JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы внедряем метод секвенирования полупроводников для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию (PGT-A) с преимуществами короткого оборота времени, низкой стоимости и высокой пропускной способности.

Аннотация

Хромосомная анеуплоидия, одна из основных причин, приводящих к остановке эмбрионального развития, отказу имплантации или потере беременности, хорошо задокументирована в человеческих эмбрионах. Предимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидию (PGT-A) является генетическим тестом, который значительно улучшает репродуктивные результаты путем выявления хромосомных аномалий эмбрионов. Секвенирование нового поколения (NGS) обеспечивает высокопроизводительный и экономичный подход к генетическому анализу и показало клиническую применимость в PGT-A. Здесь мы представляем быстрый и недорогой полупроводниковый метод NGS для скрининга анеуплоидии у эмбрионов. Первым шагом рабочего процесса является усиление всего генома (WGA) биопсиального образца эмбриона с последующим строительством библиотеки секвенирования и последующим секвенированием по полупроводниковой системе секвенирования. Как правило, для приложения PGT-A 24 образца могут быть загружены и секвенированы на каждом чипе, генерирующем 60-80 миллионов считываний при средней длине чтения 150 базовых пар. Метод обеспечивает усовершенствованный протокол для выполнения усиления шаблона и обогащения библиотеки секвенирования, что делает обнаружение PGT-A воспроизводимым, высокопроизводительным, экономичным и экономичным временем. Время работы этого полупроводникового секвенсора составляет всего 2–4 часа, что сокращает время оборота от получения образцов до выдачи отчетов в течение 5 дней. Все эти преимущества делают этот ассси идеальным методом обнаружения хромосомных анеуплоидий из эмбрионов и, таким образом, облегчают его широкое применение в PGT-A.

Введение

Выбор качественных жизнеспособных эмбрионов с нормальными номерами копий хромосом (euploid) для передачи вспомогательной репродукции помогает улучшить исходы беременности. Традиционно, хорошо зарекомендовавшая себя система морфологического сортировки широко используется для оценки эмбрионов из-за его легкой доступности и неинвазивного характера. Тем не менее, было показано, что морфологическая оценка может предоставить только ограниченную информацию о качестве эмбриона1 и потенциал имплантации2. Одной из основных причин является его неспособность в оценке хромосомного состава эмбрионов.

Хромосомная анеуплоидия (аномальная копия числа хромосом) является одной из основных причин, приводящих к остановке эмбрионального развития, отказу имплантации или потере беременности. Возникновение анеуплоидии было хорошо задокументировано в человеческих эмбрионах, что составляет60%-70% в эмбрионах стадии расщепления 3,4 и 50%-60% в бластоцистах5. Это, в некоторой степени, способствовало узкое место в улучшении беременности скорость в пробирке оплодотворения (ЭКО) лечение, которое поддерживается на уровне около 35% и 40%6,7. Таким образом, выбор euploid эмбрионов для передачи считается полезным для улучшения исходов беременности. С этой целью, предимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидию (PGT-A) было дополнительно разработано для исследования жизнеспособности эмбриона с использованием генетических подходов. Растет число рандомизированных контролируемых исследований и когортных исследований, поддерживающих решающую роль PGT-A. Было доказано, что применение PGT-A снижает частоту выкидыша и увеличивает уровень клинической беременности и имплантацииставка 8, текущий уровень беременности и живой коэффициент рождаемости9.

Исторически сложилось так, что в PGT-A применялись различные методы, такие как флуоресценция на месте гибридизации (FISH), сравнительная геномная гибридизация (CGH), массив-CGH и одиннуклеотидный полиморфизм (SNP)-microarray. Предыдущие исследования показали, что PGT-A для декольте стадии эмбрионов FISH дает результаты, которые плохо согласуются с теми, которые получены путем комплексного хромосомного скрининга (CCS) соответствующих бластоцикторов с использованием 59273array-CGH или SNP-microarray5927310. Эти расхождения можно отнести к хромосомной мозаизме, техническим артефактам FISH или эмбриональной самокоррекции хромосомных ошибок сегрегации при разработке11. Было широко признано, что использование бластоциста трофиктодерма (TE) биопсии для массива на основе PGT-A, таких как массив-CGH или SNP-microarray является эффективным для выявления хромосомного дисбаланса в эмбрионах10,12. В последнее время одноклеточный секвенирование нового поколения (NGS) обеспечивает высокопроизводительный и экономичный подход к генетическому анализу и показало клиническую применимость в PGT-A13,14,15, которые делают его перспективная альтернатива имеющимся в настоящее время методам.

Здесь мы представляем быстрый, надежный и недорогой полупроводниковый метод секвенирования NGS для скрининга анеуплоидии в человеческих эмбрионах. Первым шагом рабочего процесса является усиление всего генома (WGA) биопсии образца эмбриона, с использованием одноклеточного набора WGA, с последующим строительством библиотеки секвенирования и последующим секвенированием полупроводниковой системы секвенирования.

