Gravação simultânea de eletrocardiografia e sangue invasiva pressão medida em ratos

Resumo

Aqui, descrevemos uma configuração para gravação simultânea do eletrocardiograma e pressão intra-arterial (BP) em ratos experimentais, que podem ser feitos com equipamento padrão em instalações de animais e podem ser aplicados a fisiológicos ou farmacológicos estudos para investigar os mecanismos de patogenicidade ou terapêuticos em medicina cardiovascular.

Resumo

Para estudos relacionados à fisiologia cardiovascular ou fisiopatologia, pressão arterial (PA) e eletrocardiograma são parâmetros básicos observacionais. Pesquisa com foco em modelos de doenças cardiovasculares, alvos terapêuticos cardiovasculares ou agentes farmacêuticos requer a avaliação de mudanças de ritmo arteriais sistêmicas da pressão e coração. Em situações onde os sistemas de telemetria de rádio não são disponíveis ou acessíveis, a técnica de cateterização da artéria femoral é uma maneira alternativa para obter medições de BP sistêmicas e gravações de forma de onda de pressão intra-arterial. Esta técnica é econômica e pode ser realizada com equipamento padrão em instalações de animais. No entanto, gravação de pressão arterial invasiva requer canulação de pequenas artérias, que pode ser uma habilidade cirúrgica desafiador. Aqui, apresentamos protocolos passo a passo para a artéria femoral, procedimentos de cateterização. Procedimentos mais importantes incluem a calibração do sistema de aquisição de dados, canulação de dissecção e artéria femoral de tecido e configuração do sistema para gravação de pressão arterial canulação. Procedimentos de gravação de eletrocardiograma de superfície também estão incluídos. Também apresentamos exemplos de gravações de BP de ratos normotensos e hipertensos. Este protocolo permite gravações diretas confiáveis de BP sistêmica com eletrocardiografia simultânea.

Introdução

Pressão arterial (PA) e eletrocardiograma (ECG) são parâmetros básicos de medicina e fisiologia cardiovascular. Modelos animais experimentais foram aplicados extensamente na pesquisa biomédica para várias doenças cardiovasculares, tais como de insuficiência cardíaca hipertensiva¹ e procedimentos para a gravação do ECG e medição de BP pode ser realizada em ratos experimentais.

Existem três métodos para a medição de BP em ratos: canulação intra-arterial (invasiva)², cauda manguito pletismografia (não invasiva)³e radio telemetria (invasiva). A confiabilidade da medição de BP por pletismografia de braçadeira de cauda pode ser afetada por animal manipulação durante a gravação. Por exemplo, a braçadeira de cauda subestima as alterações de BP de núcleo que ocorrem simultaneamente durante a fases de contenção e medição⁴. Radiotelemetria é considerada a melhor técnica de "padrão ouro" para monitorização BP e da frequência cardíaca em acordado e movimentando-se livremente animais⁵. No entanto, desde que o software e hardware de rádio telemetria são caros, canulação intra-arterial é também amplamente utilizada como uma alternativa econômica.

Intra-arterial canulação requer considerável habilidade microcirúrgica mas produz as formas de onda reais da pressão arterial. BP pode ser gravado através de um cateter de solução salina-cheia, inserido na artéria braquial ou radial, femoral. Este método de medição direta de BP invasora requer preparação pré-cirúrgica de animais, anestesia, imobilização dos animais de laboratório, experiência cirúrgica no tecido dissecção e canulação arterial e calibração adequada antes de adquirir a medição .

ECG de superfície roedor é semelhante ao ECG humano. Um rato ECG tem sequências de ondas P e complexos QRS, ondas T, QT intervalos⁶. A onda P, intervalo PR, complexo QRS e ondas T refletem despolarização atrial, condução do impulso da atrial para o nó AV, ventricular despolarização e repolarização, respectivamente. O intervalo QT é definido como o período compreendido entre o início da onda Q o ponto final da onda T onde ele retorna para o iso-elétrica de base¹.

O ECG indica a sístole cardíaca e a diástole fases; Portanto, a gravação simultânea do ECG superfície correlaciona-se com a medição invasiva da BP. Usando uma combinação de metodologias, é possível elucidar alterações fisiopatológicas em um modelo de doença ou os efeitos farmacológicos de uma droga ou terapia em medicina cardiovascular.

