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Resumo

O protocolo descrito aqui permite que pesquisadores especificamente modificar capsids adenovírus em locais seleccionados pela química simples. Adenovírus blindado vectores partículas e vetores de transferência do gene redirecionada podem ser gerados, e interações do anfitrião de vetor podem ser estudadas.

Resumo

Vetores adenovírus são potentes ferramentas para virotherapy de vacinação e Oncolíticos genética. No entanto, eles são propensos a várias interações indesejáveis vetor-hospedeiro, especialmente após a entrega na vivo . É um consenso que as limitações impostas pela interação vetor-hospedeiro indesejado só podem ser superada se definidas modificações da superfície do vetor são executadas. Essas modificações incluem a blindagem das partículas de interações indesejadas e direcionamento pela introdução de novos ligantes. O objetivo do protocolo aqui apresentado é permitir que o leitor gerar protegido e, se desejado, redirecionados vetores de transferência de gene humano adenovírus ou vírus Oncolíticos. O protocolo permitirá que pesquisadores modificar a superfície do capsids do vetor de adenovírus pelo específico acessório químico de polímeros sintéticos, carboidratos, lipídios ou outras partes biológicas ou químicas. Descreve a tecnologia de ponta de modificações de capsídeo combinada de genética e química, que têm sido mostrados para facilitar a compreensão e superação das barreiras para entrega na vivo de vetores adenovírus. É fornecida uma descrição detalhada e comentada dos passos cruciais para a realização de reações químicas específicas com vírus biologicamente ativos ou vetores de vírus-derivado. A tecnologia descrita no protocolo baseia-se na introdução genética de cisteína (naturalmente ausente) resíduos em ciclos expostas ao solvente de vetores adenovírus-derivado. Estes resíduos de cisteína fornecem uma reatividade química específica que pode, após a produção dos vetores de altos títulos, ser explorada para altamente específico e eficiente acoplamento químico covalente de moléculas de uma grande variedade de classes de substância para o vetor partículas. Importante, este protocolo pode facilmente ser adaptado para executar uma ampla variedade de diferentes (não-tiol-baseado) as modificações químicas de capsids do vetor de adenovírus. Finalmente, é provável que esse vetores de transferência do gene de baseados em vírus não-envelopado além de adenovírus podem ser modificadas desde a base do presente protocolo.

Introdução

Adenovírus (Ad), membros da família Adenoviridae, são vírus de DNA não-envelope de que mais de 70 tipos até agora têm sido identificadas (http://hadvwg.gmu.edu). Dependendo hemaglutination Propriedades, estrutura do genoma e resultados de sequenciamento, os tipos de 70 Ad podem ser divididos em sete espécies (adenovírus humano À G)1,2. Genoma humano Ad é 38 kb em tamanho e encapsulado por um nucleocapsídeo icosahedral3. Devido à sua abundância, o hexon de proteínas do capsídeo, penton base e fibra são todos referidos como proteínas do capsídeo principais. O mais abundante e a maior hexon de proteínas do capsídeo forma 20 facetas do capsídeo, cada um composto por 12 hexon homotrimers4,5. Penton, localizado em cada borda icosaédrica (vértice), consiste em pentamers de uma base de penton e representa a base para o pico de vértice que é construído de glicosilados fibra trímeros5,6. A entrada da pilha nativa do Ad é composta basicamente de duas etapas principais. Primeiro, o botão de fibra liga-se ao receptor primário. Tipos de anúncio da espécie A, C, E e F, este é o receptor de coxsackie e adenovírus (carro). Essa interação traz o vírion em proximidade espacial da superfície celular, facilitando interações entre integrinas celulares e RGD-motif na penton base e consequentemente induzindo respostas celulares. Em segundo lugar, as alterações no citoesqueleto levam a internalização do virion e transporte para o endossomo7. Após desmontagem parcial no endossomo, o vírion é liberado para o citoplasma und, finalmente, viaja para o núcleo para replicação.

Enquanto Ad pode ser entregues localmente (ex., para a vacinação genética), entrega sistêmica através da corrente sanguínea conforme necessário para onco-virotherapy enfrenta várias barreiras. Ao circular na corrente sanguínea, injetados virions encontram o sistema de defesa da imunidade do hospedeiro, levando a rápida neutralização dos vectores baseados em vírus e renderização baseada em Ad-vetores extremamente ineficiente em aplicações sistêmicas. Além disso, o hepatotropism natural de Ad interfere com entrega sistêmica e deve ser resolvido para redirecionar Ad para suas novas células alvo.