Путем обнаружения ионов H и, которые высвобождаются от каждого дезоксирибонуклеосайдтрифосфата инкорпорации во время синтеза нити ДНК, система передает химические сигналы (изменение рН), захваченных полупроводниковых элементов для направления цифровых данных , которые дополнительно интерпретируются в информацию о последовательности ДНК. Устраняя потребность в дорогостоящем оптическом обнаружении и сложных реакциях секвенирования, эта простая химия секвенирования снижает общую стоимость реагента и сокращает время секвенирования на 2–4 часа16. Что еще более важно, на основе спецификаций производительности производителя, полупроводниковая платформа секвенирования может генерировать до 15 ГБ данных секвенирования (зависит от качества библиотеки) за пробег, что значительно выше, чем некоторые другие секвенсоры производство только около 3'4 ГБ данных (с 2 х 75 bp читать длиной)17. В клинических приложениях PGT-A, эта платформа может достичь 24 образцов на чип генерации до 80 миллионов считывает17 и по крайней мере один миллион уникальных считываний каждого образца. Глубина чтения может гарантировать, что каждый образец имеет по крайней мере 0,05x весь охват генома. Вышеперечисленные преимущества этой платформы делают ее идеальным методом скрининга и, таким образом, облегчают его широкое применение в PGT-A18.

протокол

Этические утверждения было предоставлено Объединенным китайским университетом Гонконга и Новых территорий Восточного кластера клинических исследований комитета по этике (справочный номер: 2010.432). Лицензия на исследования была одобрена Советом по репродуктивным технологиям человека Гонконга (Number R3004).

1. Полное усиление генома

  1. Перед началом, проверьте объем магнитных бусинок(Таблицаматериалов), чтобы убедиться, что есть не менее 135 КЛ (с 20% превышением) для каждого образца. Держите магнитные бусы при комнатной температуре (RT) в течение не менее 30 мин. Подготовьте 720 л (с 20% превышением) 70% этанола для каждого образца. Оборудуйте тепловой циклизатор(Таблица материалов) с нагретой крышкой при 105 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Недавно подготовленный 70% этанола (Таблица материалов) должны быть использованы в течение 3 дней.
  2. Подготовка образцов
    ПРИМЕЧАНИЕ: В обычной практике, от 5 до 10 трофектодерм клетки бластоциста биопсии в соответствии с практикой руководящих принципов19.
    1. Приостановить биопсию в 2 Зл 1x фосфат-буфера солине (PBS) в одной 0,2 мл полимеразы цепной реакции (ПЦР) трубки.
    2. Кратко спина трубки на мини-центрифуги в течение 3 с, чтобы собрать капельки.
  3. Лиза и извлечения клеток
    1. Оттепель буфера извлечения клеток(Таблица материалов) и экстракции фермента разбавления буфера (Таблица Материалов) на льду, вихрь и кратко спина на мини-центрифуги для 3 s перед использованием.
    2. Добавьте 3 зЛ буфера извлечения клеток к каждой трубке со ступени 1.2.2.
    3. Подготовьте мастер-микс из 5 л-клеточного лиза для каждого образца, добавив 4,8 л буфера разбавления фермента экстракционного фермента и 0,2 зЛ фермента экстракции клеток(ТаблицаМатериалов). Хорошо перемешать и aliquot в каждой трубке от шага 1.3.2. Переверните трубку осторожно и кратко спина на мини-центрифуги в течение 3 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: советы не должны касаться жидкости, содержащей образцы клеток при добавлении мастер-микс.
    4. Инкубировать трубку со ступени 1.3.3 в тепловом циклическом цикле с нагретой крышкой. Запустите программу со следующими настройками: 10 мин при 75 градусах по Цельсию, 4 мин при 95 градусах По Цельсию, удерживайте при 4 градусах Цельсия.
  4. Преамплификация
    1. Оттепель буфер амплизации (Таблица материалов) на льду, вихрь и кратко спина на мини-центрифуги для 3 с перед использованием.
    2. Подготовьте мастер-микс предамплификации в размере 5 л для каждого образца, добавив 4,8 л буфера преамплизации и 0,2 л фермента преамплификации(ТаблицаМатериалов). Хорошо перемешать и aliquot в каждой трубке от шага 1.3.4. Переверните трубку осторожно и кратко спина на мини-центрифуги в течение 3 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Советы не должны касаться жидкости, содержащей образцы ДНК при добавлении мастер смеси.
    3. Инкубировать трубку в тепловом циклическом цикле с нагретой крышкой. Запустите программу с плавными настройками: 2 мин при 95 градусах Цельсия; 12 циклов по 15 с при 95 градусах Цельсия, 50 с при 15 градусах Цельсия, 40 с при 25 градусах Цельсия, 30 с при 35 градусах Цельсия, 40 с при 65 градусах Цельсия, 40 с при 75 градусах Цельсия; удерживайте при 4 градусах Цельсия.
  5. Усиления
    1. Оттепель буфер усиления (Таблица материалов) на льду, вихрь и кратко спина на мини-центрифуги для 3 с перед использованием.
    2. Подготовьте мастер-микс для каждого образца, добавив 25 qPlification буфера, 0,8 л фермента усиления(Таблицаматериалов), и 34,2 л воды без нуклеаза для WGA (Таблица материалов). Хорошо перемешать и aliquot в каждой трубке от шага 1.4.3. Переверните трубку осторожно и кратко спина на мини-центрифуги в течение 3 с.
    3. Инкубировать трубку в тепловом циклическом цикле с нагретой крышкой. Запустите программу со следующими настройками: 2 мин при 95 градусах Цельсия; 14 циклов по 15 с при 95 градусах По цельсии, 1 мин при 65 градусах Цельсия, 1 мин при 75 градусах Цельсия; удерживайте при 4 градусах Цельсия.
  6. Очистка - Продукция WGA
    1. Перенесите каждый продукт WGA с шага 1.5.3 на новые трубы 1,5 мл. Добавьте в каждую трубку 112,5 л магнитных шариков. Вихрь и инкубировать на RT в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью смешать магнитные бусы перед использованием.
    2. Поместите трубки на магнитный стенд(Таблица материалов) в течение 3 мин, пока супернатант не станет ясным. Откажитесь от всех супернатантов, не нарушая бисера.
    3. Добавьте 300 кл 70% этанола к каждой трубке. Поверните каждую трубку на 180 градусов, чтобы бусы пробежали через этанол и повернуть обратно в исходное положение. Откажитесь от всех супернатантов после того, как бусы поселились, не нарушая бисера. Повторите этот шаг один раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите трубку на магнитной подставке при повороте трубки горизонтально.
    4. Кратко спина каждой трубки на мини-центрифуги в течение 3 с. Поместите трубки на магнитную подставку, пока остаточный супернатант ясно. Откажитесь от всех остаточных супернатантов, не нарушая бисера. Воздух сушит бусы на RT в течение примерно 3 мин.
    5. Удалите трубки с магнитной подставки и resuspend сушеные бусы, добавив 35 злител низкого Tris-EDTA (TE) буфера (Таблица материалов). Инкубировать на RT в течение 5 мин.
    6. Поместите трубки на магнитную подставку в течение 3 мин, пока супернатант не станет ясным. Перенесите все супернатанты, содержащие элетированную ДНК, на новые трубки 1,5 мл, не нарушая бисера.

