Identificação, caracterização histológica e dissecação dos lobos da próstata do rato para em Vitro Spheroid 3D modelos de cultura

Resumo

Camundongos geneticamente modificados são modelos úteis para investigar mecanismos de câncer de próstata. Aqui nós apresentamos um protocolo para identificar e dissecar os lobos da próstata de um sistema urogenital do rato, diferenciá-los com base em histologia e isolar e cultura primária de células da próstata em vitro como esferoides para análises a jusante.

Resumo

Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) servem como modelos pré-clínicos eficazes para investigar a maioria dos tipos de cânceres humanos, incluindo o câncer de próstata (PCa). Compreender a anatomia e histologia da próstata do rato é importante para a utilização eficiente e adequada caracterização de tais modelos animais. A próstata de rato tem quatro pares distinto de lóbulos, cada um com características próprias. Este artigo demonstra o método apropriado de dissecação e identificação dos lobos da próstata do rato para análise da doença. Pós-dissecação, as células da próstata podem ser ainda mais cultivadas em vitro para compreensão mecanicista. Desde o rato próstata células primárias tendem a perder suas características normais quando cultivadas em vitro, nós esboçamos aqui um método para isolar as células e cultivá-las como culturas de esferoide 3D, que é eficaz para preservar o fisiológico características das células. Essas culturas 3D podem ser usadas para analisar a morfologia da célula e níveis de comportamento em condições fisiológicas perto, investigando alterado e localizações das principais proteínas e vias envolvidas no desenvolvimento e progressão de uma doença e olhando para respostas para tratamentos com drogas.

Introdução

A comunidade científica tem sido a tentativa de elucidar o mecanismo complexo de desenvolvimento de câncer humano há décadas. Considerando que a identificação de potenciais jogadores-chave e alvos de drogas começa com estudos de tecidos e células do pacientes, a aplicação translacional de tais achados, muitas vezes requer o uso de modelos animais pré-clínicos. O uso de camundongos geneticamente modificados modelos (GEMMs) para cânceres humanos modelo aumentou firmemente desde o estabelecimento do Mouse modelos de humano cancros consórcio (NIC-MMHCC), um comitê que procurava descrever e unificar as características de câncer rato modelos para os cientistas em todo o mundo^1,2. Modelos de mouse cumprir a necessidade de estudos mecanicistas em estudos pré-clínicos da maioria dos tipos de câncer, para compreender o desenvolvimento, a progressão, a resposta aos tratamentos e adquiriram resistência³.

Câncer de próstata é o câncer mais comumente ocorrem em homens, afetando mais de 160.000 homens cada ano⁴. Formas agressivas da doença reivindicam dezenas de milhares de vidas por ano. No entanto, o mecanismo de progressão da doença ainda seja mal compreendido. Isso resulta em uma séria falta de opções de tratamento eficaz para o cancro da próstata avançado e metastático, como evidenciado pela alta taxa de mortalidade em pacientes de câncer de próstata avançado⁴. Portanto, há uma necessidade crescente de modelos pré-clínicos estudar o câncer de próstata. No entanto, devido as diferenças inerentes entre o rato e a próstata humana, modelagem de câncer de próstata em GEMMs não ganhou popularidade até o sistema de classificação de Bar Harbor foi introduzido em 2004, que delineou as alterações histopatológicas no mouse próstata aquando da manipulação genética, identificação de alterações neoplásicas e sua relação com estágios de progressão de câncer em seres humanos⁵. Uma característica importante da próstata do rato que deve ser levada em consideração enquanto estudava qualquer modelo GEMM da próstata é a presença de quatro pares distinto dos lobos: anterior, lateral, ventral e dorsal. Os lóbulos apresentam diferenças significativas na histopatologia e gene expressão padrão⁶. Padrão de expressão de proteínas probasin pode variar entre lóbulos no jovem pós-puberdade ratos⁷, que deve ser considerado desde modelos baseados em Cre GEMM destinam-se principalmente usando um promotor baseada em probasin chamado Pb-Cre4⁷. As diferenças espaciais e temporais resultantes em Cre expressão muitas vezes levam a diferenças nos cronogramas de iniciação e progressão do tumor, bem como diferenças nas alterações neoplásicas entre os lóbulos. Portanto, é importante dar conta de tais diferenças, enquanto estudava o desenvolvimento do tumor na próstata GEMMs, e os lóbulos individuais podem precisar ser avaliado separadamente para obter resultados reprodutíveis. A primeira parte deste artigo descreve os métodos apropriados para dissecar uma próstata de rato, identificar e separar cada lóbulo e reconhecer as diferenças histológicas entre os lóbulos.

