Sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia

Resumo

Aqui, apresentamos um método de sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) com as vantagens de tempo de resposta curto, baixo custo e alta taxa de transferência.

Resumo

O aneuploidy cromossomático, uma das causas principais que conduzem à apreensão embrionária do desenvolvimento, à falha da implantação, ou à perda da gravidez, foi poço-documentado em embriões humanos. O teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) é um teste genético que melhora significativamente os desfechos reprodutivos detectando anormalidades cromossômicas de embriões. O sequenciamento de próxima geração (NGS) fornece uma abordagem de alta taxa de transferência e custo-benefício para análise genética e demonstrou aplicabilidade clínica na PGT-A. Aqui, apresentamos um método de NGS baseado em sequenciamento de semicondutores rápido e de baixo custo para a triagem de aneuploidia em embriões. A primeira etapa do fluxo de trabalho é a amplificação total do genoma (WGA) do espécime biópsia do embrião, seguida pela construção da biblioteca de sequenciamento, e seqüenciamento subseqüente no sistema de sequenciamento de semicondutores. Geralmente, para um aplicativo PGT-A, 24 amostras podem ser carregadas e sequenciadas em cada chip gerando 60 − 80 milhões de leituras em um comprimento médio de leitura de 150 pares de base. O método fornece um protocolo refinado para executar a amplificação do modelo e o enriquecimento da biblioteca de sequenciamento, tornando a detecção de PGT-A reprodutível, alta taxa de transferência, econômica e timesaving. O tempo de funcionamento deste sequenciador de semicondutores é de apenas 2 − 4 horas, encurtando o tempo de resposta de receber amostras para emitir relatórios em 5 dias. Todas estas vantagens fazem deste ensaio um método ideal para detectar aneuploidias cromossomáticos de embriões e, assim, facilitar a sua ampla aplicação em PGT-A.

Introdução

A escolha de embriões viáveis de boa qualidade com números normais de cópia cromossômica (euploid) para transferência na reprodução assistida ajuda a melhorar os resultados da gravidez. Tradicionalmente, o sistema de nivelamento morfológico bem estabelecido é amplamente utilizado para a avaliação embrionária devido à sua fácil disponibilidade e natureza não invasiva. No entanto, demonstrou-se que a avaliação morfológica só pode fornecer informações limitadas sobre a qualidade do embrião¹ e o potencial de implantação². Uma razão fundamental é a sua incapacidade na avaliação da composição cromossômica dos embriões.

O aneuploidia cromossomático (número anormal da cópia dos cromossomas) é uma das causas principais que conduzem à apreensão embrionária do desenvolvimento, à falha da implantação ou à perda da gravidez. A ocorrência de aneuploidia tem sido bem documentada em embriões humanos, representando 60% − 70% em embriões de fase de clivagem^3,4 e 50% − 60% em blastocistos⁵. Isso, em certa medida, contribuiu para o gargalo na melhoria da taxa de gestação do tratamento de fertilização in vitro (FIV), que tem mantido em torno de 35% − 40%^6,7. Portanto, a seleção de embriões ADN para transferência é acreditado para ser benéfico para melhorar os resultados da gravidez. Para isso, o teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) tem sido desenvolvido para investigar a viabilidade embrionária utilizando abordagens genéticas. Há um número crescente de ensaios controlados randomizados e estudos de coorte que apoiam o papel crucial da PGT-A. Provou-se que a aplicação de PGT-A diminui a taxa de aborto espontâneo e aumenta a taxa de gravidez clínica e taxa de implantação⁸, taxa de gravidez em curso e taxa de natalidade ao vivo⁹.

Historicamente, os métodos diferentes foram aplicados em PGT-A, tal como A hibridação in situ da fluorescência (peixes), A hibridação genomic comparativa (CGH), o array-CGH, e o polimorfismo único do nucleotide (SNP)-microarray. Estudos prévios indicaram que a PGT-A para embriões em fase de clivagem por FISH produz resultados que são pouco consistentes com aqueles obtidos por triagem cromossômica abrangente (CCS) de blastocistos correspondentes usando 59273array-CGH ou SNP-microarray59273¹⁰. Estas discrepâncias podem ser atribuídas ao mosaicism cromossomático, aos artefatos técnicos dos peixes, ou à Self-correção embrionário de erros cromossomáticos da segregação durante o desenvolvimento¹¹. Tem sido amplamente reconhecido que o uso de biópsias de blastocist trofectoderma (te) para PGT-A baseado em array, como array-CGH ou SNP-microarray, é eficaz para identificar o desequilíbrio cromossômico em embriões^10,12. Recentemente, o sequenciamento de célula única de última geração (NGS) fornece uma abordagem de alta taxa de transferência e custo-benefício para análise genética e demonstrou aplicabilidade clínica no PGT-a^13,14,15, o que o torna um alternativa promissora aos métodos atualmente disponíveis.