2. Контроль качества продукции WGA

  1. Количественно каждый очищенный продукт WGA от шага 1.6.6 флюометрическим анализом(Таблица материалов) согласно руководству производителя, использующего 1 Зл продукта WGA в качестве исходного материала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Принятая концентрация продукта WGA составляет 10 нг/Л. Любой продукт ниже этого порога не рекомендуется переходить к следующим шагам.

3. Фрагментация продуктов WGA

  1. Перед началом разогреть сухой блок обогревателя до 37 градусов по Цельсию. Подготовьте 6 КЛ (с превышением 20%) 0,5 М ЭДТА для каждого образца. Основываясь на концентрации, aliquot 300 нг ДНК от каждого очищенного продукта WGA в шаге 1.6.6 к новым 0.2 mL ПЦР труб и довести объем до 16 Л с нуклеайозом воды для каждой трубки.
  2. Фрагментации
    1. Подготовьте смесь фрагментации фрагментации ДНК (dsDNA) для каждого образца, добавив 2 qL буфера реакции фрагментации dsDNA(Таблицаматериалов) и 2 Зл ферментов фрагментации dsDNA (Таблица Материалов). Хорошо перемешать и aliquot в каждой трубке от шага 3.1. Вихрь и кратко спина на мини-центрифуги в течение 3 с. Инкубировать трубки в течение 25 минут при 37 градусов по Цельсию в тепловой велосипедник с нагретой крышкой.
    2. Немедленно в каждую трубку добавьте 5 л 0,5 М ЭДТА. Хорошо перемешать путем вихря и кратко спина на мини-центрифуги в течение 3 с.
  3. Очистка и повторная система
    1. Перенесите каждый продукт со ступени 3.2.2 в новые трубки 1,5 мл. Добавьте 37,5 л магнитных шариков к каждой трубке. Смешайте с помощью вершины и инкубировать на RT в течение 5 мин.
    2. Очистите продукты, описанные от шага 1.6.2 до шага 1.6.4.
    3. Выясните каждый очищенный продукт, как описано в шагах 1.6.5 и 1.6.6, добавив 32 зЛ буфера с низким уровнем TE.

