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Resumo

Descreveremos um protocolo para a identificação do rótulo-livre dos subtipos de linfócito usando a imagem latente da fase quantitativa e um algoritmo de aprendizado de máquina. Medições de índice de refração 3D tomograms de linfócitos apresentam 3D informações morfológicas e bioquímicas para células individuais, que é, então, analisadas com um algoritmo de aprendizado de máquina para identificação dos tipos de células.

Resumo

Descrevemos aqui um protocolo para a identificação do rótulo-livre dos subtipos de linfócito usando a imagem latente da fase quantitativa e aprendizado de máquina. Identificação dos subtipos de linfócito é importante para o estudo da imunologia, bem como diagnóstico e tratamento de várias doenças. Atualmente, métodos padrão para a classificação dos tipos de linfócitos dependem de rotulagem de proteínas de membrana específicas via reações antígeno-anticorpo. No entanto, essas técnicas de rotulagem carregam os riscos potenciais de alterar funções celulares. O protocolo descrito aqui supera esses desafios, explorando contrastes ópticos intrínsecos, medidos pela imagem latente 3D fase quantitativa e um algoritmo de aprendizado de máquina. Medição de tomograms 3D Índice de refração (RI) de linfócitos fornece informações quantitativas sobre morfologia 3D e fenótipos das células individuais. Os parâmetros biofísicos extraídos o tomograms 3D medido do RI são então analisados quantitativamente com um algoritmo de aprendizagem de máquina, permitindo a identificação de rótulo livre de tipos de linfócitos em um nível de célula única. Medimos o 3D tomograms RI de linfócitos B, T CD4 + e CD8 + T e identificados os tipos de células com mais de 80% exatidão. Este protocolo, descreveremos as etapas detalhadas para isolamento de linfócitos, imagem 3D fase quantitativa e aprendizado de máquina para identificar tipos de linfócitos.

Introdução

Os linfócitos podem ser classificados em vários subtipos, incluindo B, auxiliar T (CD4 +), citotóxicos (CD8 +) T e T reguladora células. Cada tipo de linfócito tem um papel diferente no sistema imune adaptativo; por exemplo, os linfócitos B produzem anticorpos, Considerando que os linfócitos T detectam antígenos específicos, eliminam as células anormais e regulam os linfócitos B. Regulamento e função de linfócitos é firmemente controlado pelo e relacionados a várias doenças, incluindo infecções virais3, cancros1e doenças auto-imunes2. Assim, a identificação dos tipos de linfócitos é importante entender seus papéis fisiopatológicos em tais doenças e para imunoterapia em clínicas.

Atualmente, métodos de classificação de tipos de linfócitos dependem de reações antígeno-anticorpo alvejando proteínas específicas da membrana de superfície ou marcadores de superfície4. Direcionamento de marcadores de superfície é um método preciso e exato para determinar os tipos de linfócitos. No entanto, requer reagentes caros e procedimentos demorados. Além disso, ele carrega os riscos da modificação das estruturas de proteína de membrana e a alteração das funções celulares.

Para superar esses desafios, o protocolo descrito aqui introduz a identificação de rótulo livre de linfócitos tipos usando 3D fase quantitativa de imagem (QPI) e máquina de aprendizagem5. Esse método permite a classificação dos tipos de linfócitos em um nível de célula única com base nas informações morfológicas extraídas de imagem em 3D livre de rótulo de linfócitos individuais. Ao contrário de técnicas de microscopia de fluorescência convencional, QPI utiliza o índice de refração (RI) distribuições (intrínsecas propriedades óticas de células vivas e tecidos) como contraste óptico6,7. Os tomograms RI de linfócitos individuais representam informação fenotípica específica para os subtipos de linfócitos. Neste caso, para utilizar sistemicamente 3D tomograms RI de linfócitos individuais, foi utilizado um algoritmo de aprendizado de máquina supervisionado.

Usando várias técnicas QPI, os 3D tomograms RI de células têm sido ativamente utilizados para o estudo da fisiopatologia da célula porque eles fornecem um rótulo livre, quantitativa de imagem capacidade8,9,10, 11,12,13. Além disso, as distribuições de RI 3D de células individuais podem fornecer informações morfológicas, bioquímicas e biomecânicas sobre células. 3D do RI tomograms tenha sido previamente utilizados nos campos da hematologia14,15,16,17, doenças infecciosas18,19, 20, imunologia21célula biologia22,23, inflamação24, câncer25, neurociência26,27, biologia do desenvolvimento28, toxicologia 29e Microbiologia12,30,31,32.

Embora 3D RI tomograms fornecem informações detalhadas morfológicas e bioquímicas das células, a classificação dos subtipos de linfócito é difícil de alcançar por simplesmente imagem 3D RI tomograms5. Explorarem sistematicamente e quantitativamente a medida tomograms RI 3D para a classificação do tipo de célula, utilizamos um algoritmo de aprendizado de máquina. Recentemente, diversos trabalhos têm sido relatados em qual fase quantitativa, analisaram-se imagens de células com várias máquina aprendendo algoritmos33, incluindo a detecção de microorganismos34, classificação de género bacteriana35 , 36, detecção rápida e livre de rótulo de esporos de antraz37, automatizado de análise de espermatozoides38, análise de células de câncer39,40e detecção de ativação de macrófagos41.

Este protocolo fornece etapas detalhadas para executar livre de etiqueta de identificação de tipos de linfócitos no nível da célula individual usando 3D QPI e aprendizado de máquina. Isto inclui: isolamento 1) linfócitos do sangue de rato, 2) linfócito classificação através de fluxo cytometry, QPI 3) 3D, 4) quantitativos extração do 3D do RI tomograms e aprendizado 5) supervisionado para a identificação de tipos de linfócitos.

Protocolo

Cuidados com animais e procedimentos experimentais foram realizados sob a aprovação dos cuidados institucionais do Animal e uso Comitê de KAIST (KA2010-21, KA2014-01 e KA2015-03). Todas as experiências neste estudo foram realizadas em conformidade com as diretrizes aprovadas.

1. linfócitos isolado do sangue de rato

  1. Uma vez um rato C57BL/6J é eutanásia por inalação de CO2 , introduza uma agulha 26-G o coração de rato e recolher 0,3 mL de sangue. Diretamente colocar sangue em um tubo com 100 U/mL de solução de heparina diluído com 1 mL de tampão fosfato salino (PBS).
    Nota: Como alternativa, os linfócitos do baço podem ser isolados.
  2. Centrifugar o tubo a 400 x g por 5 min a 4 ° C.
  3. Adicionar 0,5 mL de tampão de lise de amónio-cloreto de potássio ao tubo e suavemente invertê-lo algumas vezes para misturar a solução.
  4. Incube o tubo em temperatura ambiente (RT) por 5 min.
  5. Lave as células adicionando 4,5 mL de PBS e centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 ° C, duas vezes.
  6. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 100 µ l de meio RPMI-1640 fresco com 10% de soro fetal bovino (FBS).
  7. Adicione 0,1 µ g de anticorpos CD16/32 (2.4G2) para o tubo para o bloqueio.
  8. Mantenha o tubo no gelo.

2. fluxo Cytometry e classificação dos subtipos de linfócito

Nota: Classificação de linfócitos, dependendo do tipo de célula é essencial para o estabelecimento da célula de chão-verdade (ou seja, correto) digite rótulos para treinar e testar um classificador do tipo de célula no aprendizado supervisionado. Citometria de fluxo, um método padrão-ouro, é usada para identificar e separar os linfócitos42.

  1. Fazer uma mistura de superfície marcador coloração anticorpos em 100 µ l de meio RPMI-1640 fresco [com 10% FBS, 0,1 µ g de CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D 3), CD45R (B220, RA3-6B2) e NK1.1 (PK136)] e 0,25 µ g de anticorpos CD4 (GK1.5) para o destino B, T CD4 + e CD8 + T linfócitos.
  2. Adicione 100 µ l da mistura de anticorpos para a suspensão de eritrócitos (obtida na etapa 1.8).
  3. Incube durante 25 min no gelo.
  4. Lave as células adicionando 5 mL de PBS e centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 ° C, duas vezes.
  5. Ressuspender as células em 5 mL de meio RPMI-1640 fresco com 10% FBS e 2,5 µ g de DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole).
  6. Recolha separadamente cada tipo de linfócito com citometria de fluxo, usando os níveis de fluorescência dos marcadores acima descritos. Ao mesmo tempo excluir células mortas usando os sinais DAPI.
    Nota: Os protocolos detalhados sobre fluxo baseados em citometria de célula classificação ter sido descrito anteriormente42.

3. 3D fase quantitativa Imaging

  1. Manter os linfócitos classificados no gelo durante os procedimentos de imagem, que deve ser concluído no prazo de 5h (desde o isolamento do linfócito do mouse) para evitar danos celulares e alterações bioquímicas.
  2. Selecione um tipo de célula classificada (entre linfócitos B, T CD4 + e CD8 + T) e diluir a amostra (obtida na etapa 2.6) para 180 células / µ l com meio RPMI para condição de imagem ideal (ou seja, uma célula por um único campo de visão).
  3. Carrega 120 μL da amostra diluída em uma câmara de imagens por injeção lenta. Verific completamente na presença de bolhas na câmara de imagens com a amostra. Se houver bolhas, cuidadosamente removê-los, como eles vão comprometer a qualidade das medições.
  4. Adquira 3D RI tomograms usando um comercial 3D quantitativo fase o microscópio, ou holotomography e seu software de imagem.
    Nota: Informações detalhadas sobre a instalação experimental podem ser encontradas no manuscrito original5.
    1. Coloque uma gota de água destilada em cima da lente da objetiva do microscópio.
    2. Coloque a câmara de imagem com a amostra na fase de tradução do microscópio e ajustar a sua localização, para que a amostra se alinha com a lente objetiva.
    3. Ajuste as posições axiais das lentes objetivas e condensador clicando em foco e superfície, respectivamente, na guia "Calibração" da perspectiva do software da imagem latente "Microscópio".
    4. Alinhe as lentes objetivas e condensador clicando em Modo automático. Como alternativa, use o Modo de digitalização e manualmente ajustar as lentes para que os padrões de iluminação são localizados na região central do campo de visão.
    5. Voltar ao Modo Normal e ajustar a fase de tradução para localizar uma célula no campo de visão.
    6. Encontre o plano focal, ajustando a posição axial da lente da objetiva. Foco perfeito faz com que o limite de amostra visualizado na tela quase invisível.
    7. Ajuste a fase de tradução para encontrar um local sem um celular.
    8. Clique em calibrar para medir vários hologramas 2D com diferentes ângulos de iluminação.
    9. Ajuste a fase de tradução para localizar um celular no centro do campo de visão.
    10. Mover para a guia "Aquisição" e clique em 3D instantâneo para medir os hologramas da célula com os ângulos de iluminação idêntica como feito na etapa 3.4.8.
    11. Quando os dados adquiridos são apresentados no painel "Gestão de dados", botão direito do mouse sobre os dados adquiridos e clique em processo para reconstruir uma tomografia 3D do RI dos hologramas medido em etapas 3.4.8 e 3.4.10, usando o algoritmo de tomografia computadorizada de difração 9 , 10 implementado no software da imagem latente.
    12. Repita as etapas 3.4.5-3.4.11 para medir mais de 100 células para garantir poder estatístico para aprendizado de máquina.
    13. Todas as imagens são processadas através do passo 3.4.11. pode ser visualizado. No painel "Gestão de dados", os dados com o botão direito e clique em abrir para visualizar os dados. Clique em tomografia de RI no painel "Data Manager". Na guia "Preset", clique em carregar e dê um duplo clique em "lymphocyte.xml", que é uma função de transferência predefinidos fornecida pelo software de imagem para visualizar a tomografia de acordo com as distribuições de RI a 3D.
  5. Repita as etapas de 3,2-3,4 para medir 3D tomograms RI de todos os subtipos de linfócitos.

4. quantitativo morfológicos e bioquímicos extração de RI 3D Tomograms

  1. Coloque todos os dados tomográficos medidos acima em uma única pasta. Dividi os tipos de células nas subpastas desta pasta. Prepare cada tomografia para ser um arquivo único Mat .
  2. Abra o arquivo complementar 1 - extração de recurso (escrito por uma software de processamento de imagem).
  3. Edite a linha 14 para designar a pasta tomografia preparada no passo 4.1.
  4. Edite a linha 15 para designar uma pasta para salvar os dados extraídos do recurso.
  5. Opcionalmente, edite a linha 17 para ajustar os parâmetros de limite de RI para extração de características. A opção padrão é 20 limiares de RI de 1.340-1.378, com um incremento de 0,002 conforme descrito anteriormente,5.
  6. Execute o código. Para cada tomografia no dataset, o código calcula cinco características: superfície de área (SA), o volume celular (CV), esfericidade (SI), densidade de proteína (PD) e massa seca (DM), por limite de RI. Os algoritmos detalhados para extração de características são descritos em outra parte5.
  7. A fim de monitorar a extração de características, durante a verificação de execução na tela de visualização de segmentação celular baseado em limite de RI.
  8. Checar os dados extraídos do recurso, como arquivo de Mat por tomografia, salvo na pasta designada na etapa 4.4.