Aqui, apresentamos um método NGS baseado em sequenciamento de semicondutores rápido, robusto e de baixo custo para a triagem de aneuploidia em embriões humanos. A primeira etapa do fluxo de trabalho é a amplificação do genoma inteiro (WGA) do espécime biópsia do embrião, usando um jogo de WGA da único-pilha, seguido pela construção da biblioteca de sequenciação, e seqüenciamento subseqüente no sistema de sequenciamento do semicondutor.

Através da detecção dos íons H⁺ que são liberados de cada incorporação de trifosfato de deoxyribonucleosside durante a síntese da costa do ADN, o sistema transfere os sinais químicos (mudança do pH) capturados pelos elementos do semicondutor para dirigir dados digitais , que são interpretados mais na informação da seqüência do ADN. Eliminando a exigência para a deteção ótica cara e as reações de sequenciação complexas, esta química de sequenciação simples reduz o custo total do reagente e encurta o tempo running de sequenciamento em 2 − 4 horas¹⁶. Mais importante, com base nas especificações de desempenho do fabricante, a plataforma de sequenciamento de semicondutores pode gerar até 15 GB de dados de sequenciamento (depende da qualidade da biblioteca) por execução, que é significativamente maior do que alguns dos outros sequenciadores produzindo somente em torno de 3 − 4 dados do GB (com 2 x 75 BP leu o comprimento)¹⁷. Em aplicações clínicas de PGT-A, esta plataforma pode conseguir 24 amostras por a microplaqueta que gera até 80 milhões leituras¹⁷ e pelo menos 1 milhão leituras originais de cada amostra. A profundidade de leitura pode garantir que cada amostra tenha pelo menos 0,05 x de cobertura total do genoma. As vantagens acima desta plataforma fazem-lhe um método ideal da seleção e assim, facilitam suas aplicações largas em PGT-A¹⁸.

Protocolo

A aprovação ética foi concedida pela Universidade conjunta chinesa de Hong Kong ― Comitê de ética em pesquisa clínica do grupo de novos territórios do leste (número de referência: 2010,432). A licença de pesquisa foi aprovada pelo Conselho de tecnologia reprodutiva humana de Hong Kong (número R3004).