4. Строительство библиотеки

  1. Блант- e nd г epairment, выбор размера и очищение
    1. Подготовьте 20 юл тупой конец ремонта смесь для каждого образца, добавив 9,5 л безнуточной воды, 10 зл 5x конечного ремонта буфера (Таблица материаловтрубки от шага 3.3.3. Вихрь и кратко спина на мини-центрифуги в течение 3 с.
    2. Добавьте 50 л магнитных бусин к каждой трубке со ступени 4.1.1. Вихрь и инкубировать на RT в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью смешать магнитные бусы перед использованием.
    3. Поместите каждую трубку на магнитную подставку в течение 3 минут, пока супернатант не станет ясным. Перенесите все супернатанты в новые трубки 1,5 мл, где для каждого добавляются магнитные бусины по 25 л. Вихрь трубки с перенесенным супернатантом и инкубировать на RT в течение 5 мин.
    4. Очистите продукты в инкубированных трубках, как описано от шага 1.6.2 до шага 1.6.4.
    5. Выясните каждый очищенный продукт, как описано в шагах 1.6.5 и 1.6.6, добавив 32 зЛ буфера с низким уровнем TE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная точка остановки; очищенная ДНК с этого шага стабильна при 4 градусах По Цельсию не более 24 ч.
  2. Адаптор l igation и р урификация
    1. Подготовьте 17-ю смесь перевязки адаптера для каждого образца, добавив 10 злител воды безнуклеаза, 5 зл 10x буфера лигазэ (Таблица материалов), 1 кЛ адаптера P1 (Таблица Материалов), и 1 Л ЛИЗ дна ligase (Таблица материалов). Хорошо перемешайте, завихряя 5 с и вращайтесь на мини-центрифуге на 15 с, и аликот в каждую трубку от шага 4.1.5.
    2. Добавьте 1 qL адаптеров(Таблица материалов) к каждой трубке от шага 4.2.1 согласно листу образца (Дополнительныйархив: Лист образца для перевязки адаптера). Вихрь и кратко спина на мини-центрифуги для 3 с. Инкубировать трубки на RT (20-25 градусов по Цельсию) в течение 20 минут.
    3. Добавьте 75 л магнитных бусин к каждой трубке со ступени 4.2.2. Смешайте с помощью вершины и инкубировать на RT в течение 5 мин. Затем очистите продукты, описанные от шага 1.6.2 до шага 1.6.4.
    4. Выясните каждый очищенный продукт, как описано в шагах 1.6.5 и 1.6.6, добавив 15 кл.с низким содержанием буфера. Перенесите все супернатанты, содержащие элетированную ДНК, на новые 8-трубные полосы 0,2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная точка остановки; очищенная ДНК с этого шага стабильна при 4 градусах По Цельсию не более 24 ч.
  3. Усиление и очищение
    1. Подготовьте мастер-микс для каждого образца, добавив 47,5 л супермикст (Таблицаматериалов) и 2,5 л грунтового микса (Таблицаматериалов). Хорошо перемешайте путем вихря и кратко спина на мини-центрифуги, и aliquot в 0,2 мл 8-трубки полосы от шага 4.2.4.
    2. Вихрь полоски для 30 с и кратко спина на мини-центрифуги в течение 3 с. Инкубировать полосы в тепловой велосипедс с подогревом крышкой. Запустите программу со следующими настройками: 20 мин при 72 градусах По Цельсию; 5 мин при 95 градусах Цельсия; 10 циклов по 15 с при 95 градусах По цельсии, 15 с при 62 градусах По цельсии, 1 мин при 70 градусах Цельсия; 5 мин при 70 градусах По цельсию; удерживайте при 4 градусах Цельсия.
    3. Перенесите каждый продукт со ступени 4.3.2 на новые трубки 1,5 мл. Добавьте 97,5 л магнитных шариков к каждой трубке. Смешайте вихрем и инкубировать на RT в течение 5 мин.
    4. Очистите продукты, описанные от шага 1.6.2 до шага 1.6.4.
    5. Выясните каждый очищенный продукт, как описано в шагах 1.6.5 и 1.6.6, добавив 25 кл буфера с низким уровнем TE.

5. Контроль качества и разбавление библиотеки ДНК

  1. Количественная каждая подготовленная библиотека ДНК со ступени 4.3.5 по анализу фторометра в соответствии с руководством производителя, используя 2 qL библиотеки ДНК в качестве исходного материала.
  2. Принятая концентрация библиотеки ДНК составляет 0,5 нг/Л, а положительная концентрация(Таблицаматериалов) составляет 15 нг/Л. Если концентрация положительного контроля колеблется слишком сильно от 15 нг/Зл, повторите количественную оценку положительного контроля до тех пор, пока концентрация не будет близка к 15 нг/Л. Если концентрация библиотеки ниже 0,5 нг/Л, перезапустите с фрагментации (раздел 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что концентрация положительного контроля достигает общепринятого значения до количественной оценки библиотеки ДНК.
  3. Разбавить каждую библиотеку до 100 pmol, добавив нуклеаза воды. Добавьте 1 кЛ библиотеки в n ЗЛ безнужной воды; вычислить n с помощью уравнения ниже:
    figure-protocol-12876
    где концентрация каждой библиотеки измеряется фторометром, а С – это концентрация положительного контроля, измеряемого по ассе фторметра.

