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요약

여기에 설명 된 프로토콜 연구자를 특별히 선택 된 사이트에 아 데 노비 루스 capsids 간단한 화학 수정에 있습니다. 차폐 된 아 데 노 바이러스 벡터 입자 대상이 유전자 전달 벡터 생성 될 수 있습니다, 그리고 벡터 호스트 상호 작용은 공부 될 수 있다.

초록

아 데 노 바이러스 벡터는 유전자 백신 접종과 oncolytic virotherapy 위한 강력한 도구입니다. 그러나, 그들은 특히 vivo에서 배달 후 여러 원치 않는 벡터-호스트 상호 작용 하는 경향이 있다. 정의 된 벡터 표면 수정 수행 하는 경우 원치 않는 벡터-호스트 상호 작용에 의해 부과 된 제한 에서만 수 합의 극복할 수입니다. 이러한 수정에는 원치 않는 상호 작용에서 입자의 차폐 및 새로운 ligands의 도입에 의해 대상으로 포함 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜의 목표 생성 하 리더를 사용 하는 차폐 하 고, 원하는 경우, 인간의 아 데 노 바이러스 유전자 전달 벡터 또는 oncolytic 바이러스 대상이 변경. 프로토콜에는 아 데 노 바이러스 벡터 capsids 표면 합성 고분자, 탄수화물, 지질, 또는 다른 생물학 또는 화학 moieties의 특정 화학 첨부 하 여 수정 하는 연구자 수 있게 된다. 이해 고의 비보에 아 데 노 바이러스 벡터의 배달에 대 한 장벽을 극복 하 보였다 결합 된 유전과 화학 capsid 수정의 최첨단 기술을 설명 합니다. 생물학적으로 활성 바이러스 또는 바이러스 유래 벡터가 특정 화학 반응을 수행 하기 위한 중요 한 단계는 상세 하 고 주석 설명 제공 됩니다. 프로토콜에서 설명 하는 기술 (자연스럽 게 결 석) 시스테인의 유전자 도입에 따라 파생 하는 아 데 노 바이러스 벡터의 솔벤트 노출 반복으로 잔류물. 이 시스테인 잔류물, 높은 titers 벡터의 생산, 후 악용 될 수 있는 매우 특정 하 고 효율적인를 벡터 다양 한 물질 클래스에서에서 분자의 화학식 화학 결합에 대 한 특정 화학 반응성을 제공 입자입니다. 중요 한 것은,이 프로토콜 아 데 노 바이러스 벡터 capsids의 다른 (비-thiol 기반) 화학 수정의 광범위 한 다양 한 수행 하 쉽게 적응 될 수 있다. 마지막으로, 그것은 가능성이 그 비 싸여 바이러스 기반 유전자 전달 벡터 보다 다른이 프로토콜의 기초에서 아 데 노 바이러스를 수정할 수 있습니다.

서문

Adenoviruses (광고), Adenoviridae, 가족의 구성원은 비 싸여 DNA 바이러스의 70 이상 종류를 지금까지 확인 된 (http://hadvwg.gmu.edu) 되었습니다. Hemaglutination 속성, 게놈 구조 및 시퀀싱 결과 따라 70 광고 종류 7 종 (인간의 adenoviruses g A)1,2로 나눌 수 있습니다. 인간의 광고 게놈 크기에서 38 kb 이며 icosahedral nucleocapsid3에 의해 캡슐. 그들의 풍부 때문에 capsid 단백질 hexon, penton 기지와 섬유는 모두 라고 하 주요 capsid 단백질. 가장 풍부 하 고 큰 capsid 단백질 hexon 12 hexon homotrimers,45의 구성 된 각 20 capsid 측면을 형성 한다. 펜 톤, 각 icosahedral 가장자리 (정점)에 있는 펜 톤 베이스의 pentamers의 구성 되어 있으며 당화 섬유 trimers5,6의 내장 된 버텍스 스파이크에 대 한 자료를 나타냅니다. 기본 광고 셀 항목 기본적으로 두 가지 주요 단계로 구성 됩니다. 첫째, 섬유 손잡이 기본 수용 체에 바인딩합니다. A, C, E 및 F 종에서 광고 종류, 콕 사키와 아 데 노비 루스 수용 체 (차)입니다. 이 상호 작용 함으로써 기본 펜 톤에 따라서 유도 세포 응답 셀룰러 integrins와 RGD 모티브 간의 상호 작용을 촉진 셀 표면의 공간 근접으로는 virion을 제공 합니다. 둘째, 골격에 변화 virion endosome7전송의 국제화 이어질. 출시는 virion는 endosome의 부분 분해 시 세포질에 및 궁극적으로 복제에 대 한 핵에 여행.

동안 광고를 로컬로 배달 될 수 있다 (예., 유전 접종), onco-virotherapy에 필요한 혈 류를 통해 조직의 배달 여러 장벽에 직면. 혈 류에서 순환 하는 동안 삽입 된 virions 숙주의 면역 체계, 바이러스 기반 벡터의 빠른 중립화를 선도 하 고 조직의 응용 프로그램에 매우 비효율적인 광고 기반 벡터 렌더링의 방어 시스템을 발생 합니다. 또한, 광고의 자연 hepatotropism 체계 납품을 방해 하 고 그것의 새로운 대상 셀에 광고를 확인 해야 합니다.