1. amplificação do genoma inteiro

1. Antes de começar, verifique o volume de grânulos magnéticos (tabela de materiais) para garantir que não haja menos de 135 μl (com um excesso de 20%) para cada amostra. Mantenha os grânulos magnéticos à temperatura ambiente (RT) durante pelo menos 30 min. Prepare 720 μL (com um excesso de 20%) de 70% de etanol para cada amostra. Equipar um termociclador (tabela de materiais) com tampa aquecida a 105 ° c.
   Nota: o recém-preparado 70% etanol (tabela de materiais) deve ser usado até dentro de três dias.
2. Preparação da amostra
   Nota: na prática rotineira, 5 a 10 células do trofectoderma do blastocisto são biópsia de acordo com a diretriz de prática¹⁹.
   1. Suspender biópsias em 2 μL de 1x fosfato-tampão salino (PBS) em um único tubo da reacção em cadeia do polymerase de 0,2 mL (PCR).
   2. Gire momentaneamente o tubo em um mini centrifugador para 3 s para recolher as gotas.
3. Lise e extração celular
   1. Descongele o amortecedor da extração da pilha (tabela dos materiais) e o amortecedor da diluição da enzima da extração (tabela dos materiais) no gelo, vortex e gire momentaneamente em um mini centrifugador para 3 s antes do uso.
   2. Adicione 3 μL de tampão de extração de células a cada tubo a partir do passo 1.2.2.
   3. Prepare uma mistura mestre de lise celular de 5 μL para cada amostra adicionando 4,8 μL de tampão de diluição da enzima de extração e 0,2 μL de enzima de extração de células (tabela de materiais). Misture bem e alíquota em cada tubo a partir do passo 1.3.2. Vire o tubo suavemente e gire brevemente sobre uma mini centrífuga por 3 s.
      Nota: as pontas não devem tocar no líquido que contem as amostras da pilha ao adicionar a mistura mestra.
   4. Incubar o tubo da etapa 1.3.3 no Thermal cycler com tampa aquecida. Execute o programa com as seguintes configurações: 10 min a 75 ° c, 4 min a 95 ° c, segure a 4 ° c.
4. Pré-amplificação
   1. Descongelar o tampão de pré-amplificação (tabela de materiais) no gelo, vórtice e girar brevemente sobre um mini centrifugador por 3 s antes de usar.
   2. Prepare uma mistura mestra de pré-amplificação de 5 μL para cada amostra adicionando 4,8 μL de tampão de pré-amplificação e 0,2 μL de enzima de pré-amplificação (tabela de materiais). Misture bem e alíquota em cada tubo a partir do passo 1.3.4. Vire o tubo suavemente e gire brevemente sobre uma mini centrífuga por 3 s.
      Nota: as pontas não devem tocar no líquido que contém as amostras de ADN ao adicionar a mistura mestra.
   3. Incubar o tubo no termociclador com tampa aquecida. Execute o programa com as configurações de fluxo: 2 min a 95 ° c; 12 ciclos para 15 s a 95 ° c, 50 s a 15 ° c, 40 s a 25 ° c, 30 s a 35 ° c, 40 s a 65 ° c, 40 s a 75 ° c; Segure a 4 ° c.
5. Amplificação
   1. Descongelar o tampão de amplificação (tabela de materiais) no gelo, vórtice e girar brevemente sobre um mini centrifugador por 3 s antes de usar.
   2. Prepare uma mistura mestre de amplificação de 60 μL para cada amostra adicionando 25 μL de tampão de amplificação, 0,8 μL de enzima de amplificação (tabela de materiais) e 34,2 μL de água livre de NUCLEASE para WGA (tabela de materiais). Misture bem e alíquota em cada tubo da etapa 1.4.3. Vire o tubo suavemente e gire brevemente sobre uma mini centrífuga por 3 s.
   3. Incubar o tubo no termociclador com tampa aquecida. Execute o programa com as seguintes configurações: 2 min a 95 ° c; 14 ciclos para 15 s em 95 ° c, 1 minuto em 65 ° c, 1 minuto em 75 ° c; Segure a 4 ° c.
6. Purificação de a Produtos de WGA
   1. Transfira cada produto de WGA da etapa 1.5.3 em uns tubos 1,5 mL novos. Adicionar 112,5 μL de grânulos magnéticos em cada tubo. Vortex e incubar em RT por 5 min.
      Nota: misture completamente os grânulos magnéticos antes de usar.
   2. Coloque os tubos sobre um suporte magnético (tabela de materiais) durante 3 min até que o sobrenadante fique claro. Descarte todo o sobrenadante sem perturbar os grânulos.
   3. Adicionar 300 μL de 70% de etanol a cada tubo. Gire cada tubo 180 ° para permitir que as esferas corram pelo etanol e gire de volta para a posição original. Descarte todo o sobrenadante depois que as contas se instalaram sem perturbar os grânulos. Repita este passo uma vez.
      Nota: Mantenha o tubo no suporte magnético enquanto gira o tubo horizontalmente.
   4. Gire brevemente cada tubo em um mini centrifugador para 3 s. Coloque os tubos no suporte magnético até que o sobrenadante residual esteja claro. Descarte todo o sobrenadante residual sem perturbar os grânulos. Ar secar as contas em RT por aproximadamente 3 min.
   5. Retire os tubos do suporte magnético e resuma os grânulos secos adicionando 35 μL de tampão Tris-EDTA (TE) baixo (tabela de materiais). Incubar em RT por 5 min.
   6. Coloque os tubos no suporte magnético durante 3 min até que o sobrenadante fique claro. Transfira todo o sobrenadante contendo DNA eluído para novos tubos de 1,5 mL sem perturbar os grânulos.

2. controle de qualidade dos produtos de WGA

1. Quantifique cada produto de WGA purified da etapa 1.6.6 por um ensaio do fluorômetro (tabela dos materiais) de acordo com o manual do fabricante usando 1 μl do produto de WGA como o material de partida.
   Nota: a concentração aceitada do produto de WGA é ≥ 10 ng/μL. Qualquer produto abaixo deste limiar não é recomendado para prosseguir para as próximas etapas.

3. fragmentação de produtos de WGA

1. Antes de começar, pré-aqueça um aquecedor de bloco seco a 37 ° c. Prepare 6 μL (com um excesso de 20%) de 0,5 M de EDTA para cada amostra. Baseado na concentração, alíquota 300 ng do ADN de cada produto purified de WGA na etapa 1.6.6 aos tubos novos do PCR de 0,2 mL e traz o volume a 16 μL com água nuclease-livre para cada tubo.
2. Fragmentação
   1. Prepare uma mistura de reação de fragmentação de DNA (dsDNA) de 4 μL para cada amostra adicionando 2 μL de tampão de reação de fragmentação dsDNA (tabela de materiais) e 2 μL de enzimas de fragmentação dsDNA (tabela de materiais). Misture bem e alíquota em cada tubo da etapa 3,1. Vortex e brevemente girar em um mini centrífuga para 3 s. Incubar os tubos por 25 min a 37 ° c em um ciclador térmico com tampa aquecida.
   2. Adicionar 5 μL de 0,5 M de EDTA imediatamente a cada tubo. Misture bem por vortexing e gire brevemente em um mini centrifugador para 3 s.
3. Purificação e ressuscipensão
   1. Transfira cada produto da etapa 3.2.2 para os novos tubos de 1,5 mL. Adicionar 37,5 μL de grânulos magnéticos a cada tubo. Misture por vertexing e incubar em RT por 5 min.
   2. Purify os produtos conforme descrito a partir do passo 1.6.2 para o passo 1.6.4.
   3. Elute cada produto purificado conforme descrito nas etapas 1.6.5 e 1.6.6 adicionando 32 μL de tampão Low-TE.