6. Секвенирование

  1. Перед началом, подготовить 48 л (с 20% превышение) 1 M NaOH для каждого образца и один нуклеайс-бесплатно 1,5 мл трубки. Оттепель мастер смесь пЦР буфера(Таблица материалов) (2000 л в объеме) на RT. Принесите сферы частиц (Таблица материалов) на RT.
  2. Объединение библиотек
    1. Vortex каждый разбавленной библиотеки от шага 5.3 и кратко спина 4x на мини-центрифуги в течение 3 с каждый раз. Возьмите 5 кл. каждой библиотеки, чтобы объединиться в нуклеазе-бесплатно 1,5 мл трубки. Vortex смешанной библиотеки и кратко спина на мини-центрифуги в течение 3 с.
  3. Эмульсионный ПЦР с помощью эмульсионной системы
    1. Добавьте 150 л ломая разрешения к 2 новым прокладки спасения (таблицаматериалов). Установите новые восстановительные трубки, маршрутизатор восстановления и пластину усиления.
    2. Смешайте путем инвертирования масляной бутылки (Таблица материалов) 3 раза. Убедитесь, что как масло, так и решение для восстановления(Таблицаматериалов) заполнены по крайней мере на 2/3.
    3. Vortex мастер смесь пЦР буфер атакжем 30 с и кратко спина на мини-центрифуги для 3 s. Vortex сферы частиц и смешанной библиотеки от шага 6.2.1 в течение 1 мин и кратко спина на мини-центрифуги в течение 3 с.
    4. Подготовьте перевязку на 2400 л, добавив 172 л воды без нуклеаза, 8 qL смешанной библиотеки от шага 6.3.3, 120 л ферментной смеси(Таблицаматериалов), и 100 л частиц сферы в трубку, содержащую 2000 мкм мастер-микс PCR буфера.
    5. Установите пипетку до 800 л. Загрузите перевязочную смесь со ступени 6.3.4 на фильтр реакции(Таблицаматериалов) через порт образца. Используйте пипетку 1000P, чтобы добавить 200 л реакционного масла в реакционный фильтр.
    6. Выберите программу Proton: Ion PI Hi-No OT2 200 Kit, а затем выберите кнопку Assisted, чтобы убедиться, что устройство было настроено правильно, следуя инструкциям на мониторе. Затем нажмите Далее, чтобы начать программу.
  4. Обогащение автоматической системой обогащения
    1. Когда эмульсия PCR программа завершена, нажмите Далее,а затем нажмите Final Spin спина в течение 10 минут. Вынизите 2 трубки восстановления после нажатия Open Lid.
    2. Откажитесь от супернатанта из 2 восстановительных труб оков до тех пор, пока в каждой трубке не останется 100 л, и пометьте соответствующим образом. Хорошо перемешайте раствор и перенесите на новую трубку 1,5 мл.
    3. Добавьте 200 qL безнуточной воды к каждой трубке восстановления, промойте трубой вверх и вниз несколько раз, и перенесите весь раствор на трубку 1,5 мл в шаге 6.4.2. Повторите шаг стирки один раз.
    4. Добавьте 200 кЛ безнужной воды в одну из восстановительных трубок и промойте трубой вверх и вниз несколько раз. Перенесите все растворы в другую восстановительную трубку и промойте трубой вверх и вниз несколько раз. Затем перенесите все растворы на ту же трубку 1,5 мл со ступени 6.4.3. Вихрь 1,5 мл трубки для 30 с и центрифуги в течение 8 мин на 15500 х г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный общий объем эмульсии ПЦР продукта в этом шаге должен быть примерно 1200 л.
    5. Откажитесь от супернатанта в трубке и сохраните 20 зл эмульсионного ПЦР-продукта. Добавьте в трубку 80 кЛ раствора для повторного действия(Таблицаматериалов). Смешайте путем pipetting вверх и вниз.
    6. Подготовьте раствор расплава 320 л для каждого чипа, добавив 280 л полиэтилена гликоля сорбитанского монолауратного раствора(Таблицаматериалов) и 40 л 1 М НаОХ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1 M NaOH должны храниться при 4 градусах по Цельсию или свежеприготовленные. Вихрь перед использованием.
    7. Вихрь трубки, содержащей C1 шарики (Таблица материалов) для 30 с. Возьмите 100 л бисера C1 в новую трубку 1,5 мл. Поместите трубку 1,5 мл на магнитную подставку в течение 2 мин на RT. Отбросьте все супернатанты после того, как шарики поселились, не нарушая шарики.