생식 인코딩 자연 IgM 항 체는 타고 난 면역 시스템의 신속 하 게 인식 하 고 virion8,9의 표면에 매우 반복적인 구조를 바인딩합니다. 이 면역성이 있는 복합물을 빨리 보완-중재 무력화 virions8의 큰 부분으로 이끌어 보완 시스템의 클래식과 비 클래식 경로 활성화. 광고 virions의 주요 제거의 결과로 두 번째 통로10 대 식 세포 의해 중재 및 급성 독성 및 haemodynamic 부작용11,12. 광고의 경우 특히, Kupffer 세포 간에 바인딩할 및 phagocytically 광고 virions 통해 특정 폐품 수용 체, 그로 인하여 채택 그들에서 제거는 혈액13,14,15 . LSE 셀 또한 벡터 제거17, 하지만 어느 정도 여전히 명확한 필요에 기여 하는 것와 특정 폐품 수용 체는 또한 간 사인 내 피 세포 (LSE)16에 발견 되었습니다. 또한, 일부 광고 종류와 그들의 파생된 벡터 효율적으로 인간의 적혈구18 에 그들은 바인딩 통해 자동차 또는 보완의 수용 체 CR119에 의해 격리 됩니다. 참고,이 봉쇄 메커니즘 인간의 적혈구에 대조에서 마우스 모델 시스템에서 공부 될 수 없습니다, 그리고 마우스 적혈구 자동차를 표현 하지 않습니다.

특정 안티 광고 항 체 적응 면역 시스템에 의해 생성 된 광고 중 광고와 함께 이전 감염 때문에 노출 후 또는 조직의 응용 프로그램에 첫 번째 배달 후 광고 벡터의 효과적인 사용을 더 방 벽 올리고 그들에 피할 해야 합니다. 효율적인 조직 배달 합니다.

마지막으로, 광고 종류의 (를 포함 하 여 Ad5) 심각 하 게 강한 hepatotropism 응용 프로그램 광고의 조직 치료에 방해가 됩니다. 이 차 있는 굴곡이 운동 hepatocyte 변환 결과 혈액 응고 요인 X (FX), 광고 hexon 단백질20,,2122와 FX의 상호 작용에 의해 중재를 광고 virion의 높은 선호도 때문 이다. FX는 hepatocytes20,23,,2425의 표면에 헤 파 린 황산 염 glycans (HSPGs)에 virion 교량. 이 상호 작용에 대 한 중요 한 요소는 다른 세포 유형에 HSPGs에서 별개의 N-및 O-sulfation 간세포24, HSPGs의 특정 정도 될 것으로 보인다. 이 FX 중재 통로, 뿐만 아니라 최근의 연구 추가 경로 아직 hepatocytes26,,2728의 Ad 변환에 그 결과 확인 것이 좋습니다.

최근에, 그것은 보였다 FX 광고, hepatocyte 변환에만 관여 하지 않습니다 하지만 또한 바인딩, 여는 virion 중화에 대 한 바이러스 입자 방패 보완 시스템26여. FX 바인딩 방지 하 여 hepatocyte 변환의 감소 따라서 것 만들 광고 중화를 통해 증가의 원치 않는 부작용 타고 난 면역 계통.

벡터와 호스트 유기 체 사이의 복잡 한 상호 작용의 깊은 지식을 따라서 호스트의 유기 체에 의해 부과 하는 장애물을 회피 하는 조직의 응용 프로그램에 대 한 보다 효율적인 벡터를 개발 하는 데 필요한입니다.

원래 치료 단백질을 위해 사용 된 1 개의 전략은 적어도 부분적으로 위의 기술된 장벽을 극복 하기 위해 광고 벡터에 대 한 적응 되었습니다. Antigenicity와 immunogenicity 치료 단백질 화합물의 결합 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)29,30감소 될 수 있습니다. 따라서, 말뚝 등 폴 리 [N-(2-여기) methacrylamid] 고분자의 화학식 커플링 (pHPMA)는 capsid를 표면 보호 원치 않는 벡터-호스트 상호 작용에서 벡터. 일반적으로, 중합체는 capsid 표면에 무작위로 배포 되는 리 사이드 잔류물에서 대상 ε-아민 그룹을 결합 하는. 솔루션에서 벡터 입자, 연결 된 고분자의 친수성 특성상 둘러싸여 면역 세포 인식 또는 효소 저하의 위험을 줄이고 안정적인 물 쉘. 또한, PEGylated 광고 벡터 안티-hexon 항 체에서 생체 외에서 그리고 vivo에서미리 면역된 생쥐31중립화를 피하기 위해 보였다. 유전 capsid 수정, 달리 고분자의 화학 결합은 수행 생산 및 정화, 동시 뿐만 아니라 기존의 프로듀서 셀 및 높은 titer 벡터 주식의 뿐만 아니라 생산의 사용을 허용 capsid 표면에 아미노산의 수천의 수정. 그러나, 높은 heterogeneities에 확장 하 고 특정 capsomers의 수정에 대 한 허용 하지, 전체 capsid 표면에 걸쳐 무작위로 발생 차폐 아민 감독 합니다. 또한, 유익한 효과에 필요한 대형 폴리머 moieties 바이러스 bioactivity32손상.

이러한 한계, Kreppel 외극복 한다 33 벡터 다시-와-타겟팅에 대 한 geneti-화학 개념을 도입 했다. 시스테인 유전자 섬유가 루프33, 단백질 IX34및 hexon35,36같은 용 매에 노출 된 위치에 바이러스 capsid로 소개 되었다. 비록 하지 자연스럽 게 발생, 시스테인 베어링 광고 벡터 정상 프로듀서 셀에서 높은 titers에서 생산 수 있습니다. 중요 한 것은, 삽입 단일 capsomer 내의 다른 위치에 특정 capsomers에 시스테인의 thiol 그룹 반응 moieties의 매우 구체적인 수정 할 수 있습니다. Geneti-화학 이렇게 광고 벡터 디자인에 수많은 장애물을 극복 하기 위해 표시 되었습니다. Detargeting 및 섬유 노브이 루프 입증 된 성공적으로 대상을 수정 자동차 불충분 한 세포33광고 벡터 처리가의 thiol 기반 결합 아민 기반 PEGylation의 조합입니다. Hexon는 (중화 항 체, 혈액 응고 인자 FX) 가장 원치 않는 상호 작용에 관여 하 고, 이후 thiol 기반 수정 전략 hexon에도 적용 했다. Hexon의 HVR5에 작은 말뚝 moieties 커플링 큰 말뚝 moieties hepatocyte 변환14,35증가 하는 반면 광고 벡터 입자 transduce SKOV-3 셀 FX, 존재를 방지. 광고 벡터 입자 섬유 손잡이 자동차 바인딩 억제 및 FX (및 위치-특정 PEGylation 위한 HVR1에 삽입 베어링 시스테인)의 HVR7 억제 바인딩 돌연변이 나르는 중화 항 체와 보충 중재를 피하기 위해 보였다 뿐만 아니라, infectivity의 손실 없이 폐품 수용 체-중재 통풍 관. 흥미롭게도, 자연 FX 방패의 부족에도 불구 하 고 PEGylation 다시 향상 hepatocytes의 변환 못 크기36의 기능으로. 그러나, 그것을 세포내 매매 프로세스에 영향을 미칠지 않습니다 공유 차폐 표시 했다. Prill 외. pHPMA에 기반 하 고 차폐도 공동 폴리머의 어느 모드 셀 항목에 영향을 했다 하지만 입자 핵을 인신 매매에 영향을 증명 bioresponsive 방패 대 돌이킬 수 없는 비교. 긍정적으로 위탁된 한 pHPMA 공동 폴리머 입자 광고의 높은 변환 효율성을 유지 하는 핵을 인신 매매에 대 한 허용으로 bioresponsive 방패를 고용 생체 외에서 그리고 vivo에서37벡터 스

요약 하자면, 이러한 데이터 나타냅니다, 모든 벡터 호스트 상호 작용 알려져 하 고 고려 했다 가정 에서도 과도 한 capsid 표면 수정 관련 조직의 벡터 배달 된 장애물을 극복 하는 데 필요한.

여기 우리는 차폐 및 oncolytic 아 데 노비 루스 기반 바이러스 및 아 데 노 바이러스 벡터 입자의 retargeting 아 데 노 바이러스 벡터 capsids의 사이트별 화학 수정 작업을 수행 하는 프로토콜을 제공 합니다. 이 기술의 개념은 그림 1에 설명 되어. 합성 고분자의 공유 첨부 파일에 의해 원치 않는 상호 작용에서 capsid 지역 특정의 차폐 수 있습니다. 동시, ligands를 연결 하 고 차폐 및 대상으로 하는 수단을 제공 합니다. 간단한 화학을 사용 하 여, 경험 covalently 수정 아 데 노 바이러스 벡터 표면 분자 펩 티 드/단백질, 탄수화물, 지질를 포함 하 여 및 다른 작은 분자의 다양 한 수 있을 것입니다. 또한, 프로토콜은 그들의 생물 학적 무결성 및 활동의 유지 관리에서 생물학적으로 활성 바이러스 파생 벡터의 화학 수정에 대 한 일반적인 개념을 제공합니다.

프로토콜

참고:에서 다음과 같은, geneti 화학 PEGylation 벡터 세부 사항에 설명 하는 광고에 대 한 프로토콜. PEG moiety의 특정 연결을 사용 하려면 Ad5 벡터는 미리 유전자 이전 간행물36의 경우와 maleimide 활성화 못에 설명 된 대로 하이퍼 루프 5에서 hexon 단백질에 시스테인 잔류물을 도입 하 여 수정 화합물 화합물 커플링으로 사용 됩니다.

1. CsCL 단계 기울기로 벡터 정화에 대 한 버퍼의 준비

  1. 아 데 노비 루스 버퍼 (광고-버퍼)의 400 mL 50 mM HEPES (4.76 g/400 mL)을 추가 하 여 준비 및 150 m m NaCl (3.504 g/400 mL) 이중 증 류 물 (ddH2O). 350 mL이이 버퍼의 다음 3 개의 광고 버퍼 이체 준비 필요 합니다.
    1. 변형 a: 150ml 광고 버퍼의 pH 7.6 NaOH로 조정 합니다.
    2. 변형 b: 50 ml 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.143 g]의 최종 농도 추가 하 고 HCl로 pH 7.2에 조정.
    3. 변형 c: 150 mL에 0.5 m m TCEP (0.022 g)의 최종 농도 추가 하 고 HCl로 pH 7.2에 조정.
    4. DdH2O 버퍼 준비 및 분석 급료 화학 제품. 변종 A 및 변형 C의 각 100 mL 준비 CsCl 버퍼를 사용 하 여 (참조 단계 각각 1.2와 1.3; 50 mL) CsCl 단계 그라디언트에 필요한 (단계 3.2.6 참조. 그리고 3.2.18).
  2. CsCl 단계 그라데이션 버퍼를 준비 (ρCsCl = 1.41 g/cm3) 광고-버퍼에
    참고:이 버퍼 두 다른 유사에 필요 하 게 됩니다.
    1. 두 aliquots CsCl의 50 mL 튜브에 정확히 27.42 g의 무게.
    2. ΡCsCl = 1.41/TCEP 버퍼: CsCl 광고 버퍼의 변종 C 40 mL에 해결.
    3. ΡCsCl = 1.41 버퍼: CsCl 광고 버퍼의 변종 A 40 mL에 해결.
    4. 확인 하 고 필요한 경우 조정 산도 HCl. 채우기와 해당 광고 버퍼 변종 정확 하 게 50 mL까지. 정확한 CsCl 농도 pH 최고의 분리 결과 얻기 위해 결정적 이다.
    5. 각 그라데이션 버퍼의 1 mL (1.41 g)를 무게 밀도 (CsCl 콘텐츠를) 확인 합니다.
  3. CsCl 단계 그라데이션 버퍼를 준비 (ρCsCl = 1.27 g/cm3) 광고-버퍼에
    참고:이 버퍼 두 다른 변형이 필요 하다:
    1. 두 aliquots CsCl의 50 mL 튜브에 정확히 18.46 g의 무게.
    2. ΡCsCl = 1.27/TCEP 버퍼: CsCl 광고 버퍼의 변종 C 40 mL에 해결.
    3. ΡCsCl = 1.27 버퍼: CsCl 광고 버퍼의 변종 A 40 mL에 해결.
    4. 확인 하 고 필요한 경우 HCl로 pH를 조정. 마지막으로, 해당 광고 버퍼 변종 정확 하 게 50 mL까지 입력 합니다. 정확한 CsCl 농도 pH 최고의 분리 결과 얻기 위해 결정적 이다.
    5. 각 그라데이션 버퍼의 1 mL (1.27 g)를 무게 밀도 (CsCl 콘텐츠를) 확인 합니다.
  4. (0.45 μ m 메쉬 기 공 크기를 사용 하 여) 여과 멸 균 병에 의해 모든 버퍼 (광고 버퍼 및 CsCl 단계 그라데이션 버퍼)를 소독.
  5. 살 균 후 TCEP의 산화를 방지 하기 위해, 포화 및 아르곤 아르곤 가스 약 30 버퍼 sparging 여 TCEP 포함 하는 버퍼를 오버레이 s. 만 살 균 장치를 사용 하 여 처리 (예., 살 균 플라스틱 팁) 아르곤 가스와 아르곤 경지 수 있도록 충분히 큰 사용 병을 적용할 때.
    참고: 모든 버퍼 신선 하 고 빛 으로부터 보호 준비 해야 하 고 몇 일 동안 4 ° C에서 저장 될 수 있다 (특히 CsCl 단계 그라데이션 버퍼만 몇 일 동안 보관 해야 하는).

2. 커플링 Moieties: 저장 및 준비

참고: Moeities 시스테인 위해 사용 thiol 반응 그룹을 부담 해야 합니다. Maleimide 활성화 화합물 유전자 도입된 시스테인 안정 thioether 유대를 형성할 것 이다. 또는 직교-pyridyldisulfide (OPSS)-는 벡터 입자 사이의 커플링 moiety bioresponsive 이황화 다리 형성 활성화 화합물 사용 될 수 있습니다. 대부분 다른 커플링 시 약으로 동결 건조 된 malPEG-750 가수분해에 민감한 고-80 ° c.에 동결 건조 된 분말의 형태로 건조 저장 한다

  1. 큰 튜브에 튜브 튜브의 녹고 시 물 응축의 형성을 방지 하려면 저장 (예., 50 mL 튜브) 실리 카 젤 구슬의 쿠션으로 가득. 또한 실리 카 젤 비드 쿠션으로 가득 적절 한 큰 컨테이너에이 튜브를 저장 합니다.
  2. 단단히 각 튜브와 컨테이너를 닫기 전에 아르곤 가스와 공기를 교환 합니다. 이 desiccator, 제거 및 아르곤 가스와 공기를 교체 하 여 다음에 오픈 튜브 및 컨테이너를 배치 하 여 얻을 수 있습니다. 아르곤 가스는 공기 보다 무거운, 이후 튜브 및 컨테이너 아르곤 가스로 채워 고 이제 각 뚜껑 긴밀 하 게 폐쇄와 함께, 서로에 배치할 수 있습니다.
  3. -80 ° c.에 컨테이너를 저장
  4. 녹고 때 a desiccator에 실리 카 구슬에 컨테이너를 배치와 천천히 실내 온도까지 그들을 따뜻한 다음 컨테이너를 엽니다.
  5. 커플링 반응 수행, 갓 적절 한 용 매에 필요한 기판 커플링의 양을 확인 합니다. 알아서 하지 DMF 나 DMSO 커플링 기판에 대 한 용 매로 사용 되는 경우에 특히 솔루션 최종 커플링 반응에 커플링의 10%를 추가.

3. 증폭, 정화 및 광고 벡터의 화학 수정:

  1. 광고 벡터의 증폭
    참고: 다음 단계에 따라 수행 되어야 합니다 로컬 생물 안전 규칙에 따라 안전 캐비닛을 사용 하 여.
    1. 하나 (또는 여러) 유전자 도입된 시스테인 residue(s)를 포함 하는 Kratzer 및 Kreppel38에 의해 설명 된 대로 HEK 293 세포로 복제 결핍 ∆E1 광고 벡터 transfect
    2. 38프로토콜 따라 15-20 큰 (15 cm) 세포 배양 배지 (107 셀/플레이트 x 약 1-2)의 최종 대리점 감염까지 순차 reinfections에 의해 벡터를 증폭.
      참고: 최적의 마지막 재감염 해야 될 타임 셀 표시 수정 및 정화 성능의 아침에 전체 cytopathic 효과 (CPE) ( 그림 2참조).
    3. 최종 증폭 단계 후 셀 광고 버퍼 + 10mm TCEP (변형 B) resuspended-80 ° C에 얼 수 있다 그러나, 벡터 입자의 최적의 수율, 세포 세포의 용 해 및 벡터 정화 및 수정 즉시 후속 것이 좋습니다.
  2. 광고 벡터의 정화 및 화학 수정
    참고: 벡터의 정화는 아 데 노비 루스 정화 프로토콜에서 설명에 따라 수행38하지만 비 산화 조건 하에서. 세포 세포의 용 해 및 수확 뿐만 아니라 벡터 정화 및 화학 수정 1 일 안에 수행할 수 있습니다. 수확 및 이전에 설명한 프로토콜에 따라 감염 된 세포를 lyse38.
    1. 접시를 근 근이 하 고 200-500 mL 원심 분리 관에는 상쾌한을 전송 하 여 세포를 수집 합니다.
    2. 400 x g에서 10 분 동안 셀 솔루션을 회전 합니다.
    3. 4 mL 광고 버퍼 + 10mm TCEP (pH 7.2) (변종 B) 및 살 균 50 mL 튜브에 셀 펠 릿 resuspend 셀 수익률이 낮은 경우에 또는 단지 약한 CPE 유도 되었다, 2 mL에 resuspend.
    4. (액체 질소)에 중지 및 재개 (에서 37 ° C 물 목욕)의 3 주기에 의해 벡터를 구출.
    5. 4 ° c.에 5000 x g에서 10 분 동안 회전
    6. Centrifuging, 동안 2 개의 동등한 CsCl 단계 그라디언트 준비:
      1. 첫째, 낮은 단계 광고 버퍼 + ultracentrifuge 튜브 0.5 m m (pH 7.2, 변종 C) TCEP 1.41 g/cm3 ρCsCl의 3 mL를 추가 합니다. 위 단계를 로드 하기 전에 튜브에 낮은 단계의 레벨을 표시 합니다.
      2. 조심 스럽게 천천히 매우 낮은 단계에 튜브의 벽을 따라 5 mL 볼륨 pipetting으로 광고 버퍼 + 0.5 m m (pH 7.2, 변종 C) TCEP 1.27 g/cm3 ρCsCl의 5 mL의 상위 단계를 스택.
        참고: 이후 커플링 중 TCEP의 높은 농도 수 malPEG-750의 maleimide 잔류물과 반응 고 이어질 감소 커플링 효율, CsCl 단계 그라데이션 이미 감소 TCEP 농도에서 수행 해야 하 여 정화.
    7. CsCl 그라데이션에 상쾌한 로드 [중 동등 하 게 상쾌한 두 그라디언트에 또는, 낮은 벡터 수확량 (의 위에 보십시오) 분할 하나의 열에 상쾌한 로드], 광고 버퍼 + 10mm TCEP (pH 7 상단에 동등 하 게 모두 그라디언트 채우기 .2, 변종 B)입니다.
    8. 0.0 g 무게 차이에 반대 튜브의 두께 조정 합니다.
    9. 2 h 4 ° c.에 176,000 x g에 대 한 ultracentrifuge
    10. 클램프와 함께 서 서, 낮은 단계 레벨 마크 주위 영역을 액세스할 수 떠나 ultracentrifugation 튜브를 수정 합니다. 튜브 위에 목이 램프를 배치 합니다. 하위 및 상위 단계 사이 국경에 마크 주위 뚜렷한 밴드 (벡터 virions) 표시 (그림 3A-3 C) 해야 합니다.
    11. 바늘으로 튜브를 puncturing과 주사기로 벡터 밴드를 주목 하 여 벡터를 수집 합니다. 15 mL 튜브에 수집 된 벡터 virions를 전송.
      참고: Ad 벡터 밴드 위에 약한 밴드 불완전 한 벡터 입자를 포함 하 고 포부에 대 한 피해 야 한다. 셀 파편 및 녹색 형광 단백질 (EGFP) EGFP 표현 광고-벡터는 ultracentrifuge의 상단 부분에 수집 합니다 튜브 ( 그림 3A 및 3B참조). 이 고 다음 단계 (단계 3.2.16) 커플링까지 수행 되어야 한다 신속, 벡터는 이황화 결합 낮은 TCEP 농도 때문에 재치 있는 지금.
    12. 커플링 기판 벡터 준비에 모든 시스테인 잔류물을 기판의 효율적인 완벽 한 바인딩에 필요한 금액을 계산 하려면 OD260측정:
      1. Kratzer 및 Kreppel38, 소용돌이 수집된 벡터 virions의 10 µ L의 혼합물, 89 µ L 광고 버퍼의 그리고 10 %SDS 1 µ L에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라. 빈 프로브, 광고-버퍼의 소용돌이 99 µ L 10 %SDS 1 µ L로.
      2. virions 변성을 모두 10 분 동안 56 ° C를 품 어.
      3. OD260를 확인 합니다.
      4. 다음 수식을 사용 하 여 µ L 당 실제 벡터 titer 계산: OD260 x 광고의 경험적으로 결정된 멸종 계수 x 희석의 요소 (109 벡터 입자 x 1.1 = 1 OD260 단위 / µ L). 따라서, 벡터의 1.36의 측정 된 OD260 1시 10분 희석를 계산 하는 것: 1.36 x 10 x 1.1 x 109 = 약 1.5 x 1010 벡터 입자 / µ L.
        참고:이 titer가입니다만 거친 추정; 그러나, 그것은 다음에 설명 된 화학 량 론 계산을 위해 충분히 정확입니다.
    13. 단백질은 시스테인의 도입에 의해 수정에 따라 다음과 같은 일반적인 방정식에 따라 효율적인 커플링 반응 (그램)에서 커플링 기판의 금액을 결정: 바이러스 titer 볼륨 x x 시스테인의 수 초과 moiety x x 분자 무게 moiety / 6,022 x 1023 = 기판 커플링의 그램.
      참고:이 수식에서: 1) 바이러스 titer는 titer / µ L, 커플링 반응에 사용 되는 했 잖아요 벡터의 µ L에서 볼륨에 대 한 볼륨 2) 계정 위에서 설명한 대로 OD260 에 의해 결정, 3) 시스테인의 수로 단백질의 수는 시스테인 잔류물은 벡터 입자, 4 당 소개 되었다) 초과 moiety moiety 초과 필요한 효율적인 커플링 반응 (50 x), 그리고 5 대의 요소 이다) moiety의 분자량 다 (하지 kDa)으로 도입 해야 합니다.
    14. 갓 화합물의 양을 해결 (또는 가능한 금액) 적절 한 용 매에 필요한.
      참고: 필요한 커플링 기판은 낮은 무게 어렵다 하지만 비싼, 복합 가능한 최소한의 무게와 커플링 반응에 응용 프로그램에 대 한 적절 한 농도에서 그것을 녹.
    15. 적절 한 크기 튜브 (예를 들어, 2 mL 튜브)에 벡터 솔루션을 전송 및 벡터를 복합 재고 솔루션을 커플링의 계산된 금액을 추가.
    16. 부드럽게 실 온에서 1 h에 대 한 오버 헤드 회전 하 여 솔루션을 혼합.
    17. 광고-버퍼 (pH 7.6, 변종 A)와 6 mL 전체 볼륨을 벡터 솔루션을 작성.
      참고:이 단계는 솔루션은 여전히 첫 번째 단계 그라디언트의 CsCl을 포함, 벡터 솔루션 1.27 g/mL 아래 밀도 있다 단계 그라데이션에 적용 하기 전에 수행 되어야 합니다.
    18. 두 번째 CsCl 밴딩 단계에서 정화 unreacted 커플링 moiety에서 벡터:
      1. 각각에 대해 다음 단계를 수행 하 여 두 개의 동일한 CsCl 단계 그라디언트를 준비: 1) 낮은 단계: 광고-버퍼 (pH 7.6, 변종 A) 1.41 g/cm3 ρCsCl의 3 mL 2) 마크 위 단계, 및 3) 위 단계를 로드 하기 전에 튜브에 낮은 단계의 레벨 : 광고-버퍼 (pH 7.6, 변종 A) 1.27 g/cm3 ρCsCl의 5 mL
        참고: 결합 자리를 차지 하 고, 후 TCEP 없이 버퍼로 사용 됩니다, 무료 thiol 그룹이 이제 벡터 capsids에 있어야.
      2. CsCl 그라데이션에 상쾌한 로드 하 고 광고-버퍼 (pH 7.6, 변종 A) 두 그라디언트 상단에 동등 하 게 채우십시오.
      3. 0.0 g 무게 차이에 반대 튜브의 가중치를 조정 합니다.
    19. 2 h 4 ° c.에 176,000 x g에 대 한 ultracentrifuge
    20. Ultracentrifugation의 끝 직전 PD-10 열 5 번 광고-버퍼 (pH 7.6, 변종 A)의 5 mL을 equilibrate.
    21. 3.2.10 단계에서 완료, 수정 액세스할 수 낮은 단계 레벨 마크 주변을 떠나는 서 서 ultracentrifugation 튜브. 튜브 위에 목이 램프를 배치 합니다. 다시, 하위 및 상위 단계 사이의 테두리, 독특한 밴드 (벡터 virions) 표시 (그림 3C) 해야 합니다.
    22. 바늘으로 튜브를 puncturing과 주사기에 벡터 밴드를 주목 하 여 벡터를 수집 하 고 15 mL 튜브에는 벡터를 전송. 2.5 mL 전체 볼륨으로 함께 이하의 두 그라데이션 튜브의 virions를 수집 하는 것을 주의. 작은 볼륨을 수집 하는 경우 광고 버퍼 (변형 A)와 2.5 mL 전체 볼륨을 입력.
    23. 2.5 mL equilibrated PD 열에 로드 합니다. 흐름을 통해 삭제 합니다.
    24. 열에 광고 버퍼 (변형 A) 3 mL를 추가 하 고는 자형 (순화 된 벡터 virions 포함) 수집.
    25. 10%의 최종 농도를 나눌 적당 한 aliquots (예를 들어, 400 µ L 각), 글리세롤 (333 µ L)를 추가 하 고 OD260 측정에 의해 titer 측정 20 µ L의 약 수를 포함.
    26. -80 ° c.에 벡터 솔루션 저장
    27. 20 µ L 벡터 솔루션, 광고-버퍼 (A), 이체의 79 µ L 10% sds 3.2.12 단계에서 설명한 대로 1 µ L의 OD260 을 측정 하 여 벡터의 titer를 결정 합니다. 광고-버퍼 (A), 이체 10 µ L 10% 글리세롤의 그리고 10 %SDS 1 µ L의 79 µ L을 사용 하 여 빈으로 있습니다.
    28. 계산으로 벡터 titer: OD260 x 109 벡터 입자 / µ L x 1.1 x 희석의 요소.
      준비 단계 3.2.27에서에서, 계산: OD260 x 5 109 벡터 입자 / µ L x 1.1 x