4. construção da biblioteca

1. Blunt- e ND r epairment, seleção do tamanho e purificação
   1. Prepare uma mistura de 20 μL de reparação sem corte para cada amostra adicionando 9,5 μL de água livre de nuclease, 10 μL de tampão de reparação final 5x (tabela detubo de materiais a partir do passo 3.3.3. Vortex e brevemente girar em um mini centrífuga para 3 s.
   2. Adicionar 50 μL de grânulos magnéticos a cada tubo a partir do passo 4.1.1. Vortex e incubar em RT por 5 min.
      Nota: misture completamente os grânulos magnéticos antes de usar.
   3. Coloque cada tubo no suporte magnético durante 3 min até que o sobrenadante fique claro. Transfira todo o sobrenadante para os novos tubos de 1,5 mL, onde são adicionados 25 μL de grânulos magnéticos para cada um. Vórtice dos tubos com o sobrenadante transferido e incubar em RT por 5 min.
   4. Purify os produtos nos tubos incubados como descrito da etapa 1.6.2 à etapa 1.6.4.
   5. Elute cada produto purificado conforme descrito nas etapas 1.6.5 e 1.6.6 adicionando 32 μL de tampão Low-TE.
      Nota: Este é um ponto de parada seguro; o ADN purified desta etapa é estável em 4 ° c para não mais do que 24 h.
2. Adaptador l gation e p urification
   1. Prepare uma mistura de ligadura de adaptador de 17 μL para cada amostra adicionando 10 μL de água sem nuclease, 5 μL de tampão de ligase 10x (tabela de materiais), 1 μL de adaptador P1 (tabela de materiais) e 1 μL de ligase de ADN (tabela de materiais). Misture bem por vortexing para 5 s e gire em um mini centrifugador para 15 s, e alíquota em cada tubo da etapa 4.1.5.
   2. Adicione 1 μL de adaptadores (tabela de materiais) a cada tubo a partir da etapa 4.2.1 de acordo com a folha de amostra (arquivo suplementar: folha de amostra para ligadura do adaptador). Vortex e brevemente girar em um mini centrífuga para 3 s. Incubar os tubos em RT (20 − 25 ° c) por 20 min.
   3. Adicionar 75 μL de grânulos magnéticos a cada tubo a partir do passo 4.2.2. Misture por vertexing e incubar em RT por 5 min. Então, purificar os produtos como descrito da etapa 1.6.2 à etapa 1.6.4.
   4. Elute cada produto purificado conforme descrito nas etapas 1.6.5 e 1.6.6 adicionando 15 μL de tampão Low-TE. Transfira todo o sobrenadante contendo DNA eluída para novas tiras de 8 tubos de 0,2 ml.
      Nota: Este é um ponto de parada seguro; o ADN purified desta etapa é estável em 4 ° c para não mais do que 24 h.
3. Amplificação e purificação
   1. Prepare uma mistura mestre de amplificação de 50 μL para cada amostra adicionando 47,5 μL de super Mix (tabela de materiais) e 2,5 μL de mistura de primer (tabela de materiais). Misture bem por vortexing e gire brevemente em um mini centrifugador, e alíquota nas tiras do tubo de 0,2 ml 8 do passo 4.2.4.
   2. Vórtice as tiras por 30 s e gire brevemente sobre uma mini centrífuga por 3 s. Incubar as tiras no termociclador com tampa aquecida. Execute o programa com as seguintes configurações: 20 min a 72 ° c; 5 min a 95 ° c; 10 ciclos para 15 s a 95 ° c, 15 s a 62 ° c, 1 min a 70 ° c; 5 min a 70 ° c; Segure a 4 ° c.
   3. Transfira cada produto da etapa 4.3.2 para os novos tubos de 1,5 mL. Adicionar 97,5 μL de grânulos magnéticos a cada tubo. Misture por vortexing e incubar em RT por 5 min.
   4. Purify os produtos conforme descrito a partir do passo 1.6.2 para o passo 1.6.4.
   5. Elute cada produto purificado conforme descrito nas etapas 1.6.5 e 1.6.6 adicionando 25 μL de tampão Low-TE.

5. controle de qualidade e diluição da biblioteca de DNA

1. Quantifique cada biblioteca de DNA preparada a partir do passo-2 a partir do ensaio do fluorômetro de acordo com o manual do fabricante, utilizando o material de partida para a biblioteca de DNA de 2º μL.
2. A concentração aceita da biblioteca de DNA é ≥ 0,5 ng/μL e a do controle positivo (tabela de materiais) é ≤ 15 ng/μl. Se a concentração do controle positivo variar muito de 15 ng/μL, repita a quantificação do controle positivo até que a concentração esteja próxima de 15 ng/μL. Se a concentração da biblioteca estiver abaixo de 0,5 ng/μL, reinicie a partir da fragmentação (seção 3).
   Nota: Assegure-se de que a concentração do controlo positivo atinja o valor aceite antes de quantificar a biblioteca de ADN.
3. Diluir cada biblioteca para 100 pmol adicionando água sem nuclease. Adicionar 1 μL de biblioteca a n μL de água livre de nuclease; calcular n usando a equação abaixo:
   
   onde Q é a concentração de cada biblioteca medida pelo ensaio do fluorômetro e C é a concentração do controle positivo medido pelo ensaio do fluorômetro.