    8. Добавьте 1 мл раствора для мытья C1(Таблицаматериалов) в трубку со ступени 6.4.7. Vortex в течение 30 с. Поместите трубку на магнитную подставку в течение 2 мин на RT. Отбросьте все супернатанты после того, как шарики поселились, не нарушая бисера. Приостановите действие бисера, добавив 130 л раствора улавливания шарика(Таблицаматериалов).
    9. Система обогащения (ES) настройка
      1. Загрузите образец (100 йл эмульсии ПЦР продукт) с шага 6.4.5, промытые бусы (130 л) от шага 6.4.8, раствор для мытья ES (300 л)(Таблицаматериалов), и раствор расплава (300 л) со ступени 6.4.6 в 8-трубку полосы. Порядок макета: образец (трубка 1), промытые бусы (трубка 2), раствор для мытья ES (трубы 3, 4, 5) и раствор расплава (трубка 7). Держите трубы 6 и 8 пустыми.
      2. Поместите 8-трубку полосы от шага 6.4.9.1 на ES. Установите наконечник пипетки и новую трубку 0,2 мл и запустите программу.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пипетка работает нормально.
    10. Вымойте частицы сферы после завершения обогащения.
      1. Центрифуга 0,2 мл трубки от шага 6.4.9.2 за 5 мин на 15500 х г. Откажитесь от супернатанта и сохраните 10 зл и продукт обогащения. Добавьте в трубку 200 л воды без нуклеазы. Смешайте путем вихря.
      2. Центрифуга 0,2 мл трубки от в течение 5 мин на 15500 х г. Откажитесь от супернатанта и сохраните 10 зл и продукт обогащения. Добавьте в трубку 90 кЛ безнусла. Смешайте путем вихря.
  5. Подготовка шаблона
    1. Vortex положительный контроль и спина кратко. Добавьте 5 qL положительного контроля в шаблон 100 л (продукт обогащения от шага 6.4.10.2). Вихрь и центрифуга в течение 5 мин при 15500 х г. Отбросьте супернатант и сохраните 10 зл и шаблона.
    2. Добавьте 20 злиц из секвенирующей грунтовки(Таблицаматериалов) и 15 зл и 15 зл буфера annealing (Таблицаматериалов) в трубку шаблона от шага 6.5.1. Vortex трубки и кратко спина на мини-центрифуги в течение 3 с.
    3. Инкубировать трубку со ступени 6.5.2 в тепловом циклическом цикле с нагретой крышкой. Запустите программу со следующими настройками: 2 мин при 95 градусах по Цельсию, 2 мин при 37 градусах По Цельсию, удерживайте при 4 градусах Цельсия.
    4. Добавьте 10 кЛ погрузочного буфера(Таблицаматериалов) в трубку со ступени 6.5.3. Смешайте путем pipetting вверх и вниз.
  6. Инициализация секвенсора
    1. Проверьте давление бака азотного газа (общее давление 500 пси, давление выхода 10 пси, оптимальное 20-30 пси). Пополнить 100 мл деионизированной воды (18,2 МЗ) до C1 и C2 труб(Таблица материалов) и установить их на соответствующие позиции C1 и C2 на секвенсор.
    2. Подготовьте решения W1 (32 л из 1 M NaOH) и W3 (40-50 мл буфера W3 -Таблицаматериалов). Приготовьте раствор W2, добавив 1920 мл деионизированной воды (18,2 МЗ), целую бутылку буфера W2(Таблицаматериалов) и 8-12 л из 1 М НаОХ, и инвертировать 4-8 раз для смешивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку качество воды меняется геологически, отрегулируйте объем 1 M NaOH по мере необходимости. Стартовый рН W2 составляет 5,9–6,1, а оптимальный диапазон после регулировки — 7,4–7,6. Изменение и установка новых реагентов труб и использовать в последнее время используется чип для стирки.
    3. Подготовьте 4 новых пустых трубки из набора дополнительных добавок для секвенирования(Таблицаматериалов). Пометьте 4 трубки как dGTP, dCTP, dATP и dTTP, и добавьте 70 зл dGTP, dCTP, dATP, dATP, или dTTP(Таблица материалов) к соответствующей трубке (т.е., 70 l dGTP к трубе, помеченной как dGTP и т.д.). Вихрь трубки перед использованием. Установите трубки в соответствующие позиции, обозначенные на секвенсоре(Таблицаматериалов).
  7. Чип мыть
    1. Вымойте чип(Таблица материалов) один раз путем введения 100 л изопропанола в погрузочно-разгрузочный убор чипа. Удалите выгнанный жидкости из противоположного хорошо.
