mm.
   4. Pare com os projetos de dispositivo criados no software de desenho vetorial com um cortador do laser. Use as configurações de amostra de 100% de potência e 30% de velocidade. Execute o programa duas vezes para garantir que o acrílico é cortado.
   5. Toque os buracos na camada superior acrílica usando uma ferramenta de rosqueamento de 0,80 mm tamanho M5.
   6. Limpe as peças de acrílico com acetona para remover qualquer residuais marcas ou queimaduras.
3. Colagem de MY133-V2000 no suporte acrílico
   1. Anexe a camada base do acrílico ao substrato de vidro usando um adesivo, tal como a super cola de cianoacrilato. Coloque duas pequenas gotas nas bordas do acrílico e em seguida, use uma ferramenta descartável para espalhar uniformemente a cola. Coloque o substrato de vidro sobre o acrílico e permitir que a cola secar usando o peso do vidro para prendê-lo no lugar.
   2. Revestir o vidro exposto com 100 µ l de PDMS utilizando uma pipeta de deslocamento positivo; em seguida, inserir um aplicador de vácuo girar a camada de base e configurá-lo para 1.500 rpm por 2 min revestir uniformente o vidro com uma película PDMS aproximadamente 10 µm-grossa.
   3. Retire o aplicador girar a camada de base e limpe cuidadosamente qualquer excesso PDMS que revestiu o acrílico com acetona e toalha de papel. Tenha cuidado para não perturbar o PDMS não polimerizado.
   4. Asse a camada de base com o PDMS em estufa a 65 ° C por 2 h para curar o PDMS.
   5. Pipetar 1 mL de PDMS numa lâmina de vidro e, em seguida, use outra lâmina de vidro para espalhar uniformemente o PDMS até começa a escorrer para fora dos lados. Cure esta num prato aquecido a 150 ° C por 10 min.
   6. Corte o PDMS curado em um retângulo com as mesmas dimensões que o dispositivo MY133-V2000 e, em seguida, usando a camada média do acrílico como um molde, fazer buracos para o reservatório e corte um quadrado de visualização de janela no PDMS tornar a gaxeta PDMS.
   7. Coloque o MY133-V2000, lado do canal, no mesmo ou um substrato plano semelhante utilizado para plasma-tratando o PDMS na etapa 1.2.5. Coloque a camada de base acrílica, contendo o substrato PDMS curado juntamente com o canal de MY133-V2000 no plasma₂ O limpador. Regule a pressão do vácuo mTorr 200 e o RF nível alto e superfície-tratamento do substrato de canal e vidro por 30 s.
   8. Usando fórceps, coloca imediatamente o canal MY133-V2000 lado-para baixo no recorte retangular de acrílico a camada base tal que a MY133-V2000 contata o PDMS.
   9. Coloque a junta PDMS em cima do dispositivo MY133-V2000, alinhando os orifícios na junta com os reservatórios no dispositivo.
   10. Coloque o dispositivo inacabado em uma plataforma elevada acima do banco para fornecer uma superfície de aperto para montagem do dispositivo.
   11. Extrato de 3 mL de cimento acrílico, usando uma seringa. Distribua o suficiente cimento acrílico em cima de uma camada de base para fornecer um revestimento fino. Fazer o casaco como mesmo quanto possível e não deixe que o material escoe para o canal.
   12. Coloca a peça de acrílico médio da camada em cima do acrílico de camada de base. Certifique-se de que os furos se alinham com os reservatórios do canal MY133-V2000.
   13. Use 3 grampos pequenos para manter a camada de base e meados camada juntos como firmemente quanto possível por 2 min, enquanto o cimento acrílico endurece, para unir as peças de acrílico junto. Certifique-se de que os reservatórios não estão obstruídos durante esta etapa para evitar ar sendo preso por baixo do dispositivo MY133-V2000.
   14. Retire a pressão do dispositivo e colocar o cimento acrílico na camada média nos lugares de contato antecipado com a camada superior do acrílico.
   15. Coloque a camada superior do acrílico sobre a peça da camada média do acrílico, garantindo que os furos estejam alinhados com os reservatórios e deixe resto no banco por 2 min enquanto seca o cimento acrílico.

3. teste e utilização do dispositivo MY133-V2000

1. Vazamento de testes
   1. Teste o dispositivo MY133-V2000 adicionando 10 µ l de corante de comida ou água deionizada em um dos furos para testar a aderência e o fluxo do reservatório.
   2. Inserir um tubo (com um diâmetro de 1/8-no exterior) no reservatório e conecte a outra extremidade a uma armadilha de vácuo. Gire a vácuo para tirar a tintura ou a água através do canal para garantir que é criado um dispositivo bem sucedido.
   3. Verificar sob um microscópio para verificar que não existem fugas no canal ou no reservatório, encha o reservatório com etanol e permitir que o etanol sentar-se à temperatura ambiente por 10 min. Em seguida, puxe o etanol através da utilização do vácuo, para limpar o corante ou a água do canal.
   4. Pulverize o canal com etanol e colocá-lo em um prato de poliestireno estéril. Envolvê-la firmemente com parafilm e armazená-lo em um ambiente estéril até que seja necessário.
      Nota: neste ponto, o dispositivo deve ser manuseado assepticamente para evitar a contaminação. Quando estiver pronto para usar o dispositivo, o exterior do recipiente deve ser esterilizado usando etanol e trazido para a biossegurança do armário antes de abrir o recipiente.
2. Células MCF7 de chapeamento no dispositivo MY133-V2000
   1. Desenvolvem-se células MCF7 em pratos de Petri de 10 cm em uma mídia completo consiste mínimo essencial suplementado de Dulbecco (DMEM), com 10% de soro fetal bovino, penicilina-estreptomicina, glutamina e aminoácidos não essenciais, uma incubadora de cultura de células que mantém uma atmosfera úmida contendo 5% de CO₂ e 20% O₂ , a uma temperatura de 37 ° C. Crescem as células para aproximadamente 80% de confluência antes da semeadura-los na microchannel.
   2. Primeiro, pulverize o prato de poliestireno contendo o microchannel com etanol a 70%. Em seguida, trazê-lo para a biossegurança do armário antes de remover o parafilm protegendo o canal do ambiente de laboratório ambiental.
   3. Imobilize humanos-plasma-derivado de fibronectina na superfície microchannel, diluindo-a em fosfato salino de Dulbecco (DPBS) a 10 µ g/mL. Em seguida, injetar o canal 20 µ l desta solução e incube-a 20 ° C, durante 45 min.
   4. Lave a solução de fibronectina do canal por injetar 20 µ l de meios de cultura de células dentro do canal e permitir que incube a 20 ° C por 10 min.
   5. Lavar as células com 10 mL de DPBS e trypsinize as células, adicionando 1 mL de tripsina 1 x. Incube as células a 37 ° C por 7 min. neutralizar a tripsina com 9 mL de mídia completa.
   6. Injetar 20 µ l de células dentro do canal e os incubar a 37 ° C por 45-120 min permitir a fixação ao substrato antes da imagem latente.

Resultados

Este protocolo descreve a fabricação de MY133-V2000, um polímero fluorado com um baixo índice de refração igual da água. Uma característica fundamental do presente protocolo é como superar a falta de adesão que é característico de polímeros fluorados usando plasma de oxigênio e por fabricar o dispositivo dentro de um suporte de acrílico para fornecer a força extra mecânica necessária para selar o canal contra o substrato PDMS (Figura 1). O b...

Discussão

MY133-V2000 pode ser usado como uma alternativa aos materiais de fabricação tradicional litografia macia como PDMS. Trabalhos anteriores mostraram que materiais com um alto índice de refração, como PDMS, introduzir artefatos significativos perto das paredes do canal devido as descasamento índices de refração entre o material de fabricação e a solução aquosa dentro do canal ¹³. MY133-V2000 permite combinar o índice de refração do dispositivo microfluidic às soluções aquosas, comum...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MY133-V2000	MY Polymers	MY133-V2000
Sylgard 184	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fisher Premium microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4
.118"(3.0mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet	United States Plastic Corp	44290
.060"(1.5mm) x 12" x 12" Acrylic Sheet	United States Plastic Corp	44200
SCIGRIP 3 Very Fast Set Acrylic Cement	United States Plastic Corp	45735
Standard Aluminum Foil (.6 mm thick)	VWR	89107-726
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666
Insta-Cure+ Super Glue	Bob Smith Industries	BSI-109
1/8" PVC tubing	McMaster Carr	5231K55
McCormick Food Coloring	Target	13353207
X-Acto #1 Precision Knife	X-Acto	X3201
X-Acto #18 Heavyweight wood chiseling blade	X-Acto	X218
VWR Razor Blades	VWR	55411-055
Surface Treated Cell Culture Dishes	Fisher Scientific	FBO12922
Fibronectin Human Plasma	Sigma-Aldritch	F0895-1MG
Trypsin-EDTA 10x	Fisher Scientific	15-400-054
Corning Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	MT21030CM
Gibco Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	15-140-148
HyClone Nonessential Amino Acids 100x	Fisher Scientific	SH3023801
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-12
Corning DMEM with L-glutamine and glucose	Fisher Scientific	MT10013CV
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma-Aldritch	448931	Reacts violently with water
Ethanol, 200 proof Decon Labs	Fisher Scientific	04-355-223
Acetone	Fisher Scientific	A18P-4
Bel-Art 42025 Plastic Dessicator	Cole-Parmer	EW-06514-30
Epilog Fusion Laser Cutter, 120 W	Epilog Laser	Epilog Fusion M2 32 Laser
Isotemp Stirring Hotplate	Fisher Scientific	SP88850200
Ateco 14111 1.5 inch stainless steel cutter	Ateco	14111
Pyrex Glass Cell Culture Dish	Fisher Scientific	08-747B
Radio Frequency Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Used with Oxygen gas
Black Hole Laboratories Digivac	Black Hole Laboratories	Model 215
Intelli-Ray Ultraviolet Oven	Uvitron	UVO338
Compact Spin Coater	MTI Corporation	VTC-100A
Fisher Brand Isotemp Oven	Fisher Scientific	15-103-0510	Forced Air Convection
Gilson Positive Displacement Pipette P1000	Fisher Scientific	FD10006G
HeraCell VIOS 160i	Fisher Scientific	13 998 212PM