6. sequenciamento

1. Antes do início, prepare 48 μL (com um excesso de 20%) de NaOH de 1 M para cada amostra e um tubo de 1,5 mL nuclease-livre. Descongelar o buffer de PCR de mistura mestre (tabela de materiais) (2000 μl em volume) em RT. traga as partículasde esfera (tabela de materiais) para RT.
2. Agrupamento de bibliotecas
   1. Vórtice cada biblioteca diluída da etapa 5,3 e gire momentaneamente 4x em um mini centrifugador para 3 s cada vez. Leve 5 μL de cada biblioteca para a piscina no tubo de 1,5 mL sem nuclease. Vórtice da biblioteca mista e brevemente girar em um mini centrífuga para 3 s.
3. Emulsão PCR usando um sistema de emulsão
   1. Adicionar 150 μL de solução de ruptura a 2 novos tubos de recuperação (tabela de materiais). Instale os novos tubos de recuperação, router de recuperação e placa de amplificação.
   2. Misture invertendo o frasco de óleo (tabela de materiais) 3 vezes. Assegure-se de que o óleo e a solução de recuperação (tabela de materiais) estejam pelo menos 2/3 cheios.
   3. Vortex o tampão do PCR da mistura mestra para 30 s e gire momentaneamente sobre um mini centrifugador para 3 s. Vortex as partículas da esfera e a biblioteca misturada da etapa 6.2.1 para 1 minuto e giram momentaneamente em um mini centrifugador para 3 s.
   4. Prepare uma mistura de ligadura de 2400 μL adicionando 172 μL de água sem nuclease, 8 μL de biblioteca mista a partir do passo 6.3.3, 120 μL de mistura enzimática (tabela de materiais) e 100 μl de partículas de esfera para o tubo contendo 2000 μL de tampão de PCR de mistura mestra.
   5. Defina uma pipeta para 800 μL. Carregue a mistura de ligadura da 6.3.4 para o filtro de reacção (tabela de materiais) através da porta de amostra. Utilize uma pipeta 1000P para adicionar 200 μL de óleo de reacção ao filtro de reacção.
   6. Selecione o programa Proton: Ion PI Hi-Q OT2 200 kite, em seguida, selecione o botão assistido para garantir que o dispositivo foi configurado corretamente seguindo as instruções no monitor. Em seguida, clique em Avançar para iniciar o programa.
4. Enriquecimento por um sistema de enriquecimento automático
   1. Quando o programa de PCR de emulsão for concluído, clique em Avançare, em seguida, clique em Spin final para girar por 10 min. Tire os 2 tubos de recuperação depois de clicar em abrir tampa.
   2. Descarte o sobrenadante dos 2 tubos de recuperação até que 100 μL permaneça em cada tubo e rotule de acordo. Misture bem a solução e transfira para um novo tubo de 1,5 mL.
   3. Adicione 200 μL de água sem nuclease a cada tubo de recuperação, lave com pipetagem para cima e para baixo várias vezes e transfira toda a solução para o tubo de 1,5 mL no passo 6.4.2. Repita o passo de lavagem uma vez.
   4. Adicione 200 μL de água sem nuclease a um dos tubos de recuperação e lave-os com pipetagem para cima e para baixo várias vezes. Transfira toda a solução para o outro tubo de recuperação e lave com pipetagem para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, transfira toda a solução para o mesmo tubo de 1,5 mL da etapa 6.4.3. Vórtice do tubo 1,5 mL por 30 s e centrifugador por 8 min a 15.500 x g.
      Nota: o volume total final do produto da emulsão PCR nesta etapa deve ser aproximadamente 1200 μL.
   5. Descarte o sobrenadante no tubo e mantenha 20 μL do produto de PCR de emulsão. Adicionar 80 μL de solução de ressuspensão (tabela de materiais) ao tubo. Misture com pipetagem para cima e para baixo.
   6. Prepare uma solução de derretimento de 320 μL para cada chip adicionando 280 μL de solução de monolaurato de sorbitano de polietileno glicol (tabela de materiais) e 40 μL de NaOH de 1 M.
      Nota: o NaOH de 1 M deve ser armazenado em 4 ° c ou preparado recentemente. Vortex antes de usar.
   7. Vórtice do tubo contendo C1 grânulos (tabela de materiais) para 30 s. Tome 100 μL de grânulos C1 para um novo tubo de 1,5 mL. Coloque o tubo de 1,5 mL no suporte magnético durante 2 min em RT. descarte todo o sobrenadante depois que as contas se instalaram sem perturbar os grânulos.