    2. Вымойте чип дважды, впрыскивая 100 л без нуклеазной воды в погрузочную скважину чипа. Удалите выгнанный жидкости из противоположного хорошо.
    3. Вымойте чип один раз путем введения 100 л 0,1 М НаОХ в загрузку хорошо чипа. Удалите выгнанный жидкости из противоположного хорошо. Инкубировать на RT в течение 1 мин.
    4. Вымойте чип один раз путем введения 100 злицита воды без нуклеазы в погрузочно-разгрузочный колодец чипа. Удалите выгнанный жидкости из противоположного хорошо.
    5. Вымойте чип дважды, впрыскивая 100 л изопропанола в погрузочный колодец чипа. Удалите выгнанный жидкости из противоположного хорошо. Высушите, выпив азот на чип. Держитесь подальше от света.
  8. Загрузка и секвенирование образцов
    1. Смешайте образец 55 л со ступени 6.5.4, повысив вверх и вниз, и загрузите образец к погрузочно-нагрузочной скважине чипа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите кончик пипетки и 0,2 мл ПЦР трубки, используемые в этом шаге.
    2. Поместите чип на чип мини центрифуги (Таблица материалов), когда
    3. Подготовьте две новые трубки длиной 1,5 мл для буфера для аннеалинга и раствора промывки. Подготовьте 50% буфер аналялинга, добавив 500 л буфера annealing и 500 л безнужной воды. Подготовьте раствор промывки, добавив 500 л буфера annealing и 500 л 100% 2-пропанола.
    4. Подготовьте две новые трубки 1,5 мл и подготовьте вспенивающую смесь, смешивая 49 qL 50% буфера annealing и 1 л пеняния раствора(Таблица материалов) в обеих трубках.
    5. Установите пипетку до 100 кл. Сделайте пузыри путем пипетки воздуха в пенообразующую смесь из одной из двух труб от шага 6.8.4. Сделайте 120 л пузырьков и держите пипетку до тех пор, пока не будет видно выдающихся видимых пузырьков. Загрузите 120 л пузырьков в хорошую загрузку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что нет выдающихся видимых пузырьков. В противном случае, начать его снова.
    6. Перенесите чрезмерно исключенную исключенную жидкость от выхода наилучшим образом от шага 6.8.5 к загружать наилучшим образом pipetting. Не пипетки пузыри. Centrifuge чип для 30 с на чип мини-центрифуги.
    7. Повторите шаг 6.8.5 с помощью второй трубки, содержащей пенящейся смесь со ступени 6.8.4.
    8. Добавьте 55 кЛ 50% буфера annealing к трубке 0.2 мл, хранящиеся в шаге 6.8.1. Используйте хранится пипетка отзыв в шаге 6.8.1 к пипетке вверх и вниз. Загрузите все 55 йЛ аннулирования буфера для загрузки хорошо. Centrifuge чип для 30 с на назначенных чип мини центрифуги.
    9. Загрузите 100 л раствора промывки в чип хорошо загружается и отбрасываете отгоняемую жидкость из выхода. Повторите этот шаг загрузки один раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть пузыри в чипе, изгнать небольшие пузыри большими пузырьками и промыть путем промывки решения. Это может быть достигнуто путем пайпетики 100 л раствора промывки и оставляя 5 л воздуха ниже раствора промывки. Таким образом, при трубачизации 105 л в чип, воздух образует большой пузырь, который может изгнать маленькие пузырьки, а затем, большой пузырь может быть исключен следующий раствор промывки.
    10. Загрузите 100 зл из 50% буфера annealing в чип загрузки хорошо. Повторите этот шаг загрузки в общей сложности 3 раза.
    11. Добавьте 6 зЛ секвенирующего фермента в 60 л 50% буфера аннеаля в новую трубку 1,5 мл. Смешайте путем pipetting вверх и вниз. Загрузите 65 зл этого смешанного раствора в скважину для загрузки чипа. Пипетка медленно, чтобы избежать вспенивания.
    12. Держите чип подальше от света и инкубировать на RT в течение 5 минут.
    13. После инкубации немедленно загрузите чип на секвенсор и нажмите Кнопка «Запуск последовательного запуска на экране, чтобы начать секвенирование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование необработанных данных и файлов контроля качества будут автоматически загружены в компанию для анализа данных.