Germline codificado IgM anticorpos naturais do sistema imunitário inato rapidamente reconhecem e vincular estruturas altamente repetitivas na superfície do virion8,9. Estes complexos imunes, em seguida, ativar as vias clássicas e não-clássica do sistema complemento, levando a neutralização rápido mediada por complemento de uma grande parcela do virions8. Um segundo caminho resultando em grande remoção de virions Ad é mediado por macrófagos10 e associado com aguda tóxico e hemodinâmicas efeitos colaterais11,12. No caso de anúncio em particular, Kupffer células que residem no fígado bind e phagocytically ocupam os Ad virions através ao tesouro específicos receptores, assim eliminando-os de sangue13,14,15 . Receptores específicos ao tesouro também foram identificados em células endoteliais sinusoidais fígado (células LSE)16, e células LSE também parecem contribuir para eliminação de vetor17, mas a que medida ainda precisa de esclarecimento. Além disso, alguns tipos de anúncio e seus vetores derivadas são eficientemente isolados por eritrócitos humanos18 a que se ligam através de carro ou o receptor do complemento CR119. Digno de nota, esse mecanismo de isolamento não pode ser estudado no sistema modelo de rato como em contraste com eritrócitos humanos, eritrócitos de rato não expressar o carro.

Anticorpos antianúncios específicos gerados pelo sistema imune adaptativo, após a exposição ao anúncio ou devido a infecções anteriores com Ad ou após a primeira entrega em aplicações sistêmicas levantem uma barreira mais eficaz utilização de vetores de Ad, e eles devem ser evitados em entrega eficiente e sistêmica.

Finalmente, o hepatotropism forte de alguns tipos de anúncio (incluindo Ad5) severamente dificulta a aplicação da Ad em terapia sistêmica. Este tropismo resultando na transdução de hepatócito é devido a alta afinidade do vírion a Ad de fator de coagulação de sangue X (FX), mediada pela interação de FX com a Ad hexon proteína20,21,22. FX pontes o vírion para os glicanos de sulfato de heparina (HSPGs) na superfície dos hepatócitos20,23,24,25. Um fator crucial para esta interação parece ser a medida específica de N - e O-sulfatação dos HSPGs em células do fígado,24, que é distinta da HSPGs em outros tipos de células. Além desta via mediada por FX, estudos recentes sugerem ainda mais vias ainda não identificaram que resultam na transdução de anúncio de hepatócitos26,,27,28.

Recentemente, ficou demonstrado que FX não é apenas envolvido na transdução de hepatócitos de Ad, mas também pela ligação, o vírion protege a partícula do vírus contra a neutralização pelo sistema de complemento26. Redução de transdução do hepatócito, impedindo a ligação de FX, portanto, criaria o efeito colateral indesejado de aumentar Ad neutralização através do sistema imunitário inato.

Um profundo conhecimento das complexas interações entre vetores e organismos host, portanto, é necessário desenvolver mais eficientes vetores para aplicações sistêmicas que contornar os obstáculos impostos pelo organismo do hospedeiro.

Uma estratégia que foi originalmente usada para proteínas terapêuticas foi adaptada para vetores de Ad para pelo menos parcialmente, ultrapassar as barreiras descritas acima. Antigenicidade e imunogenicidade de compostos de proteínas terapêuticas poderiam ser reduzidos pelo acoplamento com polietileno glicol (PEG)29,30. Daí, o acoplamento covalente de polímeros tais como PEG ou poli [N-(2-hidroxipropil) methacrylamid] (pHPMA) para o capsídeo superfície protege o vetor de interações indesejadas vetor-hospedeiro. Comumente, o acoplamento de polímero destinos grupos ε-amino dos resíduos de lisina lado aleatoriamente distribuídos na superfície do capsídeo. Partículas de vetor em solução são, devido à natureza hidrofílica dos polímeros anexados, rodeadas por uma concha de água estável que reduz o risco de reconhecimento imune celular ou degradação enzimática. Além disso, vetores peguilado Ad foram mostrados para iludir a neutralização por anti-hexon anticorpos em vitro e em camundongos previamente imunizado na vivo31. Em contraste com modificações genéticas capsídeo, acoplamento químico de polímeros é executado após a produção e purificação, permitindo não apenas para o uso de células de produtor convencional e produção das unidades populacionais de vetor de alta concentração, mas também para simultânea modificação de milhares de aminoácidos na superfície do capsídeo. No entanto, Amina-dirigido blindagem ocorre aleatoriamente em toda a superfície inteira do capsídeo, resultando em altas heterogeneidades e não permitindo a modificação de capsomers específico. Além disso, as metades de polímero grande exigidos para efeitos benéficos prejudicam vírus Bioatividade32.

Para superar essas limitações, Kreppel et al. 33 introduziu um conceito geneti-químicas para vetor re - e de orientação. Cisteínas introduzidas geneticamente o capsídeo do vírus em posições expostas ao solvente como fibra HI-laço33, proteína IX34e35,de hexon36. Embora não ocorrem naturalmente, cisteína-rolamento vetores Ad podem ser produzidos em títulos elevados em células normais do produtor. Importante, inserção de cisteínas em certas capsomers e em posições diferentes dentro de um único capsomer permite modificações altamente específicas de metades reativa-grupo tiol. Esta abordagem geneti-químicas foi mostrada para superar inúmeros obstáculos no design do vetor Ad. A combinação de baseado em amina PEGylation para acoplamento thiol-baseado da transferrina para o botão de fibra que Hi-laço tem sido comprovada com êxito redirecionar modificado vetores de anúncio de carro-deficiente células33e detargeting. Desde que o hexon está envolvido em interações mais indesejáveis (neutralizando anticorpos, fator de coagulação do sangue FX), estratégias de modificação thiol-baseado também foram aplicadas a hexon. Acoplamento de pequenas partes de PEG para HVR5 de hexon impediu partículas de vetor Ad para transduce SKOV-3 células na presença de FX, Considerando que grandes partes de PEG aumentaram hepatócito transdução14,35. Partículas de vetor de anúncio carregando mutações no botão de fibra, inibindo a ligação do carro e no HVR7 inibindo vinculação de FX (e cisteínas rolamento inserido em HVR1 para posição específica PEGylation) foram mostradas para iludir a neutralização mediada por anticorpos e complemento, assim como a captação de mediada ao tesouro sem perda de infecciosidade. Curiosamente, apesar da falta do escudo natural FX, PEGylation novamente melhorado transdução dos hepatócitos em função da PEG tamanho36. No entanto, foi demonstrado que a blindagem covalente tem um impacto sobre os processos de tráfico intracelulares. Prill et al. comparado irreversível contra escudos bioresponsive baseado no pHPMA e demonstrou que nem o modo de carga de blindagem nem co polímero teve um impacto na entrada da pilha, mas afetou a partícula tráfico para o núcleo. Empregar um escudo de bioresponsive com pHPMA carregados positivamente co polímeros permitidos para tráfico de partícula no núcleo, mantendo a eficiência elevada transdução de Ad vectores in vitro e in vivo37.

Em resumo, estes dados indicam que, mesmo sob a suposição de que todo vetor-hospedeiro-interações foram conhecidas e consideradas, modificações de superfície capsídeo excessiva são necessárias para superar os obstáculos associados com vetor sistêmica de entrega.

Aqui nós fornecemos um protocolo para realizar modificações químicas específicas de capsids do vetor de adenovírus para blindagem e/ou redirecionamento de partículas de vetor de adenovírus e vírus Oncolíticos baseados em adenovírus. O conceito desta tecnologia é descrito na Figura 1. Ele permite que a blindagem de certas regiões do capsídeo de interações indesejadas por ligação covalente de polímeros sintéticos. Ao mesmo tempo, ele também fornece um meio de anexar ligantes e combinam a blindagem e direcionamento. Usando simples química, experimentadores será capazes de modificar covalentemente a superfície de vetor adenovírus com uma grande variedade de moléculas incluindo peptídeos/proteínas, hidratos de carbono, lípidos e outras moléculas pequenas. Além disso, o protocolo prevê a modificação química de vetores de vírus-derivado biologicamente ativos sob a manutenção da sua integridade biológica e atividade a um conceito geral.

Protocolo

Nota: em seguida, um protocolo para PEGylation geneti-química de um anúncio de vetor é descrito com detalhe. Para habilitar o acoplamento específico da fracção de PEG, um vetor Ad5 previamente foi geneticamente modificado por introduzir um resíduo de cisteína da proteína hexon no loop hipervariável 5 conforme descrito na publicação anterior36e um PEG maleimide-ativado composto é usado como composto de acoplamento.

1. preparação de Buffers para a purificação de vetor por gradientes de CsCL passo

  1. Preparar 400 mL de tampão de adenovírus (Ad-tampão) adicionando HEPES (4,76 g/400 mL) de 50 mM e 150 mM de NaCl (3,504 g/400 mL) de água bidestilada (ddH2O). 350 mL desta reserva é necessário para preparar as seguintes três variantes de Ad-tampão.
    1. R: variante ajuste 150 mL de Ad-tampão pH 7,6 com NaOH.
    2. Variante b: adicionar uma concentração final de 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0,143 g] para 50ml e ajustá-lo ao pH 7.2 com HCl.
    3. Variante c: adicionar uma concentração final de 0.5 mM TCEP (0,022 g) para 150 mL e ajustá-lo ao pH 7.2 com HCl.
    4. Preparar os buffers em ddH2O e produtos químicos de qualidade analítica. Use 100 mL cada de variante A e variante C para preparar os buffers de CsCl (ver etapas 1.2 e 1.3; 50 mL de cada) necessárias para os gradientes de passo de CsCl (ver passos 3.2.6. e 3.2.18).
  2. Preparando o buffer de gradiente de passo de CsCl (ρCsCl = 1,41 g/cm3) em Ad-buffer
    Nota: Esta reserva será necessário em dois diferentes variações:
    1. Pesam duas alíquotas de exatamente 27,42 g de CsCl para tubos de 50 mL.
    2. ΡCsCl = 1.41/TCEP tampão: resolver CsCl em 40 mL de variante C do Ad-buffer.
    3. ΡCsCl = 1,41 tampão: resolver CsCl em 40 mL de variante A do Ad-buffer.
    4. Verificar e se necessário, ajustar o pH com HCl. Encha até exatamente 50 mL com a correspondente variante Ad-tampão. Para alcançar os melhores resultados de separação, a concentração exacta de CsCl e pH são cruciais.
    5. Verifique a densidade (conteúdo de CsCl) pesando 1 mL (1,41 g) cada buffer de gradiente.
  3. Preparando o buffer de gradiente de passo de CsCl (ρCsCl = 1,27 g/cm3) em Ad-buffer
    Nota: Esta reserva é necessária em duas versões diferentes:
    1. Pesam duas alíquotas de exatamente 18,46 g de CsCl em tubos de 50 mL.
    2. ΡCsCl = 1.27/TCEP tampão: resolver CsCl em 40 mL de variante C do Ad-buffer.
    3. ΡCsCl = buffer de 1,27: resolver CsCl em 40 mL de variante A do Ad-buffer.
    4. Verificar e se necessário, ajustar o pH com HCl. Finalmente, encha até exatamente 50 mL com a correspondente variante Ad-tampão. Para alcançar os melhores resultados de separação, a concentração exacta de CsCl e pH são cruciais.
    5. Verifique a densidade (conteúdo de CsCl) pesando 1 mL (1,27 g) cada buffer de gradiente.
  4. Esterilize todos os buffers (Ad-buffers e buffers gradientes de CsCl passo) por filtração (usando a malhagem do poro de 0,45 µm) em frascos estéreis.
  5. Após a esterilização, para evitar a oxidação do TCEP, saturar e sobrepor os buffers contendo TCEP com argônio por sparging os buffers com gás argônio por cerca de 30 s. Tome cuidado para usar apenas dispositivos estéreis (EG., estéril Pipetar dicas) ao aplicar o gás argônio e garrafas de uso grande o suficiente para permitir que a gordura de argônio.
    Nota: Todos os buffers deve ser preparados, fresco e protegido da luz e podem ser armazenados a 4 ° C por vários dias (especialmente os CsCl passo gradientes buffers que só devem ser mantidos por alguns dias).

2. acoplamento metades: Armazenamento e preparação

Nota: Moeities usados para acoplamento de cisteínas precisa suportar grupos tiol-reativo. Compostos maleimide ativado irão formar Tioéter estável laços com os cisteínas geneticamente introduzidos. Alternativamente, Orto-pyridyldisulfide (OPSS)-compostos ativados podem ser usados, que formam pontes dissulfeto de bioresponsive entre as partículas de vetor e acoplamento moiety. MalPEG-750 liofilizado, bem como a maioria dos outros reagentes de acoplamento são sensíveis à hidrólise e devem ser armazenados secos sob a forma de pó liofilizado a-80 ° C.