   8. Adicionar 1 mL de solução de lavagem C1 (tabela de materiais) ao tubo a partir do passo 6.4.7. Vortex por 30 s. Coloque o tubo no suporte magnético por 2 min em RT. descarte todo o sobrenadante depois que as contas se instalaram sem perturbar os grânulos. Ressuscite os grânulos adicionando 130 μL de solução de captura de talão (tabela de materiais).
   9. Sistema de enriquecimento (es) configuração
      1. Carregue a amostra (100 μL de produto do PCR da emulsão) da etapa 6.4.5, os grânulos lavados (130 μL) da etapa 6.4.8, a solução da lavagem de ES (300 μL) (tabela dos materiais), e a solução do derretimento-fora (300 μL) da etapa 6.4.6 na tira de 8 tubos. A ordem de layout é: amostra (tubo 1), grânulos lavados (tubo 2), solução de lavagem ES (tubos 3, 4, 5) e solução de fusão (tubo 7). Mantenha os tubos 6 e 8 vazios.
      2. Coloc a tira de 8 tubos da etapa 6.4.9.1 no ES. Instale uma ponteira de pipeta e um novo tubo de 0,2 mL e inicie o programa.
         Nota: Assegure-se de que a pipetagem funcione normalmente.
   10. Lave as partículas da esfera depois que o enriquecimento é terminado.
       1. Centrifugue o tubo 0,2 mL do passo 6.4.9.2 por 5 min a 15.500 x g. Descarte o sobrenadante e mantenha 10 μL do produto de enriquecimento. Adicionar 200 μL de água sem nuclease ao tubo. Misturar por vortexing.
       2. Centrifugar o tubo de 0,2 mL de 5 min a 15.500 x g. Descarte o sobrenadante e mantenha 10 μL do produto de enriquecimento. Adicionar 90 μL de água sem nuclease ao tubo. Misturar por vortexing.
5. Preparação do molde
   1. Vortex o controle positivo e girar brevemente. Adicione 5 μL de controlo positivo ao modelo de 100 μL (o produto de enriquecimento a partir do passo 6.4.10.2). Vortex e centrifugador por 5 min a 15.500 x g. Descarte o sobrenadante e mantenha 10 μL do modelo.
   2. Adicionar 20 μL de sequenciamento primário (tabela de materiais) e 15 μL de tampão de recozimento (tabela de materiais) para o tubo de modelo a partir do passo 6.5.1. Vórtice do tubo e gire brevemente sobre uma mini centrífuga por 3 s.
   3. Incubar o tubo da etapa 6.5.2 no Thermal cycler com tampa aquecida. Execute o programa com as seguintes configurações: 2 min a 95 ° c, 2 min a 37 ° c, segure a 4 ° c.
   4. Adicionar 10 μL de tampão de carga (tabela de materiais) ao tubo a partir do passo 6.5.3. Misture com pipetagem para cima e para baixo.
6. Inicialização do sequenciador
   1. Verifique a pressão do tanque de gás nitrogênio (pressão total ≥ 500 psi, pressão de saída ≥ 10 psi, Optimum 20-30 psi). Top-up 100 mL de água deionizada (18,2 MΩ) para C1 e C2 tubos (tabela de materiais) e instalá-los para correspondente C1 e C2 posições sobre o sequenciador.
   2. Prepare as soluções W1 (32 μL de NaOH de 1 M) e W3 (40 − 50 mL de buffer w3 [tabela de materiais]). Prepare a solução W2 adicionando 1920 mL de água deionizada (18,2 MΩ), uma garrafa inteira de tampão W2 (tabela de materiais) e 8 − 12 ΜL de NaOH de 1 M, e inverta 4 − 8 vezes para misturar.
      Nota: como a qualidade da água varia geologicamente, ajuste o volume de NaOH de 1 M conforme necessário. O pH inicial de W2 é 5.9 − 6.1, e a escala óptima depois que o ajuste é 7.4 − 7.6. Alterar e instalar novos tubos de reagente e usar recentemente usado chip para lavar.
   3. Prepare os 4 novos tubos vazios do kit de suplemento de sequenciamento (tabela de materiais). Rotule os 4 tubos como dGTP, dCTP, dATP e dTTP, e adicione 70 μL de dGTP, dCTP, dATP ou dTTP (tabela de materiais) ao tubo correspondente (i.e., 70 μl dGTP ao tubo rotulado como dGTP, etc.). Vortex os tubos antes de usar. Instale os tubos nas posições correspondentes designadas no sequenciador (tabela de materiais).
7. Lavagem da microplaqueta
   1. Lave o chip (tabela de materiais) uma vez injetando 100 μl de isopropanol no poço de carga do chip. Retire o líquido expelido do poço oposto.
   2. Lave o chip duas vezes injetando 100 μL de água sem nuclease no poço de carga do chip. Retire o líquido expelido do poço oposto.
   3. Lave o chip uma vez injetando 100 μL de NaOH 0,1 M no poço de carga do chip. Retire o líquido expelido do poço oposto. Incubar em RT por 1 min.
   4. Lave o chip uma vez injetando 100 μL de água sem nuclease no poço de carga do chip. Retire o líquido expelido do poço oposto.
   5. Lave o chip duas vezes injetando 100 μL de isopropanol no poço de carga do chip. Retire o líquido expelido do poço oposto. Seque soprando nitrogênio sobre o chip. Mantenha afastado da luz.
8. Carregamento e sequenciamento de amostras
   1. Misture a amostra de 55 μL da etapa 6.5.4 pipetando para cima e para baixo e carregue a amostra para o poço de carga do chip.
      Nota: manter a ponta da pipeta e o tubo de 0,2 mL PCR utilizado nesta etapa.
   2. Coloque o chip no mini centrifugador da microplaqueta (tabela dos materiais) quando
   3. Prepare dois novos tubos de 1,5 mL para o tampão de recozimento e a solução de rubor. Prepare o tampão de recozimento de 50% adicionando 500 μL de tampão de recozimento e 500 μL de água sem nuclease. Prepare a solução de rubor adicionando 500 μL de tampão de recozimento e 500 μL de 100% 2-propanol.
   4. Prepare dois novos tubos de 1,5 mL e prepare a mistura de espuma misturando 49 μL de tampão de recozimento a 50% e 1 μL de solução de formação de espuma (tabela de materiais) em ambos os tubos.
   5. Defina uma pipeta para 100 μL. faça bolhas introduzindo o ar na mistura de espuma de um dos dois tubos da etapa 6.8.4. Faça > 120 μL de bolhas e mantenha a pipetagem até que não possam ser observadas bolhas visíveis. Carregar 120 μL de bolhas no poço de carga.
      Nota: Certifique-se de que não existem bolhas visíveis pendentes. Caso contrário, iniciá-lo.
   6. Transfira o líquido expelido excessivo da saída bem da etapa 6.8.5 ao poço do carregamento introduzindo com pipting. Não pipeta bolhas. Centrifugue a microplaqueta para 30 s na mini centrifugação da microplaqueta.
   7. Repita a etapa 6.8.5 usando o segundo tubo que contém a mistura de formação de espuma da etapa 6.8.4.
   8. Adicionar 55 μL do tampão de recozimento 50% ao tubo de 0,2 mL mantido no passo 6.8.1. Use a ponta de pipeta mantida na etapa 6.8.1 para pipeta para cima e para baixo. Carregue todos os 55 μL de tampão de recozimento para o poço de carga. Centrifugue a microplaqueta para 30 s na mini centrífuga designada da microplaqueta.
   9. Carregar 100 μL de solução de rubor no poço de carga do chip e descartar o líquido expelido da saída bem. Repita esta etapa de carregamento uma vez.
      Nota: se houver bolhas na microplaqueta, expelir bolhas pequenas por bolhas grandes e nivelar pela solução de nivelamento. Isto pode ser conseguido através da pipetagem de 100 μL de solução de rubor e deixando 5 μL de ar abaixo da solução de rubor. Portanto, quando a pipetagem do μL 105 no chip, o ar irá formar uma grande bolha que pode expulsar as pequenas bolhas, e, em seguida, a grande bolha pode ser expelida pela seguinte solução de rubor.
   10. Carregue 100 μL do tampão de recozimento 50% no poço de carregamento da microplaqueta. Repita esta etapa de carregamento para um total de 3 vezes.
   11. Adicionar 6 μL da enzima de sequenciação em 60 μL do tampão de recozimento 50% num novo tubo de 1,5 mL. Misture com pipetagem para cima e para baixo. Carregue 65 μL desta solução mista no poço de carregamento da microplaqueta. Pipeta lentamente para evitar a formação de espuma.
   12. Mantenha o chip afastado da luz e incubar em RT por 5 min.
   13. Após a incubação, imediatamente carregar o chip para o seqüenciador e clique em iniciar o seqüenciamento executado na tela para iniciar o seqüenciamento.
       Observação: o seqüenciamento de dados brutos e arquivos de controle de qualidade serão carregados automaticamente para a empresa para análise de dados.

Resultados

Com base neste protocolo modificado, a plataforma de sequenciamento de semicondutores foi pela primeira vez, aplicada para PGT-A. Nós testamos em biópsias dos blastômeros da clivagem-fase e dos embriões do Blastocyst-estágio. Sugere-se que as pilhas biópsia submetem-se a WGA o mais cedo possível para impedir toda a degradação do ADN. Um estudo precedente comparou o desempenho de métodos diferentes de WGA e indicou que o método que nós descrevemos aqui teve a melhor uniformidad...

Discussão

Diferente de outras químicas de sequenciamento, o sequenciador descrito aqui usa semicondutores para a detecção de nucleotídeos. A microplaqueta própria é um dispositivo eletrônico que detecte íons de hidrogênio pela incorporação base polymerase-conduzida¹⁷, que permite o tempo de sequenciamento de 2 − 4 h do programa do Proton. Além disso, a microplaqueta é uma microplaqueta do micropoço que permita a localização de uma molécula do alvo, que seja diferente da química de sequen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR tubes, 0.2 mL	Axygen	PCR-02D-C
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0	ThermoFisher	15575020
PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free	ThermoFisher	10010023
1.0 M NaOH (1.0N) solution	SIGMA-ALDRICH	S2567	For Melt-off solution. Molecular grade
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	13-698-791
Ion Plus Fragment Library Kit	ThermoFisher	4471252
ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system	ThermoFisher	4474524
Ion Plus Fragment Library Kit	ThermoFisher	4471252
PicoPLEX WGA Amplification buffer	Rubicon Genomics	R30050	This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Amplification enzyme	Rubicon Genomics	R30050	This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Amplification Plate			In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5
Ion PI Annealing Buffer
MyOne Beads Capture Solution
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument	Agilent	G2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap)			In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	ThermoFisher	65001
PicoPLEX WGA Cell extraction buffer	Rubicon Genomics	R30050	This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme	Rubicon Genomics	R30050	This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion PI Chip Kit v3	ThermoFisher	A26771
Ion Chip Minifuge, 230 V	ThermoFisher	4479673
Ion PI dATP	ThermoFisher	A26772
Ion PI dCTP	ThermoFisher	A26772
Ion PI dGTP	ThermoFisher	A26772
Ion Plus Fragment Library Kit	ThermoFisher	4471252
Ion Plus Fragment Library Kit	ThermoFisher	4471252
ThermoQ–Temperature Dry Bath	TAMAR	HB-T2-A
NEBNext dsDNA Fragmentase	New England Biolabs	M0348L
NEBNext dsDNA Fragmentase	New England Biolabs	M0348L
Ion PI dTTP	ThermoFisher	A26772
Ion OneTouch 2 Instrument	ThermoFisher	INS1005527	ThermoFisher Catalog number: 4474778.
Ion Plus Fragment Library Kit	ThermoFisher	4471252
Ion One Touch ES	ThermoFisher	8441-22	ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5
Ethanol	SIGMA-ALDRICH	51976	This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer	Rubicon Genomics	R30050	This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer	Rubicon Genomics	R30050	This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher	Q33216	This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.
Qubit ds DNA HS Assay kit	ThermoFisher	M2002-02
Qubit Assay Tubes	ThermoFisher	Q32856
Ion PI Foaming Solution	ThermoFisher	A26772
Index for barcoding of libraries	BaseCare		this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)
Ion PI Loading Buffer	ThermoFisher	A26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer	ThermoFisher	4389764
Agencour AMPure XP Kit	Beckman Coulter	A63880
DynaMag-2 magnet (magnetic rack)	ThermoFisher	12321D
Ion PI Master Mix PCR buffer
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge	Micro 17	75002430
Ion Plus Fragment Library Kit	ThermoFisher	4471252
Nuclease-free water	ThermoFisher	AM9922	This can be replaced by other brand.
PicoPLEX WGA Nuclease-free water	Rubicon Genomics	R30050	This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Oil bottle			Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Ion Plus Fragment Library Kit	ThermoFisher	4471252	Extended kit component in Sheet 3
double-strand DNA standard			This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.
PicoPLEX WGA Preamplification buffer	Rubicon Genomics	R30050	This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Preamplification enzyme	Rubicon Genomics	R30050	This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Library Amplification Primer Mix	ThermoFisher	4471252	Extended kit component in Sheet 3
Ion OneTouch Reaction Filter			Extended kit component in Sheet 5
Recovery Router			Extended kit component in Sheet 5
Recovery Tubes			Extended kit component in Sheet 5
ISP Resuspension Solution
Ion Proton	ThermoFisher	DA8600	This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.
Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase	ThermoFisher	A26772
Ion PI Sequencing Primer
server for sequencer	Lenovo	T260
Ion PI Sphere Particles
Platinum PCR SuperMix High Fidelity	ThermoFisher	4471252
Nalgene 25mm Syringe Filters	ThermoFisher	724-2045	Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids.
Ion PI Hi?Q W2 Solution	ThermoFisher	A26772
Ion PI 1X W3 Solution	ThermoFisher	A26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit	ThermoFisher	A30044	Extended kit component in Sheet 2
Ion Plus Fragment Library Kit	ThermoFisher	4471252	Extended kit component in Sheet 3
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization)	ThermoFisher	A26772	Extended kit component in Sheet 4
Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit	ThermoFisher	A26434	Extended kit component in Sheet 5