Uma cepa de rato (SHR) hipertensos espontâneos tinha sido obtida por endogamia de ratos Wistar com BP alta no Japão. A BP sobe de 5 para 10 semanas de idade e se torna estacionária de 30 a 35 semanas de idade⁷. Ratos Wistar-Kyoto (WKY) tem cerca de 130 mmHg⁷ pressão sistólica e são comumente usados como normo-tensive controle. Nós costumávamos SHR e WKY para demonstrar o resultado da gravação de cateterização intra-arterial BP e ECG.

Protocolo

Todos os experimentos animais descritos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê de Kaohsiung médica da Universidade.

1. animal Care

1. Para evitar a canulação difícil devido ao pequeno tamanho arterial, use ratos com mais de 200 g de peso.
2. Retire o chow da gaiola e ratos rápidos durante a noite.
3. Oferece água ad libidum, a menos que haja um projeto especial e experimental.

2. experimental preparação

1. Obter os seguintes materiais: fórceps com dentes (figura 1A), tesoura cirúrgica (figura 1B), pinças com pontas fina (Figura 1, 1D), pinças com pontas em ângulo (Figura 1E), Buldogue braçadeira vascular (Figura 1F ), corda de seda aproximadamente 20 cm de comprimento (Figura 1), micro tesouras (Figura 1-H), cânula intra-arterial, um tubo estéril de polietileno (PE) com um diâmetro interno de 0,5 mm e um diâmetro exterior de 0,9 mm, 25 a 30 cm de comprimento, ligada uma agulha 26 x 1/2 ' (Figura 1I), duas torneiras de três vias (Figura 1J) para conectar a cânula intra-arterial e as seringas de transdutor (Figura 1 K) e 1 mL de pressão preenchido com soro fisiológico heparinizado (100 UI/mL).
2. Preparação de animais
   1. Anestesia o rato por inalação de isoflurano (colocando os ratos em um 25 x 25 cm x 14 cm indução câmara saturada com isoflurano 4%, seguido pelo uso de cone de nariz com 3% de isoflurano).
      Nota: Se o animal não é suficientemente anestesiado, aumente a taxa de fluxo de isoflurano.
   2. Teste o reflexo de dor por comprimir os dedos dos pés.
   3. Coloque o rato na posição supina sobre uma placa de isopor pre-cut (ou papelão grosso). Fixe as quatro pernas com elásticos para imobilizar o corpo (Figura 2A).
      Nota: Para evitar potencial ruído durante a gravação do ECG, a superfície de colocação não deve ser eletricamente condutiva.
3. Prepare os instrumentos para a gravação de BP e ECG. Incluem uma unidade de entrada analógica para adquirir um computador com software adequado, um transdutor de pressão com um hub compatível, três pistas de eletrocardiograma com ponta de agulha bipolar e sinais.

3. calibração de transdutores de pressão

1. Antes do início da gravação de BP, calibre com um esfigmomanômetro de mercúrio padrão (Figura 1 L).
2. Remova a braçadeira de pressão o esfigmomanômetro e ligue a torneira de três vias do tubo de inflação para o transdutor de pressão (Figura 1 K) do sistema de aquisição de dados.
3. A válvula de escape de ar parafuso no sentido horário. Mantenha os olhos no medidor e o balão de insuflação de bombeamento. Quando o medidor mostra 100 mmHg, alterne a torneira de três vias para se conectar ao transdutor de pressão. Use a 100 mmHg de pressão para a calibração. O fator de conversão para cálculo BP será determinado automaticamente.
4. Libera a pressão apertando a válvula de escape de ar no sentido anti-horário até que a pressão do esfigmomanômetro volta a zero.
5. Repita a etapa 3.2 com pressão de 200 mmHg.
6. Desanexe o transdutor de pressão do esfigmomanômetro de mercúrio.
7. Conecte o transdutor de pressão para a torneira de três vias do cateter PE (Figura 1I).

4. mini cirurgia para canulação da artéria Femoral

1. Identificação do Marco de superfície e excisão da pele (Figura 2)
   1. Identificar a localização da prega inguinal (recuo na junção entre o abdômen e coxa) (linha do tracejado na Figura 2A).
   2. Belisca a camada completa da pele no centro da prega inguinal. O pelo pode ser raspado ou removido do local da incisão com tosquiadeiras elétricas ou um creme depilatório antes da incisão.
   3. Levantar a pele e cortá-lo com a tesoura cirúrgica em uma orientação aproximadamente paralelo a coxa ipsilateral (Figura 2B). O nervo femoral e os vasos estão sob o tecido subcutâneo exposto (Figura 2).
2. Dissecação do tecido para expor a artéria femoral
   1. Disse o tecido usando fórceps com dicas bem, camada por camada. Pare a dissecação ao nível dos vasos femorais. Certifique-se que a dissecação não está ferindo os vasos por baixo.
   2. Cuidadosamente use fórceps (Figura 1 ou 1D) para limpar o tecido mole ao longo do nervo femoral e navios para obter boa observação. O nervo é fibra-like na textura. A veia é roxo escuro e a artéria é pulsátil (Figura 3A).
   3. Use fórceps com pontas em ângulo (Figura 1E) para estender o comprimento exposto da artéria e veia femoral (Figura 3B).
3. Canulação da artéria femoral (Figura 3)
   1. Use fórceps para separar a veia femoral da artéria e aplicar uma pinça bulldog na artéria femoral como cranialmente quanto possível (Figura 3).
   2. Fazer uma gravata solta das duas cordas de seda, um pouco abaixo da braçadeira de buldogue e o outro no terminal do caudal da artéria femoral exposta (Figura 3D).
   3. Faça um pequeno furo no lado ventral da artéria femoral (figura 3E) usando a tesoura micro (Figura 1 H).
   4. Introduza a ponta do cateter através do pequeno orifício PE e avançar o cateter cranialmente.
      Nota: Não aplique torção enquanto avança o cateter de PE. A força de torção pode torcer a artéria femoral e resultar em estenose luminal.
   5. Remova a braçadeira de buldogue após o cateter PE firmemente é avançado para o lúmen da artéria femoral.
      Nota: Mantenha os olhos no cateter de PE enquanto retira a buldogue braçadeira da artéria femoral. A observação de um proc de sangue dentro do cateter PE associado a observação por pulso confirma sua colocação no lúmen arterial.
   6. Aperte a sequência de caracteres de seda superior para fixar a posição do cateter PE.
      Nota: Qualquer tração acidental ou deslocamento do cateter PE pode resultar em sangramento importante.
   7. Aperte a sequência de caracteres de seda inferior para impedir o sangramento do lado caudal da artéria femoral.
4. Confirmação do sucesso da cateterização da artéria femoral
   1. Use uma seringa de 1 mL para injetar 0,1-0,2 mL de soro fisiológico heparinizado na artéria femoral. A resistência na injeção deve ser trivial. Se qualquer resistência óbvia após injeção é reparada, verifique a canulação inteira novamente.
      Nota: Certifique-se as torneiras de três vias são adequadamente antes de aplicar qualquer pressão negativa ou injeção salina dentro da cânula da artéria femoral. Neste ponto do tempo, qualquer injeção no transdutor de pressão vai precisar de uma re-calibração.
   2. Verifique se há qualquer sangramento ao redor do local de canulação. Se não, cobrir o local cirúrgico com uma bola de algodão molhado.

5. a gravação da pressão arterial

1. Depois de um flush suave para o cateter de PE, anexe a torneira de três vias do cateter PE àquele sobre o transdutor de pressão (Figura 4).
2. Certifique-se de que não há nenhuma bolha de ar no sistema de canulação. Verifique também as junções de conexão da torneira de três vias.
3. Começar os dados do sistema de aquisição, com frequência de amostragem de 1.000 Hz para registro das ondas de Pressão Arterial de BP será demonstrado (Figura 6).
4. Permitir que toda a configuração estabilizar pelo menos 3-5 min. Em casos com sinais instáveis, tempo de estabilização pode ser estendido para 15 min.
5. Confira o site de canulação periodicamente para certificar-se de que não há nenhuma hemorragia.
   Nota: Aquando da aquisição de dados de um transdutor de pressão, é importante colocar o transdutor ao nível do coração do animal.

6. ECG de superfície

1. Verifique os três leva do ECG bipolar para certificar-se do positivo, negativo, e eletrodos de referência platina estão intactos.
2. Inserir os contatos por via subcutânea na esquerda foreleg, foreleg certo e certo hindleg (Figura 5).
3. Anexe os hubs de eletrodo para um Custom-Built amplificador de ECG com frequência de amostragem de frequência de 1.000 Hz e filtro de 3 – 500 Hz. ECG manter contatos estacionário durante a gravação. Movimento dos fios ECG pode produzir artefatos e linhas de base instáveis.

7. animal eutanásia após a conclusão do experimento

1. Após a conclusão da BP e ECG gravação, pare o sistema de aquisição. Remova os eletrodos. Ligar a artéria femoral apertando a sequência de caracteres de seda previamente colocado logo após a retirada do cateter de PE.
2. Lugar que os ratos individualmente na câmara de eutanásia visível conectados ao comprimido cilindros de gás dióxido de carbono (CO₂). Sele o topo com segurança.
3. Introduza 100% CO₂ , com uma taxa de preenchimento de cerca de 10% a 30% do volume câmara por minuto.
4. Mantenha os olhos no rato; falta de respiração e cor dos olhos desbotado deve aparecer dentro de min 2−3.
   Nota: Se a cessação do movimento respiratório não ocorrer após 3 min, o sistema deve ser examinado para a taxa de preenchimento de câmara, abastecimento de CO₂ ou vazamentos.
5. Maintain CO₂ fluxo para a câmara por mais de 1 minuto após a respiração cessa.
6. Determinar a prisão cardíaca e respiratória e observe as pupilas fixas e dilatadas para confirmar a morte.
   Nota: Se o rato não está morto, mas em CO₂ narcose, use um método secundário de eutanásia como a toracotomia bilateral.

Resultados

Nós compramos SHR e normotensos ratos Wistar-Kyoto WKY do centro nacional de Animal laboratório (Taipei, Taiwan). Todos os animais foram alojados em uma instalação de temperatura controlada (20−22 ° C) com acesso gratuito à água e chow padrão em um ciclo claro/escuro de 12 h.

Usamos seis semanas de idade 47 ratos e eles foram pesados antes da medição da tensão arterial e ECG. Os traçados representativos de gravaç?...

Discussão

Canulação arterial invasiva permite uma medição altamente precisa de BP. Isso pode ser feito com um tubo de PE, sem a necessidade de um cateter de caro. Medição invasiva BP também pode ser executada simultaneamente com uma gravação do ECG de superfície.

A grande curva de aprendizado para este método é a habilidade experimental necessária para Canule pequenos vasos sanguíneos. Em mãos experientes, a taxa de sucesso para cateterização da artéria femoral pode aproximar de 100%. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene tube	BECTON DICKINSON	427401	internal diameter of 0.5 mm, outer diameter of 0.9 mm
26 G x 1/2"" needle	TERUMO	160426D
Adson Forceps	TOP Line	12-540	12 cm (4.75") Long, Straight, 1 x 2 Teeth
Bulldog vascular clamp	Teleflex	357581	8 mm
Computer	AUSUS	X453M
Exernal analog signal recording device	iWorx	T5141538	This allows the recording of up to three channels of ECG, EMG or EEG as well as GSR (skin conductance) from a single iWire input on the recording Module.
Graefe Forceps	AESCULAP Surgical Instruments	BD312R	MICRO DRESSING FORCEPS, CURVED, SERRATED, 105 mm, 4 1/8
Mecury sphygmomanometer	Spirit	CK-101
Pressure transducer	iWorx	IworxBP100
Semken Forceps	MEDE TECHNIK	10-104	100 mm
Software	LabScribe3
Surgical scissors	HEBU	1714	14.5 cm long
Syringe (1 mL)	TERUMO	160426D
Three-way stopcocks	Cole-Parmer	EW-30600-23
Tipped forceps	World Precision Instruments	504506	11 cm long, 0.1 x 0.06 mm Tips
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086	8.5 cm long, Straight, 0.025 x 0.015 mm Tips, 7mm super fine Blades