4. 커플링 SDS 페이지의 확인:

참고: 지금까지 충분히 높은 분자 무게 화합물 광고 virions 위해 사용 하는 경우에 커플링 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 확인할 수 있습니다. 성공적인 결합 다음 수정 광고 virion 단백질, 단백질 수정 되지 않은 광고 virion에 비해 해당 단백질 밴드의 변화 초래 한다 ( 그림 4참조).

  1. 벡터 (단계 3.2.28)의 계산된 titer에 1-2x 1010 벡터 입자 SDS 페이지 (8%)으로 구분 합니다.
  2. 젤 젤39 도 약한 단백질 밴드를 검출 하기의 실버 얼룩에 의해 개발:
    1. 버퍼 (버퍼의 100 mL에 필요한 금액은 괄호 안에 표시 됩니다)은 착 색에 대 한 준비:
      1. DdH2O, 50%의 38 mL를 혼합 하 여 버퍼 1 준비 MeOH 100 MeOH (50 mL), 12 %AcOH (100%의 12 mL AcOH), 그리고 0.0185 %HCHO (37%의 50 µ L HCHO).
      2. 50%를 추가 하 여 버퍼 2 준비 EtOH (100%의 50 mL EtOH) ddH2오의 50 mL를
      3. DdH2o.의 100 mL 0.127 g/L Na2S2O3 (12.744 밀리 그램)를 추가 하 여 버퍼 3 준비
      4. 2 g/L AgNO3 (0.2 g) 및 0.0185% 추가 하 여 버퍼 4 준비 HCHO (37%의 50 µ L HCHO) ddH2o.의 100 ml
      5. 60 g/L 나2CO3 (6 세대), 0.0185%를 추가 하 여 버퍼 5 준비 HCHO (37%의 50 µ L HCHO), 그리고 2.5 mg/L Na2S2O3 (0.256 mg) ddH2O를 100 mL의 최종 볼륨을.
      6. DdH2O, 50%의 38 mL를 혼합 하 여 버퍼 6 준비 MeOH (100%의 50 mL MeOH), 및 12 %AcOH (100%의 12 mL AcOH).
      7. DdH2O, 30%의 60 mL를 혼합 하 여 버퍼 7 준비 MeOH (100%의 30 mL MeOH), 그리고 10% 글 리세 린 (100% 글 리세 린 10 mL).
      8. DdH2오의 90 mL와 버퍼 8 10% 글 리세 린 (100% 글 리세 린 10ml) 혼합 하 여 준비
  3. 수행은 얼룩
    1. 버퍼 1 30 분 동안에 젤을 수정.
    2. 15 분 동안 버퍼 2에서에서 젤을 씻어.
    3. 1 분 동안 3 버퍼에 젤 pretreat
    4. DdH2O 20 3 회 젤 워시 s.
    5. 버퍼 4 20 분에에서 젤 임신
    6. 워시 젤 2 회 ddH2O 20 s.
    7. 밴드 표시 될 때까지 버퍼 5 젤을 개발 (10 s-10 분).
    8. DdH2O 2 분 동안 2 번 젤 워시.
    9. 5 분에 대 한 버퍼 6에서에서 개발을 중지 합니다.
    10. 버퍼 7 20 분에에서 젤을 절약 합니다.
    11. 버퍼 8에에서 젤을 저장 합니다.
      참고: 커플링 효율 대상된 capsomere의 수정 및 수정 되지 않은 밴드의 densitometric 부 량에 의해 결정 수 있습니다.

결과

그림 2 는 성공적인 벡터 생산을 나타내는 293 (HEK 293) 셀에 cytopathic 효과 (CPE)의 예를 보여 줍니다. 세포는 바이러스 벡터와 접종 후 40-48 시간 형태 (그림 2C)을 표시 합니다. 수확에 대 한 올바른 timepoint 세포 세포의 용 해에 의해 바이러스 입자를 잃지 않는 및 유전자 도입된 thiol 그룹의 산화 방지를 위해 결정적 이다. 벡터 입자 ?...

토론

유전자 도입된 시스테인 수정할 수 있습니다 화학적 효율은 일반적으로 80-99%, 그리고 특정 변수가이 효율에 영향을 미칠. 첫째, 그것은 파라마운트 유전자 도입된 시스테인 조기 산화를 받게 하지 않습니다. 프로듀서 셀의 환 환경에서 잘 보호 되 고, 하는 동안 그것은 화학 수정 동안 프로듀서 셀에서 벡터 입자를 해제 한 후 비 산화 환경 제공 하기. 이 위해 시 약을 줄이고 0.1-10 mM에서 농도에서 ?...

공개

저자는 공개 없다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Vector purification and chemical modification
Argon gasAir liquidelocal gas dealer
Liquid NitrogenAir liquidelocal gas dealer
500 mL centrifuge tubesCorning431123
Stericup Express Plus 0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)Sigma-AldrichC4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes)Henke Sass Wolf4020.000V0
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm)Henke Sass Wolf4710009040
Caesium chloride 99.999% Ultra QualityRoth8627.1
Silica gel beadsApplichemA4569.2500
Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750)Iris Biotechstore in silica gel beads at -80 °C
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge TubesBeckman Coulter344059only open in hood
PD-10 size exclusion chromatography columnGE Healthcare17-0851-01store at 4 °C
HepesAppliChemA1069.1000
SDS UltrapureAppliChemA1112,0500
GlycerolAppliChemA1123.1000
NameCompanyCatalog NumberComments
Material for cell-culture
DPBSPAN BiotechP04-36500
DMEMPAN BiotechP04-03590
Trypsin/EDTAPAN BiotechP10-0231SP
FBS GoodPAN BiotechP40-37500
Penicillin/StreptomycinPAN BiotechP06-07100
Biosphere Filter Tips (various sizes)Sarstedt
Serological Pipettes (various sizes)Sarstedt
reaction tubes (various sizes)Sarstedt
TC plates 15cmSarstedt83.3903
NameCompanyCatalog NumberComments
Material for silver staining protocol
MethanolJ.T.Baker8045
Ethanol absoluteAppliChem1613,2500PE
Acetic AcidAppliChemA0820,2500PE
Formaldehyde 37%AppliChemA0877,0250
Ethanol absoluteAppliChemA1613,2500PE
Sodium thiosulfateAppliChem1,418,791,210
Silver nitrateAppliChemA3944.0025
Sodium carbonateAppliChemA3900,0500
NameCompanyCatalog NumberComments
Special Lab Equipment
DesiccatorNalgene5311-0250
Megafuge 40Heraeus
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubesHeraeus
Water bathConventional
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80Beckman Coulter
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41Beckman Coulter
pH -MeterConventional
Stand with clampsConventional
Goose neck lampConventional
Over-head rotorConventional
Thermal BlockConventional
Photometer (OD 260)Conventional

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