5. supervisão de aprendizagem e identificação

  1. Aleatoriamente, dividi os dados de recurso obtidos na moda passo 4.8 para treinamento (70%) e teste (30%) com pastas separadas.
  2. Abrir arquivo complementar 2 - trem (escrito por uma software de processamento de imagem).
  3. Edite a linha 14 para designar o conjunto de treinamento preparado na etapa 5.1.
  4. Edite a linha 16 para designar uma pasta para salvar o classificador treinado.
  5. Edite a linha 17 para definir um nome de arquivo para o classificador.
  6. Opcionalmente, edite a linha 19 para selecionar os recursos para o treinamento. A opção padrão, conforme especificado anteriormente5, foi usada para obter os resultados representativos abaixo.
  7. Execute o código. Usando os recursos selecionados do conjunto de treinamento, o código treina um classificador com o k-algoritmo do vizinho mais próximo de (k -NN; k = 4) e em seguida, salva o classificador (como é chamado na etapa 5.5) na pasta designada na etapa 5.4.
  8. Verifique na tela de visualização do desempenho de classificador e a precisão de validação cruzada.
  9. Opcionalmente, treine múltiplos classificadores com combinações diferentes de recurso, repetindo as etapas 5,5-5,7. Em seguida, escolha o classificador com a maior precisão na validação cruzada.
  10. Abra complementar arquivo 3 - teste de (escrito por uma software de processamento de imagem).
  11. Edite linhas 14-15-designar o classificador treinado para ser testado.
  12. Edite a linha 17 para designar o conjunto de teste, preparado na etapa 5.1.
  13. Execute o código. O classificador descrito acima identifica os tipos de células dos linfócitos individuais no conjunto de teste.
  14. Verifique na tela de visualização do desempenho de identificação e a precisão do teste.

Resultados

Figura 1 mostra o processo esquemático do protocolo inteiro. Usando o procedimento aqui apresentado, isolamos B (n = 149), CD4 + T (n = 95) e CD8 + T (n = 112) linfócitos. Para obter informações de fase e amplitude em diferentes ângulos de iluminação, múltiplos hologramas 2D de cada linfócito foram medidos, alterando o ângulo de iluminação (de-60 ° a 60 °). Normalmente, 50 hologramas podem ser usados para reconstruir uma tomografia 3D do RI,...

Discussão

Apresentamos um protocolo que permite a identificação de rótulo livre dos tipos de linfócitos, explorando a imagem 3D fase quantitativa e aprendizado de máquina. Passos críticos do presente protocolo são fase quantitativa de imagem e o recurso seleção. Para a ideal de imagem holográfica, a densidade de células deve ser controlada como descrito acima. Estabilidade mecânica das células também é importante para obter uma distribuição de RI 3D precisa porque movimentos celulares flutuantes ou vibracionais pe...

Divulgações

Prof Y. Park, Y. Jo, Y. S. Kim e S. Lee tem interesses financeiros em Tomocube, Inc., uma empresa que comercializa quantitativa fase instrumentos de imagem e tomografia computadorizada de difração óptica e é um dos patrocinadores do trabalho.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela KAIST BK21 + programa, Tomocube, Inc. e da National Research Foundation da Coreia (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K 000396). Y. Jo reconhece apoio do KAIST presidencial Fellowship e bolsa de ciência biomédica Asan Foundation.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
MouseDaehan BiolinkC57BL/6J mice gender and age-matched, 6 – 8 weeks
Falcon conical centrifuge tubeThermoFisher Scientific14-959-53A15 mL
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich806544-500ML
Ammonium-chloride-potassium lysing buffer ThermoFisher ScientificA1049201
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR8758
Fetal bovine serumThermoFisher Scientific10438018
AntibodyBD Biosciences553140 (RRID:AB_394655)CD16/32 (clone 2.4G2)
AntibodyBD Biosciences555275 (RRID:AB_395699)CD3ε (clone 17A2)
AntibodyBiolegnd100734 (RRID:AB_2075238)CD8α (clone 53-6.7)
AntibodyBD Biosciences557655 (RRID:AB_396770)CD19 (clone 1D3)
AntibodyBD Biosciences557683 (RRID:AB_396793)CD45R/B220 (clone RA3-6B2)
AntibodyBD Biosciences552878 (RRID:AB_394507)NK1.1 (clone PK136)
AntibodyeBioscience11-0041-85 (RRID:AB_464893)CD4 (clone GK1.5)
DAPI Roche102362760014,6-diamidino-2-phenylindole
Flow cytometry BD BiosciencesAria II or III 
Imaging chamberTomocube, Inc.TomoDish
HolotomographyTomocube, Inc.HT-1H
Holotomography imaging softwareTomocube, Inc.TomoStudio
Image professing softwareMathWorksMatlab R2017b

Referências

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