  1. Para evitar a acumulação de condensação de água sobre o descongelamento dos frascos, armazenar os frascos em tubos maiores (ex., tubos de 50 mL) preenchido com uma almofada de gel de silicone grânulos. Armazene esses tubos em um recipiente maior adequado também preenchido com uma almofada de grânulo de sílica gel.
  2. Antes de fechar firmemente cada tubo e recipiente, troca de ar com gás argônio. Isto pode ser conseguido colocando os tubos abertos e recipientes para exsicador, seguido de remoção e a substituição do ar com gás argônio. Desde que o gás argônio é mais pesado que o ar, tubos e recipientes são preenchidos com gás argon e agora podem ser colocados no outro, com cada tampa bem fechada.
  3. Recipientes de armazenamento a-80 ° C.
  4. Quando descongelar, colocar os recipientes em grânulos de sílica num exsicador lentamente aquecê-los até a temperatura ambiente, e abrir o recipiente.
  5. Ao realizar uma reação de acoplamento, resolva na hora a quantidade de substrato necessário para o solvente apropriado de acoplamento. Tome cuidado para não adicionar mais de 10% de solução de acoplamento para a reação de acoplamento final, especialmente se o DMF ou DMSO é usado como solvente para o substrato de acoplamento.

3. amplificação, purificação e modificação química de vetores de Ad:

  1. Amplificação de vetores Ad
    Nota: As seguintes etapas devem ser realizadas usando um gabinete de segurança de acordo com as regras locais de segurança biológica.
    1. Transfect um vector de Ad replicação deficiente ∆E1 contendo resíduo de cisteína geneticamente introduziu um (ou vários) em células HEK 293 conforme descrito por Kratzer e Kreppel38.
    2. De acordo com o protocolo38, amplifica o vetor por reinfecções sequenciais até uma infecção preparativa final de placas de cultura de célula do 15-20 grandes (15 cm) (aproximadamente 1-2 x 107 células/placa).
      Nota: Idealmente, a reinfecção última deve ser cronometrada para que as células apresentam efeito citopático completo (CPE) na manhã de purificação e modificação de desempenho (ver Figura 2).
    3. Após a etapa de amplificação final, células resuspended no buffer de Ad + 10 mM TCEP (variante B) podem ser congeladas a-80 ° C; no entanto, para o rendimento ideal das partículas de vetor, recomenda-se um seguimento imediato de purificação de vectores e lise celular e modificação.
  2. Modificação da purificação e do produto químico de vetores Ad
    Nota: A purificação de vetores é realizada de acordo com o protocolo de purificação de adenovírus descrito em38Mas em condições não oxidantes. Colheita e lise celular bem como vetor da purificação e do produto químico modificação pode ser realizada dentro de um dia. Colheita e lisar as células infectadas, de acordo com o protocolo descrito anteriormente38.
    1. Recolha pilhas raspando as placas e transferir o sobrenadante para tubos de centrifugação de 200-500 mL.
    2. Gire a solução de célula para 10 min a 400 g de x.
    3. Ressuspender as células em 4 mL de Ad-buffer + 10 mM TCEP (pH 7,2) (variante B) e transferir para um tubo estéril 50 mL. Se o rendimento da célula é baixo ou apenas um fraco CPE foi induzido, resuspenda-lo em 2 mL.
    4. Resgate o vetor por 3 ciclos de congelamento (em azoto líquido) e degelo (em banho-maria a 37 ° C).
    5. Girar para 10 min a 5.000 x g a 4 ° C.
    6. Durante a centrifugação, prepare dois gradientes de passo iguais CsCl:
      1. Primeiro, como a fase inferior, adicione 3 mL de 1,41 g/cm3 ρCsCl no buffer de Ad + 0,5 mM TCEP (pH 7,2, variante C) para os tubos de se. Marca o nível da fase inferior do tubo antes de carregar a fase superior.
      2. Pilha cuidadosamente a fase superior de 5 mL de 1,27 g/cm3 ρCsCl no buffer de Ad + 0,5 mM TCEP (pH 7,2, variante C) pipetando muito lentamente o volume de 5 mL ao longo das paredes do tubo para a fase inferior.
        Nota: Desde durante o acoplamento uma alta concentração de TCEP poderia reagem com o resíduo de maleimide de malPEG-750 e levar a eficiência reduzida do acoplamento, purificação de CsCl gradiente passo precisa ser executada já sob uma concentração reduzida de TCEP.
    7. Carregar o sobrenadante para o gradiente de CsCl [também igualmente dividir o sobrenadante para ambos os gradientes ou, no caso de um rendimento baixo vector (veja acima), carregar o sobrenadante para apenas uma coluna] e preencher ambos os gradientes igualmente ao topo com buffer de Ad + 10 mM TCEP (pH 7 .2, variante B).
    8. Ajuste o peso dos tubos opostos a uma diferença de peso g 0.0.
    9. Se durante 2 h a 176.000 x g a 4 ° C.
    10. Com uma pinça, fixe o tubo de ultracentrifugação a um carrinho, deixando a área em torno da marca de nível inferior fase acessível. Coloque a lâmpada do gooseneck acima do tubo. Em torno da marca, na fronteira entre as fases superiores e inferiores, uma banda distinta (os virions de vetor) deve ser visível (Figura 3A-3 C).
    11. Recolha os vetores de perfurar o tubo com uma agulha e aspirantes a banda de vetor em uma seringa. Transfira virions vector coletados para um tubo de 15 mL.
      Nota: Bandas mais fracas acima da faixa de vetor Ad contêm partículas vector incompleta e devem ser evitadas para aspiração. Os detritos celulares e verde proteína fluorescente (EGFP) de vetores-Ad EGFP-expressando coletará na parte superior do se do tubo (ver Figura 3A e 3B). Isto e as etapas a seguir para acoplamento (etapa 3.2.16) devem ser realizadas rapidamente, como os vetores são agora sensatos dissulfeto de ligação devido a baixa concentração de TCEP.
    12. Para calcular a quantidade de substrato de acoplamento necessário para a ligação completa do substrato para todos os resíduos de cisteína na preparação vetor eficiente, medir OD260:
      1. De acordo com o protocolo descrito por Kratzer e Kreppel38, vórtice, uma mistura de 10 µ l de virions o vetor coletado, 89 µ l de tampão de Ad e 1 µ l de SDS 10%. Como uma ponta de prova em branco, vórtice 99 µ l de buffer de Ad e 1 µ l de SDS 10%.
      2. Para desnaturar os virions, incube ambos a 56 ° C por 10 min.
      3. Determine OD260.
      4. Calcular o título de vetor físico por µ l utilizando a seguinte equação: OD260 x fator de diluição x coeficiente de extinção empiricamente determinada de Ad (1,1 x 109 partículas de vetor = 1260 OD unidade / µ l). Portanto, uma medida de OD260 de 1,36 de um vetor diluído 01:10, calcularia para: 1,36 x 10 x 1.1 x 109 = aproximadamente 1,5 x 1010 vector partículas / µ l.
        Nota: Este título é apenas uma estimativa grosseira; no entanto, é suficientemente preciso para os cálculos estequiométricos descritos a seguir.
    13. Dependendo da proteína modificada pela introdução de uma cisteína, determinar a quantidade de substrato de acoplamento (em gramas) por uma reação de acoplamento eficiente, de acordo com a seguinte equação geral: título de vírus x Volume x número de cisteínas x excesso de moiety x Molecular peso de agrupamento / 6.022 x 1023 = gramas de substrato de acoplamento.
      Nota: nesta equação: título 1) vírus é o título / µ l, determinado pelo OD260 conforme descrito acima, as contas do volume 2) para o volume em µ l de aspirava vector utilizado na reação de acoplamento, 3) o número de cisteínas é o número de proteínas nas quais a cisteína resíduo foi introduzido por partículas de vetor, 4) excesso de agrupamento é o fator de excesso necessário de agrupamento para uma reação de acoplamento eficiente (50x) e 5) o peso molecular do agrupamento deve ser introduzido como promotor (não kDa).
    14. Na hora de resolver a quantidade do composto (ou quantidade viável) necessários no solvente apropriado.
      Nota: Como a quantidade de substrato de acoplamento necessário é baixo e difícil de pesar, mas caro, pesar a quantidade mínima de possíveis compostos e dissolvê-lo em uma concentração adequada para a aplicação para a reação de acoplamento.
    15. Transferir a solução do vetor para um tubo de tamanho apropriado (por exemplo, tubo de 2 mL) e adicionar a quantidade calculada de solução estoque composta de acoplamento para o vetor.
    16. Misture suavemente a solução por cima rotação por 1h à temperatura ambiente.
    17. Encha-se a solução do vetor para o volume total de 6 mL com Ad-tampão (pH 7,6, variante A).
      Nota: Este passo deve ser executado antes que a solução é aplicada ao gradiente passo para garantir que a solução do vetor, que ainda contém CsCl de gradiente primeiro passo, tem uma densidade abaixo de 1,27 g/mL.
    18. Em uma segunda etapa de bandas CsCl, purifica o vetor da fracção não tenha reagido de acoplamento:
      1. Prepare dois gradientes de passo iguais CsCl executando as seguintes etapas para cada um: fase 1) inferior: 3 mL de 1,41 g/cm3 ρCsCl em Ad-tampão (pH 7,6, variante A), 2) marca de nível da fase inferior do tubo antes de carregar a fase superior e fase 3) superior : 5 mL de 1,27 g/cm3 ρCsCl em Ad-tampão (pH 7,6, variante A).
        Nota: Depois de acoplamento tem tomado lugar, buffers sem TCEP são usados, como não há grupos tiol livre agora devem estar presentes na capsids do vetor.
      2. Carregar o sobrenadante para o gradiente de CsCl e preencher ambos os gradientes igualmente ao topo com Ad-tampão (pH 7,6, variante A).
      3. Ajuste os pesos dos tubos opostos a uma diferença de peso g 0.0.
    19. Se durante 2 h a 176.000 x g a 4 ° C.
    20. Pouco antes do final de ultracentrifugação, equilibrar uma coluna de PD-10 5 vezes com 5 mL de Ad-tampão (pH 7,6, variante A).
    21. Como feito na etapa 3.2.10, arranjar o tubo de ultracentrifugação ficar deixando a área em torno da marca de nível inferior fase acessível. Coloque a lâmpada do gooseneck acima do tubo. Novamente, em torno da fronteira entre as fases superiores e inferiores, uma banda distinta (os virions vector) deve estar visível (Figura 3).
    22. Recolher os vetores de perfurar o tubo com uma agulha e aspirantes a banda de vetor em uma seringa e transferir o vetor para um tubo de 15 mL. Tome cuidado para coletar os virions de ambos os tubos gradientes juntos como um volume total de 2,5 mL ou menos. Se um volume menor é coletado, encha para obter um volume total de 2,5 mL com tampão de Ad (variante A).
    23. Carrega a 2,5 mL para o PD-coluna equilibrada. Descarte o escoamento.
    24. Adicionar 3 mL de tampão de Ad (variante A) na coluna e coletar o escoamento (contendo os virions vector purificada).
    25. Adicionar o glicerol (µ l 333) para obter uma concentração final de 10% e dividir em alíquotas apropriadas (por exemplo, 400 µ l cada) e incluem uma alíquota de 20 µ l para determinação do título pela medição de OD260 .
    26. Armazenar a solução do vetor a-80 ° C.
    27. Determine o título de vetor medindo o OD260 de 20 µ l vector solução, 79 µ l de buffer de Ad (variante A) e 1 µ l de SDS 10% conforme descrito na etapa 3.2.12. Como um espaço em branco, use µ l 79 de Ad-buffer (variante A), 10 µ l de glicerol a 10% e 1 µ l de SDS 10%.
    28. Calcular o título de vetor como: OD260 x fator de diluição x 1.1 x 109 vetor partículas / µ l.
      Como preparado na etapa 3.2.27, calcular: OD260 x 5 x 1.1 x 109 vetor partículas / µ l

4. verificação de acoplamento por SDS-PAGE:

Nota: Se compostos com suficientemente altos pesos moleculares são usados para acoplamento de virions Ad, acoplamento pode ser verificado por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Engate bem sucedido então deve resultar em uma mudança da banda proteína correspondente à proteína de vírion Ad modificada, em comparação com a proteína no vírion Ad não modificada (ver Figura 4).

  1. De acordo com o título calculado do vetor (etapa 3.2.28), separe o 1-2 x 1010 partículas de vetor por SDS-PAGE (8%).
  2. Desenvolva o gel por coloração de prata do gel de39 para detectar proteínas mesmo fraco bandas:
    1. Prepare os amortecedores para coloração prata (os montantes necessários para 100 mL de tampão são indicados entre parênteses):
      1. Preparar o tampão 1 misturando 38 mL de DDQ2O, 50% MeOH (50 mL de MeOH 100), 12% AcOH (12 mL de 100% AcOH) e 0.0185% HCHO (50 µ l de 37% HCHO).
      2. Preparar o tampão 2 Adicionando 50% EtOH (50 mL de 100% EtOH) a 50 mL de DDQ2O.
      3. Preparar o tampão 3 adicionando 0,127 g/L at2S2O3 (12,744 mg) para 100 mL de DDQ2O.
      4. Preparar o tampão 4 adicionando 2 g/L de AgNO3 (0,2 g) e 0.0185% HCHO (50 µ l de 37% HCHO) para 100 mL de DDQ2O.
      5. Preparar o tampão 5 adicionando 60 g/L Na2CO3 (6 g), 0.0185% HCHO (50 µ l de 37% HCHO) e 2,5 mg/L Na2S2O3 (0,256 mg) de DDQ2O para obter um volume final de 100 mL.
      6. Preparar o amortecedor 6 misturando 38 mL de DDQ2O, 50% MeOH (50 mL de 100% MeOH) e 12% AcOH (12 mL de 100% AcOH).
      7. Prepare o tampão 7 pela mistura de 60 mL de DDQ2O, 30% MeOH (30 mL de 100% MeOH) e 10% de glicerina (10 mL de glicerina 100%).
      8. Prepare o buffer de 8 pela mistura de 10% de glicerina (10 mL de glicerina 100%) com 90 mL de DDQ2O.
  3. Realizando a coloração prata
    1. Corrigi o gel no buffer 1 por 30 min.
    2. Lave o gel no buffer 2 por 15 min.
    3. Pré-tratamento o gel no buffer de 3 para 1 min.
    4. Lave o gel 3 vezes em ddH2O por 20 s.
    5. Impregnar o gel no buffer de 4 por 20 min.
    6. Lave o gel 2 vezes em ddH2O por 20 s.
    7. Desenvolver o gel no buffer 5 até bandas são visíveis (10 s-10 min).
    8. Lave o gel 2 vezes em ddH2O por 2 min.
    9. Pare o desenvolvimento no buffer 6 por 5 min.
    10. Conserve o gel no buffer 7 por 20 min.
    11. Armazene o gel em buffer de 8.
      Nota: Eficiência de acoplamento pode ser determinada pela quantificação densitométricos das bandas modificadas e não modificadas do Capsómero alvo.

Resultados

A Figura 2 mostra exemplos do efeito citopático (CPE) em 293 células (HEK 293) que indica a produção bem sucedida do vetor. As células devem mostrar morfologia (Figura 2) 40-48 horas após a inoculação com o vetor de vírus. O Commit certo para a colheita é crucial para não perder as partículas do vírus por lise celular e impedindo a oxidação dos grupos tiol geneticamente introduzido. Se partículas de vetor são lib...

Discussão

A eficiência, pelo qual as cisteínas geneticamente introduzidas podem ser quimicamente modificadas normalmente é 80-99%, e certas variáveis influenciam essa eficiência. Em primeiro lugar, é fundamental que as cisteínas geneticamente introduzidas não sofrem oxidação prematura. Apesar de ser bem protegida no ambiente de redução das células de produtor, é obrigatório para fornecer um ambiente não-oxidativo após liberar partículas de vetor de células o produtor e durante a modificação química. Para este...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Vector purification and chemical modification
Argon gasAir liquidelocal gas dealer
Liquid NitrogenAir liquidelocal gas dealer
500 mL centrifuge tubesCorning431123
Stericup Express Plus 0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)Sigma-AldrichC4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes)Henke Sass Wolf4020.000V0
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm)Henke Sass Wolf4710009040
Caesium chloride 99.999% Ultra QualityRoth8627.1
Silica gel beadsApplichemA4569.2500
Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750)Iris Biotechstore in silica gel beads at -80 °C
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge TubesBeckman Coulter344059only open in hood
PD-10 size exclusion chromatography columnGE Healthcare17-0851-01store at 4 °C
HepesAppliChemA1069.1000
SDS UltrapureAppliChemA1112,0500
GlycerolAppliChemA1123.1000
NameCompanyCatalog NumberComments
Material for cell-culture
DPBSPAN BiotechP04-36500
DMEMPAN BiotechP04-03590
Trypsin/EDTAPAN BiotechP10-0231SP
FBS GoodPAN BiotechP40-37500
Penicillin/StreptomycinPAN BiotechP06-07100
Biosphere Filter Tips (various sizes)Sarstedt
Serological Pipettes (various sizes)Sarstedt
reaction tubes (various sizes)Sarstedt
TC plates 15cmSarstedt83.3903
NameCompanyCatalog NumberComments
Material for silver staining protocol
MethanolJ.T.Baker8045
Ethanol absoluteAppliChem1613,2500PE
Acetic AcidAppliChemA0820,2500PE
Formaldehyde 37%AppliChemA0877,0250
Ethanol absoluteAppliChemA1613,2500PE
Sodium thiosulfateAppliChem1,418,791,210
Silver nitrateAppliChemA3944.0025
Sodium carbonateAppliChemA3900,0500
NameCompanyCatalog NumberComments
Special Lab Equipment
DesiccatorNalgene5311-0250
Megafuge 40Heraeus
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubesHeraeus
Water bathConventional
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80Beckman Coulter
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41Beckman Coulter
pH -MeterConventional
Stand with clampsConventional
Goose neck lampConventional
Over-head rotorConventional
Thermal BlockConventional
Photometer (OD 260)Conventional

Referências

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