Идентификация, Гистологическая характеристика и рассечение мыши простаты лопастями для в Vitro 3D сфероида культура модели

Резюме

Генетически модифицированные мыши являются полезными моделями для изучения механизмов рака простаты. Здесь мы представляем протокол идентификации и вскрыть простаты долей от мыши мочеполовой системы, дифференцировать их по гистологии и изолировать и культуры первичной клетки простаты в vitro как сфероидов течению анализа.

Аннотация

Генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) служат эффективным доклинических моделей для расследования большинства видов человеческого рака, включая рак простаты (PCa). Понимание анатомии и гистология предстательной железы мыши имеет важное значение для эффективного использования и надлежащего описания таких животных моделей. Простаты мышь имеет четыре различных пар лопастями, каждый с их собственными характеристиками. Эта статья демонстрирует метод надлежащего вскрытия и идентификации мыши простаты лопастями для анализа заболеваний. После вскрытия, клетки простаты может быть далее культивировали в vitro механистического понимания. Начиная с мышь первичной клетки простаты, как правило, теряют их обычных характеристик когда культивировали в пробирке, мы приводим здесь метод для изоляции клеток и рост их как 3D сфероида культуры, который является эффективным для сохранения физиологических характеристики клеток. Эти 3D культуры могут использоваться для анализа морфологии клеток и поведение в рядом физиологических условиях, расследование изменены уровни и локализации основных белков и участвовать в разработке путей и прогрессирование болезни и глядя на Ответы на медикаментозного лечения.

Введение

Научное сообщество предпринимает попытки прояснить сложный механизм развития человеческого рака на протяжении десятилетий. В то время как выявление потенциальных ключевых игроков и лекарственных препаратов начинается с пациентом клеток и тканей исследования, поступательные применение таких результатов часто требует использования доклинические животных моделей. Использование генной инженерии мышей, модели (GEMMs) модели человеческого рака неуклонно возросла с момента создания консорциума мыши модели из человеческого рака (NCI-MMHCC), Комитет, который попытался описать и унифицировать характеристики мыши рака модели для ученых во всем мире^1,2. Удовлетворить потребность в механистической исследования в доклинических исследованиях большинства типов рака, для понимания развития, прогрессии, ответ на лечение и приобрела сопротивление³мыши модели.

Рак предстательной железы является наиболее часто встречающиеся рака у мужчин, затрагивающих более 160 тысяч людей каждый год⁴. Агрессивные формы болезни утверждают десятки тысяч жизней каждый год. Однако механизм прогрессирования заболевания еще плохо поняты. Это приводит к серьезной нехватки вариантов эффективного лечения для продвинутых и метастазами рака простаты, что подтверждается высокой смертности больных раком простаты⁴. Следовательно существует растущая потребность в доклинических моделей для изучения рака простаты. Однако вследствие присущего различия между предстательной железы человека и мыши, моделирование рака простаты в GEMMs не набрали популярность до тех пор, пока система классификации Бар Харбор была введена в 2004 году, который изложил гистопатологические изменения мыши простаты генетической манипуляции, идентификация опухолевых изменений и их связь с этапы прогрессирования рака в людей⁵. Одной важной характеристикой мыши простаты, что должны быть приняты во внимание при изучении любого простаты ГЭММ модели является наличие четырех отдельных пар лопастями: передний, боковой, брюшной и спинной. Долей представляют существенные различия в шаблон⁶выражение гистопатология и ген. Probasin белок выражению может варьироваться между лопастями в молодых мышей после полового созревания⁷, которые должны рассматриваться так, как модели на основе Cre ГЭММ предназначены главным образом с помощью probasin на основе promotor называется Pb-Cre4⁷. Результате пространственные и временные различия в Cre выражение часто приводят к различия в сроки инициирования и прогрессии опухоли, а также различия в опухолевые изменения между лопастями. Следовательно важно учитывать такие различия во время учебы развитие опухоли в предстательной железе GEMMs и индивидуальных долей может потребоваться оцениваться отдельно для достижения воспроизводимость результатов. В первой части этой статьи описывает методы вскрыть мыши простаты, идентифицировать и отдельно каждого лепестка, и признать гистологические различия между лопастями.

В то время как анализ роста опухоли и гистопатологии могут предоставить ценную информацию в развитие опухоли, они не предоставляют больше информации о молекулярных механизмов. Чтобы изучить механизм развития опухоли и прогрессии, часто полезно для анализа клеток опухоли в пробирке. С годами, которые включают культур этих клеток, включая подвеска культур, 3D культур⁸ были предложены несколько методов и недавно, регулярные 2D культур⁹. В то время как большинство из этих методов приводит к хорошо ячейку выживания и распространения ставок, 3D культур предоставляют среду, которая ближе всего к физиологических условиях. В 3D или сфероида культур, выращенных в базальной мембраны внеклеточного матрикса (ECM) полностью дифференцированной Люминал клетки обычно имеют очень низкой выживаемости; Однако базальную и промежуточные клетки (в основном, стволовые клетки) способны размножаться и производить кластеры клеток называется сфероидов¹⁰. Это делает его пригодным для исследования рака, поскольку считается, что эпителиального рака происходят из стволовых клеток, (известный как рак стволовых клеток)¹¹. Второй частью этот протокол описывает метод для культивирования клеток простаты мыши в 3D культур. Результате сферах может использоваться для нескольких типов течению анализов, включая изучение органоид морфологии и поведение живых клеток, изображений, иммунофлюоресценции, пятнать для различных белков и изучение ответов на химиотерапевтическое лечение.

В целом целью настоящего Протокола является наметить оптимальные методы использования мыши модели рака простаты, описывая анатомии и рассечение методы мыши простаты и обработки ткани на сфероиде культур и в пробирке анализа .

протокол

Согласно рекомендациям, приведенным в институциональных IACUC утверждения протоколов медицинского университета SUNY Upstate были проведены все мыши эксперименты, описанные здесь.

1 рассечение мочеполовой системы (ПХГ)

Примечание: Схема представлена на рисунке 1.

1. Усыпить 3-месячного мужчины C57BL/6 мыши с помощью метода ингаляционных эвтаназии CO₂ или другого утвержденного технику.
   Примечание: Мышей в возрасте от 3 до 12 месяцев может успешно использоваться для эксперимента. Старых мышей (> 6 месяцев) будет скорее имеют больше жира вокруг ПХГ, который нужно будет очищен. Идентификация и разделения долей часто бывает трудно в мышей, моложе, чем 3 месяца. Другие штаммы могут использоваться для эксперимента, а также.
2. Поместите курсор мыши на его обратно и зафиксируйте ноги с помощью булавки, так что подвергается вентральной стороне животного.
3. Spray 70% этанол на животе мыши и протрите его.
   Примечание: Брить волосы на животе до вскрытия не требуется.
4. Поднимите кожу от живота, а также слой мышц, с парой средних тупым щипцов и сделать Перевернутый Y-образный разрез на животе с помощью ножниц.
   1. Во-первых сделать прямой разрез с острыми ножницами от чуть выше полового члена к грудине (Рисунок 2a).
   2. Вырежьте из основания разреза на каждый палец, до бедер (рис. 2b). Загнуть кожи с обеих сторон и в нижней части для просмотра всей брюшной области (рис. 2 c-e).
      Примечание: Сократить размер меняет зависеть на мыши возраст и размер. Размер первоначальных прямой разрез может варьироваться от 1,5 до 4 см, в зависимости от размера мыши.
5. Переместите другие органы подвергать ПХГ. Поднять и переместить Браун желтый кишечника (Рисунок 2f). Подобрать брюшной жир колодки (непрозрачный белый Губчатая ткань) с щипцами и переместить их в стороны (рис. 2г).
   Примечание: ПХГ состоит из семенных пузырьков, уретры, простаты, ductus deferens (семяпроводов) и мочевого пузыря. Он может быть идентифицирован характерные пары непрозрачной белой полукруглые арки, (которые являются семенных пузырьков), с мочевого пузыря, заполненные жидкостью мешочек крепится к основанию. Полупрозрачные ткани, расположенной прямо под семенных пузырьков является простаты.
6. Найдите ПХГ, прочно удерживайте мочевого пузыря с тупым щипцами и поднять весь ПХГ вверх от мыши живота.
   Примечание: Если мочевой пузырь полон, слейте ее сначала с небольшой шприц обеспечивают лучшее сцепление с щипцами и уменьшить риск разрыва мочевого пузыря.
7. Продолжая тянуть на мочевой пузырь, слайд ножницами под мочевого пузыря и простаты вплоть до позвоночника и сделать разрез. Прорваться через любые оставшиеся подключения к брюшной полости (Рисунок 2 h и 2i). Будьте осторожны, чтобы не отрезать слишком близко для ПХГ, чтобы избежать случайного резки через любой простаты ткани.
   Примечание: Делая разрез под ПХГ, ножницы следует включить всю дорогу до задней части мыши, таким образом, чтобы вырезать снимки с позвоночником. Этот метод приводит к разрыву почти все соединения между ПХГ и брюшной полости в одной СНиП, сократить время, необходимое для извлечения ткани из мыши.
8. Удаление ПХГ и поместить его в 2-6 мл, (достаточно, чтобы покрыть ткани) фосфат буфер солевой раствор (PBS) или Дульбекко изменение среднего (DMEM, высокие глюкоза) орел в 6 см Петри (Рисунок 2j и 2 k) и переместить его в рассечение микроскопа (10 X увеличение).
   Примечание: Измените рассечения средств массовой информации, требуемой в оставшиеся шаги.

2. Пройдя простаты

1. Очистите все жир от дорсальной и вентральной стороны с парой тонкой щипцы и microdissection ножницы (рис. 3a). Используйте подобные хирургические инструменты для остальной части протокола вскрытия.
   Примечание: Жир часто тесно переплетается с ПХГ (может быть идентифицирован его белый губчатый внешний вид); Таким образом этот шаг необходимо выполнить тщательно во избежание случайно отсекая от любой ткани простаты. Это может занять до 10-15 мин, чтобы очистить весь жир.
2. Проводить и тянуть мочевого пузыря с щипцами и СНиП на базе с ножницами (рис. 3b).
3. Поместите оставшиеся вентральной стороне ткани вверх. Удерживайте одну ductus deferens пинцетом, проследить его на базу с ножницами и резать его (рис. 3 c), затем повторить на другой стороне. Удаление ductus deferens, теперь оставив простаты (полупрозрачные и гитарная), семенных пузырьков (непрозрачный и белый, полукруглые) и уретры (розово красный и непрозрачные трубка) (рис. 3d и 3e).
4. Вставьте щипцы между Внутренняя арка семенных пузырьков и предстательной железы ткани передней долей. Подглядывать врозь семенных пузырьков и предстательной железы и СНиП любой соединительной ткани как необходимое (Рисунок 3f). Trace семенных пузырьков на их базу в уретре и удалить их (рис. 3 g и 3 ч). Будьте осторожны, чтобы не прокалывать их.
5. Перейти к вскрыть из отдельных простаты лопастями.

3. Гросс Анатомия предстательной железы и отдельных лепестков Microdissection (рисунки 3i-n, рис. 4)

1. Флип ткани с парой тупым щипцов, так что спинной сторона была обращена вверх, показаны спинной лопастями, которые будут похожи на крылья бабочки.
2. Соберите спинной лопастями, удерживая мочку пинцетом и ножниц на базе с ножницами (Рисунок 3j).
3. Переверните оставшиеся ткани на брюшную сторону.
4. Собирать боковых лепестков, которые являются небольшими и обычно обернуть мочеиспускательного канала на стороне, который вклинивается между передней, брюшной и спинной лопастями (рис. 3 k).
5. Далее, собирать вентральной лопастями, которые больше, чем боковых лепестков и лежат на уретру вентрально (рис. 3 l).
6. Последний, урожай передней долей, самый крупный из четырех, резки и отбрасывая мочеиспускательного канала (рис. 3 m).
7. Процесс куски ткани экспериментальных нужд. Перейти к разделу 4 для гистологии, или к разделу 5 для сфероида культуры.

4. Лобе идентификации и морфология гематоксилином и эозином окрашенных слайды

1. Исправьте простаты ткани и вставлять его в парафин. Приступайте к пятнать слайды с гематоксилином и эозином (H & E) для просмотра и выявления различий в простаты лопастями, основанный на гистологию, используя характеристики, изложенные Оливейра и др. ¹² (рис. 5).

5. обработка ткани для 3D культуры¹⁰

Примечание: Это приводится на рисунке 6.

1. Продолжите культивирования целом простаты или индивидуальных долей в соответствии с потребностями экспериментальной. Передать 10 см блюдо, содержащий 2-3 мл DMEM простаты ткани. С помощью скальпеля фарш простаты трубочки как мелко и равномерно, как можно скорее под микроскопом рассечение.
2. Выполните оставшиеся действия под капотом культуры ткани, в стерильных условиях.
3. Передача части ткани вместе с DMEM в 15 мл трубку и увеличить объём 9 мл с DMEM. Добавьте 1 mL 10 x коллагеназы Стоковый раствор смеси DMEM-ткани и вихревой смешивать.
   Примечание: Коллагеназа Стоковый раствор 10 мг/мл в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI) среде, и конечная концентрация в 15 мл-1 мг/мл.
4. Поместите трубку на вращательный шейкер или трубки ротатор втечение 2 ч при 37 ° C, для коллагеназы к деградации внеклеточного матрикса.
5. Центрифуга трубки на 400 g x 5 мин при комнатной температуре.
6. Отменить супернатант и Ресуспензируйте в 2 мл теплой 0,05% трипсина ЭДТА к расщеплять-клеток и клеток матрица спайки. Передать трубку до 37 ° C за 5 мин.
   Примечание: Если куски ткани слишком велики, чтобы перемешать, Отрежьте кончик пипетку с лезвием бритвы, чтобы сделать более широкое отверстие.
7. Разбейте любой ткани сгустки, дозирование с пипеткой P1000 8 - 10 раз, а затем повторять с пипеткой P200.
8. Нейтрализовать трипсина с 3 мл полной DMEM. Добавьте 500 U DNAase я и хорошо перемешать.
9. Пройти через шприц 5 мл 5 - 10 раз с иглой 18 G. Затем пройти через 5 раз с иглой 20 G.
10. Повторите шаги 4-8 еще раз, если решение по-прежнему содержит куски большой ткани.
11. Фильтр суспензию клеток через фильтр 40 мкм, размещены на тюбик 50 мл. Промойте 15 мл тюбик с 5 мл DMEM и пройти через тот же фильтр. Повторите полоскание.
12. Отменить фильтр и центрифуги трубка, содержащая потока через на 400 g x 5 мин при комнатной температуре.

6. покрытие и культивирования клеток

1. Ресуспензируйте гранулы в 0,5 мл полной простаты эпителиальных клеток роста среднего (PrEGM). Граф плотность клеток, используя счетчик соматических клеток или Горяева и разбавленных клетки 5 x 10⁵ клеток/мл в полной PrEGM.
   Примечание: Доходность от 3-месячного мышь всей предстательной железы может варьироваться от 3 x 10⁵-10⁶ клеток. Следовательно важно сначала Ресуспензируйте Пелле в не более чем 0,5 мл PrEGM (как упоминалось выше) тем, что плотность нужной ячейки может быть достигнута, даже с низкой доходностью.
2. Mix необходимый объем клеток с базальной мембраны ECM в отношение объема (60% базальной мембраны ECM и 40% суспензию клеток) 2:3 и пластины в нескольких хорошо пластины или слайд палаты в соответствии с потребностями экспериментальной.
   Примечание: Для иммуноокрашивания, пластины на стекло дно тарелки или камеры слайды, охватывающих весь хорошо или средней скважины. Пластина вокруг обода хорошо если подсчет результате organoids, или пластины как несколько капель во всем хорошо, если покрытие более высоких объемах. Помните, что не распространять его слишком толстым или слишком тонким. Пластины по меньшей мере 100 мкл ячейки матрицы смеси на 1 см² покрытие области; Например, в камеру слайд с 2 см²-хорошо площадь поверхности, следует покрытие 200 мкл смеси ячейку матрицы, содержащей 5 х 10⁴ клетки.
3. Передать пластины/слайд 37 ° C инкубатор с 5% CO₂ за 30 минут для базальной мембраны ECM затвердеть. Затем добавьте подогретым полный PrEGM для покрытия колодец, стараясь не нарушить вилку базальной мембраны ECM.
4. Удаление половины средств массовой информации и добавить свежие СМИ каждые 2-3 дня. Растут сфероидов на 5-10 дней.
5. Продолжите с уборки (шаг 7), иммуноокрашивания (шаг 8), и/или изображений для нисходящие приложения.

7. заготовка сферы

1. Чтобы собрать сферах, аспирационная СМИ тщательно не нарушая вилку гель базальной мембраны ECM и добавьте 1 mL 1 мг/мл dispase раствора в PrEGM за 100 мкл базальной мембраны ECM.
   Примечание: Это легче урожай сфероидов, если они покрыты в середине колодец или обода (вместо охватывающих весь хорошо), чтобы убедиться что достаточное количество раствора dispase могут быть добавлены к колодцу.
2. Скрип в нижней части пластины с ячейки скребок для подъема базальной мембраны ECM гель в dispase-PrEGM раствор.
3. Пипетки все решение вверх и вниз раз с широким родила 1000 мкл наконечник пипетки или 5 мл пипетки сломать вверх вилку гель на более мелкие куски.
   Примечание: Отрежьте кончик кончика пипетки 1000 мкл с лезвием бритвы, чтобы сделать большой родила подсказка.
4. Инкубируйте в инкубатор 37 ° C с 5% CO₂ для 1-2 ч до базальной мембраны ECM полностью не растворится.
   Примечание: Это может обеспечиваться путем визуального осмотра при наклона пластины для подтверждения, что нет больше фрагментов геля остаются хорошо дна.
5. Соберите суспензию клеток в 15 мл Конические трубки.
6. Центрифуга сферах на 250 x g 5 мин при комнатной температуре и продолжают с нижнем приложениями.

8. иммуноокрашивания сферах¹³

Примечание: После сфероидов выросли на нужное количество времени, базальной мембраны ECM может быть распущен и сферах могут быть окрашены, как описано в Colicino и др. ¹³.

1. Кратко промойте культур с PBS и добавьте параформальдегида 4% (PFA) непосредственно в вилку гель базальной мембраны ECM. Инкубируйте 30-90 мин при комнатной температуре с медленно покачивая, пока полностью не растворится базальной мембраны ECM, заменяя свежими PFA каждые 30 мин.
   Примечание: PFA растворяют гель вилку и исправить сфероидов во время этого процесса.
2. Далее мыть с PBS 3 раза и добавление хлорида аммония 50 мм за 10 мин утолить любой аутофлюоресценция из PFA. Повторите для 3 стирок с PBS.
3. Разрушения с 0.1% неионные моющее средство для 5 мин и блок с PBSAT (PBS, BSA 1%, 0,5% X-100 Тритон) за 30 мин.
4. Проинкубируйте с основного антитела в PBSAT на ночь при 4 ° C, следуют 3 стирок с PBSAT и вторичное антитело в PBSAT втечение 2 ч при комнатной температуре.
5. При необходимости повторите автомойки с PBSAT и пятно с DAPI согласно протоколу производителя. Вымойте 3 или более раз с PBS.
6. Добавить PBS с 200 мм 1,4-diazabicyclo [2.2.2] октана (DABCO) antifade реагента и приступить к визуализации.

Результаты

Простаты лопастями мыши могут быть определены и расчлененный, используя их расположения относительно семенных пузырьков и мочеиспускательного канала. Мышь простаты состоит из 4 пар лопастями расположен дорсально и вентрально семенных пузырьков и мочеиспускательно?...

Обсуждение

В этом документе изложены методы для рассечения мыши простаты и идентификации отдельных лепестков. Также описано это протокол для культивирования клеток простаты мыши в 3D культуре для анализа в пробирке .

Важнейшим шагом в протоколе вскрытия-(1) сбор всей ПХГ из мыши...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse surgical instruments (Mouse Dissecting kit)	World Precision Instruments	MOUSEKIT
Dissection microscope
RPMI medium	Thermofisher Scientific	11875093
Dissection medium (DMEM + 10%FBS)	Thermofisher Scientific	11965-084
Fetal Bovine Serum	Thermofisher Scientific	10438018
PBS (Phosphate buffered saline)	Thermofisher Scientific	10010031
Collagenase	Thermofisher Scientific	17018029	Make 10x stock (10mg/ml) in RPMI, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C
Trypsin-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
DNase I	Sigma-Aldrich	10104159001 ROCHE
Syringes and Needles	Fisher Scientific
Fisherbran Sterile Cell Strainers, 40μm	Fisher Scientific	22-363-547
PrEGM BulletKit	Lonza	CC-3166	Add all componenets, aliquot and store at -20 °C.
Matrigel membrane matrix	Thermofisher Scientific	CB-40234
Dispase II powder	Thermofisher Scientific	17105041	Make 10x stock (10mg/ml) in PrEGM, filter sterilize, aliquot and store at -20 °C