Enquanto a análise do crescimento do tumor e a histopatologia pode fornecer insights valiosos sobre o desenvolvimento do tumor, eles não fornecem muitas informações sobre mecanismos moleculares. Para estudar o mecanismo de desenvolvimento do tumor e progressão, muitas vezes é útil analisar o tumor de células in vitro. Vários métodos têm sido sugeridos ao longo dos anos que envolvem culturas destas células, incluindo culturas de suspensão, culturas 3D⁸ e recentemente, 2D regular culturas⁹. Considerando que a maioria desses métodos resulta em taxas de sobrevivência e proliferação de células boas, as culturas 3D fornecem um ambiente mais próximo de condições fisiológicas. Em 3D ou esferoide culturas cultivadas em uma membrana basal da matriz extracelular (ECM), as células totalmente diferenciadas luminal geralmente têm taxa de sobrevivência muito baixo; no entanto, as células basais e intermediárias (principalmente as células-tronco) são capazes de se propagar e produzir aglomerados de células chamados de esferoides¹⁰. Isso o torna adequado para um estudo de câncer desde cancros epiteliais acredita-se que se originam de células-tronco (popularmente conhecidas como câncer células-tronco)¹¹. A segunda parte do presente protocolo descreve um método para o cultivo de células da próstata do rato em culturas 3D. As esferas resultantes podem ser usadas para diversos tipos de análises a jusante, incluindo o estudo da morfologia de organoides e comportamento por célula viva da imagem latente, mancha de proteínas diferentes e o estudo de respostas para quimioterápicos tratamentos.

No geral, o objetivo do presente protocolo é delinear o ideais métodos para usar modelos de rato no cancro da próstata, descrevendo as técnicas de anatomia e dissecação da próstata do rato e o processamento do tecido para culturas de esferoide e análise em vitro .

Protocolo

Todos os experimentos de rato aqui descritos foram realizados de acordo com as orientações descritas nos protocolos institucionais IACUC-aprovado na SUNY Upstate Medical University.

1. a dissecação do sistema Urogenital (UGS)

Nota: O diagrama esquemático é apresentado na Figura 1.

1. Eutanásia em 3 meses masculino C57BL/6 mouse usando o método de eutanásia por inalação de CO₂ ou outra técnica aprovada.
   Nota: Os ratos entre as idades de 3 a 12 meses podem ser usados com sucesso para o experimento. Os ratos mais velhos (> 6 meses) provavelmente terá mais gordura em torno da UGS, que terá de ser resolvida. Identificação e separação dos lóbulos é muitas vezes difícil em ratos menores de 3 meses. Outras cepas podem ser usadas para o experimento, também.
2. Coloque o mouse em suas costas e segura as pernas usando pinos, de modo que o lado ventral do animal é exposto.
3. Spray-70% de etanol no abdômen do rato e limpar.
   Nota: Raspar os pelos do abdome antes de dissecação não é necessária.
4. Levante a pele do abdômen, juntamente com a camada muscular, com um par de pinças sem corte médios e fazer uma incisão em forma de Y invertida no abdômen com uma tesoura.
   1. Primeiro, faça uma incisão reta com uma tesoura afiada de apenas acima do pênis ao esterno (Figura 2a).
   2. Corte da base da incisão para cada dedo do pé, até as coxas (Figura 2b). Dobre a pele em ambos os lados e na parte inferior para visualizar toda a área abdominal (Figura 2-c-e).
      Nota: O tamanho do corte varia depende da idade do rato e tamanho. O tamanho da incisão reta inicial pode variar de 1,5 a 4 cm, dependendo do tamanho do mouse.
5. Mova-se sobre os outros órgãos para expor a UGS. Levantar e mover os intestinos marrom-amarelo (Figura 2f). Pegar as almofadas de gordura abdominais (o tecido esponjoso branco opaco) com fórceps e movê-los para os lados (Figura 2 g).
   Nota: O UGS compreende as vesículas seminais, uretra, próstata, ducto deferente (vas deferens) e bexiga urinária. Pode ser identificado pelo característico par de opacos brancos semicirculares arcos (que são as vesículas seminais), com o sac da bexiga cheia de líquido preso à base. O tecido translúcido localizado sob as vesículas seminais é a próstata.
6. Localize o UGS, firmemente segurar a bexiga urinária com fórceps rombudo e levantar o UGS todo para cima do abdômen do mouse.
   Nota: Se a bexiga está cheia, drená-lo primeiro com uma pequena seringa para fornecer uma melhor aderência com a pinça e reduzir o risco de ruptura da bexiga.
7. Continuando a puxar para cima sobre a bexiga, slide um par de tesouras debaixo da bexiga e da próstata até a coluna vertebral e fazer um corte. Corte as conexões restantes para a cavidade abdominal (Figura 2h e 2i). Tenha cuidado para não cortar demasiado perto para o UGS para evitar corte acidental através de todo o tecido da próstata.
   Nota: Ao fazer o corte sob o UGS, a tesoura deve ser inserida até a parte de trás do rato, para que o corte se encaixa a coluna vertebral também. Esse método resulta em quase todas as ligações entre o UGS e cavidade abdominal em um recorte, reduzindo o tempo necessário para extrair o tecido do mouse cortando.
8. Remover o UGS e colocá-lo em 2-6 mL (suficiente para cobrir o tecido) de fosfato, tampão salino (PBS) ou de Dulbecco modificado médio águia (DMEM, glicose alta) em uma placa de Petri (Figura 2j e 2 k) de 6cm e movê-lo para um microscópio de dissecação (10 X ampliação).
   Nota: Altere a mídia de dissecação conforme exigido nas etapas restantes.

2. dissecando a próstata

1. Limpe toda a gordura de ambos os lados dorsais e ventrais com um par de pinças bem e microdissection tesoura (Figura 3a). Use instrumentos cirúrgicos semelhantes para o resto do protocolo de dissecação.
   Nota: A gordura é muitas vezes estreitamente entrelaçada com o UGS (podem ser identificados pelo seu aspecto esponjoso branco); Portanto, esta etapa deve ser executada cuidadosamente para evitar acidentalmente cortando fora qualquer tecido da próstata. Pode levar até 10-15 min. para limpar toda a gordura.
2. Segure e puxe a bexiga com a pinça e corta-lo na base com a tesoura (Figura 3b).
3. Coloque o lado ventral do tecido remanescente. Segure um ducto deferente com fórceps, rastreá-lo até a base com uma tesoura e cortá-lo (Figura 3C) e, em seguida, repita do outro lado. Remover o ducto deferente, deixando para trás a próstata (verminous e translúcido), vesículas seminais (opaco e branco, semicircular) e a uretra (tubo rosa-vermelho e opaco) (Figura 3d e 3e).
4. Inserir a pinça entre o arco interior dos lóbulos anterior de tecido da próstata e vesículas seminais. Arrancar pedaços as vesículas seminais e próstata e cortar qualquer tecido conjuntivo como necessário (Figura 3f). Rastrear as vesículas seminais para sua base na uretra e removê-los (Figura 3 g e 3 h). Tenha cuidado para não perfurá-los.
5. Prossiga para dissecar fora dos lóbulos individuais da próstata.

3. Anatomia do Microdissection lobo da próstata e individuais (figuras 3i-n, Figura 4)

1. Vire o tecido com um par de pinças contundente para que o lado dorsal enfrenta, mostrando os lobos dorsais, que se assemelhará as asas de uma borboleta.
2. Recolha os lóbulos dorsais, mantendo o lóbulo com fórceps e recorte na base com uma tesoura (Figura 3j).
3. Vire o tecido restante ao lado ventral.
4. Recolher os lóbulos laterais, que são pequenos e geralmente envolver a uretra do lado, que está encravado entre os lóbulos anteriores, ventrais e dorsais (Figura 3 k).
5. Em seguida, recolher os lóbulos ventrais, que são maiores que os lóbulos laterais e deite-se ventralmente na uretra (Figura 3 l).
6. Última, colher os lóbulos anteriores, o maior dos quatro, cortando e descartando a uretra (Figura 3 m).
7. Processe as peças de tecido de acordo com necessidades experimentais. Prosseguir a seção 4 para histologia, ou a seção 5 para a cultura de esferoide.

4. lobo identificação e morfologia de hematoxilina e eosina-manchado Slides

1. Fixar o tecido prostático e incorporá-lo em parafina. Prossiga com a coloração dos slides com hematoxilina e eosina (H & E) para visualizar e identificar as diferenças nos lobos da próstata baseados na histologia, usando as características descritas por Oliveira et al. ¹² (Figura 5).

5. processamento do tecido para cultura 3D¹⁰

Nota: Isto é descrito na Figura 6.

1. Prosseguir com os lóbulos inteiros da próstata ou individuais conforme as necessidades experimentais de cultivo. Transferi o tecido da próstata para um prato de 10 cm contendo 2-3 mL de DMEM. Com um bisturi, picar os túbulos da próstata como finamente e uniformemente possível sob o microscópio de dissecação.
2. Continue com as etapas restantes sob uma capa de cultura de tecidos, sob condições estéreis.
3. Transfira os pedaços de tecido junto com o DMEM para um tubo de 15 mL e aumentar o volume para 9 mL com DMEM. Adicione 1 mL de solução estoque de colagenase x 10 para a mistura de DMEM-tecido e vórtice para misturar.
   Nota: Solução estoque de colagenase é de 10 mg/mL em meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI), e a concentração final no tubo de 15 mL é 1 mg/mL.
4. Coloque o tubo num agitador gyratory ou tubo rotador por 2 h a 37 ° C, para a colagenase degradar a matriz extracelular.
5. Centrifugar o tubo a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
6. Desprezar o sobrenadante e ressuspender em 2 mL de quente 0,05% do trypsin-EDTA para decompor as aderências célula-célula e célula-matriz. Transferi o tubo a 37 ° C por 5 min.
   Nota: Se os pedaços de tecido são muito grandes para misturar bem, corte a ponta da pipeta com uma lâmina de barbear para fazer um furo maior.
7. Quebre qualquer touceiras de tecido pipetagem com uma pipeta P1000 8 - 10 vezes e, em seguida, repetir-se com uma pipeta P200.
8. Neutralize a tripsina com 3 mL de DMEM completa. Adicionar 500 U de DNAase eu e misture bem.
9. Passar através de uma seringa de 5 mL de 5 - 10 vezes com uma agulha de 18 G. Em seguida passe por 5 vezes com uma agulha de 20 G.
10. Repita as etapas 4-8 mais uma vez se a solução contém ainda pedaços grandes de tecido.
11. Filtre a suspensão através de um filtro de 40 μm, colocado em um tubo de 50 mL. Lavar o tubo de 15 mL com 5 mL de DMEM e passar através do filtro mesmo. Repita o enxágue.
12. Descartar o filtro e centrifugar o tubo contendo a passagem a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.

6. chapeamento e cultivo das células

1. Resuspenda o pellet em 0,5 mL de próstata Epithelial Cell crescimento meio completo (PrEGM). Contar a densidade celular usando um contador de célula ou hemocytometer e diluir as células de 5 x 10⁵ células/mL em PrEGM completa.
   Nota: O rendimento de uma próstata todo rato de 3 meses pode variar de 3 x 10⁵-10⁶ células. Portanto, é importante inicialmente resuspenda o pellet em não mais que 0,5 mL de PrEGM (como mencionado acima) para que a densidade celular desejado pode ser alcançada, mesmo com baixo rendimento.
2. Mistura o volume necessário de células com a membrana basal ECM em uma relação de volume (suspensão de membrana basal de 60% ECM e 40% de células) e placa em uma placa multi bem ou slide câmara conforme as necessidades experimentais de 2:3.
   Nota: Para imunocoloração, placa em placas de vidro de fundo ou câmara slides, cobrindo todo o bem ou meio do poço. Se contar o organoids resultante da placa ao redor da borda do poço, ou como várias gotas por todo o poço da placa se chapeamento volumes mais elevados. Fique atento para não espalhá-lo muito fino ou muito grosso. Placa de pelo menos 100 µ l de mistura de célula-matriz por 1 cm² de chapeamento de área; por exemplo, em um slide de câmara com 2cm²-área de superfície bem, deve ser banhado a 200 µ l de mistura de célula-matriz contendo 5 x 10⁴ células.
3. Transfira a placa/lâmina para uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO₂ por 30 min para a membrana basal ECM para solidificar. Em seguida, adicione o PrEGM completo pré-aquecido para cobrir o poço, tomando cuidado para não perturbar o plug de membrana basal ECM.
4. Retire metade da mídia e adicione mídia fresca cada 2-3 dias. Cresce esferoides por 5-10 dias.
5. Prossiga com a colheita de imunocoloração (passo 7), (passo 8), e/ou de imagem para aplicações a jusante.

7. as esferas a colheita

1. Para colher as esferas, os meios de comunicação, Aspire cuidadosamente sem perturbar o plug de gel de membrana basal ECM e adicionar 1 mL de solução de dispase 1 mg/mL em PrEGM por 100 µ l de membrana basal ECM.
   Nota: É mais fácil a colheita esferoides, se eles são banhados no meio do poço ou da borda (em vez de cobrir o poço inteiro), para garantir que uma quantidade adequada da solução de dispase pode ser adicionada para o poço.
2. Raspe o fundo da placa com um raspador de célula para decolar o gel membrana basal ECM para a solução de dispase-PrEGM.
3. Pipeta de toda a solução acima e para baixo uma vez com uma grande furo ponta da pipeta 1000 µ l ou pipeta de 5 mL para terminar a ficha de gel em pedaços menores.
   Nota: Corte a ponta de uma ponta da pipeta 1000 µ l com uma lâmina de barbear para fazer uma furo grande dica.
4. Incube em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO₂ para 1-2 h até dissolver completamente a membrana basal ECM.
   Nota: Isto pode ser assegurado por inspeção visual da parte inferior bem enquanto inclinando a placa para confirmar que não há mais pedaços de gel permanecem.
5. Recolha a suspensão de células em um tubo cônico de 15 mL.
6. Centrifugar as esferas a 250 x g durante 5 min à temperatura ambiente e continuar com aplicações a jusante.

8. imunocoloração das esferas¹³

Nota: Depois de esferoides têm crescido a quantidade desejada de tempo, a membrana basal ECM pode ser dissolvida e as esferas podem ser manchadas, conforme descrito em Colicino et al ¹³.

1. Brevemente, enxágue as culturas com PBS e adicionar paraformaldeído 4% (PFA) directamente para a ficha de gel de membrana basal ECM. Incube durante 30 a 90 min à temperatura ambiente com agitação lenta, até que a membrana basal ECM é totalmente dissolvida, substituindo PFA fresco cada 30 min.
   Nota: O PFA irá dissolver o gel de plug e corrigir os esferoides durante este processo.
2. Em seguida, lave com PBS 3 vezes e adicionar cloreto de amônio 50 mM por 10 min saciar qualquer autofluorescência do PFA. Repita para 3 lavagens com PBS.
3. Permeabilize com detergente não-iônico de 0,1% por 5 min e bloco com PBSAT (PBS, BSA 1%, 0,5% Triton X-100) por 30 min.
4. Incube com um anticorpo primário em PBSAT durante a noite a 4 ° C, seguido de 3 lavagens com PBSAT e um anticorpo secundário em PBSAT para 2 h à temperatura ambiente.
5. Repita as lavagens com PBSAT e mancha com DAPI de acordo com o protocolo do fabricante, se desejado. Lave 3 ou mais vezes com PBS.
6. Adicionar PBS com 200 milímetros 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano (DABCO) antidesgaste reagente e proceder à imagem.

Resultados

Os lobos da próstata do rato podem ser identificados e dissecados usando suas localizações em relação as vesículas seminais e a uretra. A próstata do rato é composta de 4 pares de lobos localizada dorsalmente e ventralmente para as vesículas seminais e a uretra. Figura 4a e 4b (topo) mostram os pontos de vista dorsais e ventrais da próstata intacto, junto com as vesículas seminais e a uretra. Os painéis de fundo (

Discussão

Este artigo descreve os métodos para a dissecção da próstata do rato e identificação dos lobos individuais. Também descrito é o protocolo para cultivo de células da próstata de rato em uma cultura 3D para análise em vitro .

Um passo crítico no protocolo de dissecação é colheita o UGS todo fora o mouse (1) e separando os órgãos individuais sob um microscópio de dissecação. O tecido da próstata é muito pequeno e cercado pelo resto do UGS; assim, é praticamente imp...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	10438018
PBS (Phosphate buffered saline)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenase	Thermofisher Scientific	17018029	Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
Syringes and Needles	Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II powder	Thermofisher Scientific	17105041	Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C