Результаты

На основе этого модифицированного протокола, полупроводниковая платформа секвенирования была впервые применена для PGT-A. Мы тестировали на биопсии как от расщепления стадии бластомеры и бластоциста стадии эмбрионов. Предполагается, что биопсии клетки проходят WGA как ...

Обсуждение

В отличие от других секвенирующих химий, описанный здесь секвенсор использует полупроводник для обнаружения нуклеотидов. Чип сам по себе представляет собой электронное устройство, которое обнаруживает ионы водорода с помощью основанного на полимеразе основание17, которо...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Генеральным исследовательским фондом (Ref No 14162417) из Гонконга, Национальным фондом естественных наук Китая (Ref No 81860272), Основным исследовательским планом Провинциального научно-технического фонда Гуанси (Ref No. AB16380219) и Грант Китайского фонда постдокторской науки (Ref No 2018M630993) из Китая.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PCR tubes, 0.2 mLAxygenPCR-02D-C
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0ThermoFisher15575020
PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ freeThermoFisher10010023
1.0 M NaOH (1.0N) solutionSIGMA-ALDRICHS2567For Melt-off solution. Molecular grade
Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mLFisher Scientific13-698-791
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or
Equivalent 18 MΩ water system		ThermoFisher4474524
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
PicoPLEX WGA Amplification bufferRubicon GenomicsR30050This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Amplification enzymeRubicon GenomicsR30050This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Amplification PlateIn kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5
Ion PI Annealing Buffer
MyOne Beads Capture Solution
Agilent 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentG2939AA
Ion OneTouch Breaking Solution (black cap)In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Dynabeads MyOne Streptavidin C1ThermoFisher65001
PicoPLEX WGA Cell extraction bufferRubicon GenomicsR30050This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.
PicoPLEX WGA Cell extraction enzymeRubicon GenomicsR30050This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion PI Chip Kit v3ThermoFisherA26771
Ion Chip Minifuge, 230 VThermoFisher4479673
Ion PI dATPThermoFisherA26772
Ion PI dCTPThermoFisherA26772
Ion PI dGTPThermoFisherA26772
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
ThermoQ–Temperature Dry BathTAMARHB-T2-A
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348L
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348L
Ion PI dTTPThermoFisherA26772
Ion OneTouch 2 InstrumentThermoFisherINS1005527ThermoFisher Catalog number: 4474778.
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
Ion One Touch ESThermoFisher8441-22ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5
EthanolSIGMA-ALDRICH51976This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution bufferRubicon GenomicsR30050This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.
PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution bufferRubicon GenomicsR30050This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.
Qubit 3.0 FluorometerThermoFisherQ33216This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.
Qubit ds DNA HS Assay kitThermoFisherM2002-02
Qubit Assay TubesThermoFisherQ32856
Ion PI Foaming SolutionThermoFisherA26772
Index for barcoding of librariesBaseCarethis is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)
Ion PI Loading BufferThermoFisherA26772
Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE BufferThermoFisher4389764
Agencour AMPure XP KitBeckman CoulterA63880
DynaMag-2 magnet (magnetic rack)ThermoFisher12321D
Ion PI Master Mix PCR buffer
Sorvall Legend Micro 17 MicrocentrifugeMicro 1775002430
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252
Nuclease-free waterThermoFisherAM9922This can be replaced by other brand.
PicoPLEX WGA Nuclease-free waterRubicon GenomicsR30050This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Ion OneTouch Oil bottleIon PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252Extended kit component in Sheet 3
double-strand DNA standardThis is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.
PicoPLEX WGA Preamplification bufferRubicon GenomicsR30050This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
PicoPLEX WGA Preamplification enzymeRubicon GenomicsR30050This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.
Library Amplification Primer MixThermoFisher4471252Extended kit component in Sheet 3
Ion OneTouch Reaction FilterExtended kit component in Sheet 5
Recovery RouterExtended kit component in Sheet 5
Recovery TubesExtended kit component in Sheet 5
ISP Resuspension Solution
Ion ProtonThermoFisherDA8600This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.
Ion PI Hi?Q Sequencing PolymeraseThermoFisherA26772
Ion PI Sequencing Primer
server for sequencerLenovoT260
Ion PI Sphere Particles
Platinum PCR SuperMix High FidelityThermoFisher4471252
Nalgene 25mm Syringe FiltersThermoFisher724-2045Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids.
Ion PI Hi?Q W2 SolutionThermoFisherA26772
Ion PI 1X W3 SolutionThermoFisherA26772
Ion OneTouch Wash Solution C1
The Ion PGM Hi?Q View Sequencing KitThermoFisherA30044Extended kit component in Sheet 2
Ion Plus Fragment Library KitThermoFisher4471252Extended kit component in Sheet 3
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization)ThermoFisherA26772Extended kit component in Sheet 4
Ion PI Hi?Q OT2 200 KitThermoFisherA26434Extended kit component in Sheet 5

Ссылки

  1. Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).
  2. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
  3. Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. Chromosomal abnormalities in embryos. Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).
  4. Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).
  5. Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).
  6. Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).
  7. Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).
  8. Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
  9. Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).
  10. Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).
  11. Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).
  12. Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90 (11), S36 (2008).
  13. Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).
  14. Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
  15. Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
  16. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).
  17. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  18. Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
  19. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).
  20. Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).
  21. Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).
  22. Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).
  23. Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).
  24. Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).
  25. Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).
  26. Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17 (2), 413-419 (2002).
  27. Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

150PGT AWGA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены