Melhorar o Engraftment de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por uma inibição transitória da atividade da Rho kinase

Resumo

Neste protocolo, podemos demonstrar e elaborar sobre como usar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos para diferenciação e purificação de cardiomiócitos, e ainda, sobre como melhorar sua eficiência de transplante com inibidor de proteína quinase associada a Rho pré-tratamento em um modelo de infarto do miocárdio do camundongo.

Resumo

Um fator crucial na melhoria da eficácia da terapia celular para a regeneração miocárdica é de forma segura e eficiente aumentar a taxa de Engraftment celular. Y-27632 é um inibidor altamente potente da proteína quinase (RhoA/ROCK) associada a Rho, coiled-coil, e é usada para prevenir a apoptose celular induzida por dissociação (anoikis). Nós demonstramos que o pré-tratamento de Y-27632 para os cardiomiócitos pluripotentes induzidos humanos da pilha de haste (hiPSC-CMs^{+ ri}) antes da implantação conduz a uma melhoria da taxa do Engraftment da pilha em um modelo do rato do infarction miocárdico agudo (MI). Aqui, nós descrevemos um procedimento completo da diferenciação, da purificação, e do pré-tratamento da pilha do hiPSC-CMs com Y-27632, assim como a contração resultante da pilha, as medidas transientes do cálcio, e a transplantação em modelos do rato MI. O método proposto fornece um método simples, seguro, eficaz e de baixo custo que aumenta significativamente a taxa de Engraftment celular. Este método não pode somente ser usado conjuntamente com outros métodos para realçar mais a eficiência da transplantação da pilha mas igualmente fornece uma base favorável para o estudo dos mecanismos de outras doenças cardíacas.

Introdução

As terapias baseadas em células-tronco mostraram um potencial considerável como um tratamento para danos cardíacos causados pelo MI¹. O uso de hiPSCs diferenciados fornece uma fonte inesgotável de hiPSC-CMs² e abre a porta para o rápido desenvolvimento de tratamentos inovadores. Entretanto, muitas limitações à tradução terapêutica permanecem, incluindo o desafio da taxa severamente baixa do Engraftment de pilhas implantadas.

Dissociar células com tripsina inicia anoikis³, que só é acelerado uma vez que estas células são injetadas em ambientes agressivos como o miocárdio isquêmico, onde o ambiente hipóxico acelera o curso em direção à morte celular. Das células remanescentes, uma grande proporção é lavada do local de implantação para a corrente sanguínea e se espalhou por toda a periferia. Uma das principais vias apoptóticas é a via RhoA/ROCK⁴. Com base em pesquisas anteriores, a via Rhoa/rock regula a organização citoesquelética actina^5,6, que é responsável pela disfunção celular^7,8. O inibidor da rocha Y-27632 é amplamente utilizado durante a dissociação e passaging de células estéticas e somáticas, para aumentar a adesão celular e reduzir a apoptose celular^9,10,11. Neste estudo, o Y-27632 é usado para tratar o hiPSC-CMs antes da transplantação na tentativa de aumentar a taxa do Engraftment da pilha.

Vários métodos destinados a melhorar a taxa de Engraftment celular, tais como choque térmico e revestimento da matriz de membrana basal¹², foram estabelecidas. Além desses métodos, a tecnologia genética também pode promover a proliferação de cardiomiócitos¹³ ou células não miocárdicas reversas em cardiomiócitos¹⁴. Do ponto de vista da bioengenharia, os cardiomiócitos são semeados em um andaime biomaterial para melhorar a eficiência do transplante¹⁵. Infelizmente, a maioria destes métodos são complicados e dispendiosos. Pelo contrário, o método proposto aqui é simples, econômico e efetivo, podendo ser utilizado como tratamento basal antes do transplante, bem como na conjugação com outras tecnologias.

Protocolo

Todos os procedimentos animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade do Alabama em Birmingham e foram baseados nos institutos nacionais de saúde laboratório de cuidados com os animais e diretrizes de uso (NIH publicação não 85-23).

1. preparação de meios de cultura e placas de cultura

1. Preparação média
   1. Para o meio hiPSC, misture 400 mL de meio basal de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) (tabela de materiais 1) e 100 ml de suplemento HPSC 5x; armazenar a mistura a 4 ° c.
   2. Para RPMI 1640/B27 menos insulina (RB-) médio, misture 500 mL de RPMI 1640 e 10 mL de suplemento B27 menos insulina.
   3. Para o meio RPMI 1640/B27 (RB +), misture 500 mL de RPMI 1640, 10 mL de suplemento B27 e 5 mL de antibiótico de penicilina-estreptomicina (Pen-Strep).
   4. Para o meio de purificação¹⁶, misture 500 ml de no-glucose rpmi 1640, 10 ml de suplemento B27, 5 ml de antibiótico Pen-Strep e 1.000 μl de solução de DL-lactato de sódio (a uma concentração final de 4 mm).
   5. Para solução de neutralização, misture 200 mL de RPMI 1640, 50 mL de soro fetal bovino (FBS), 2,5 mL de antibiótico Pen-Strep e 50 μL de Y-27632 (numa concentração final de 10 μM).
   6. Para o meio de congelação, misture 9 mL de FBS, 1 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) e 10 μL de Y-27632 (numa concentração final de 10 μM).
   7. Para a solução de matriz extracelular (EMS), descongelar a matriz extracelular concentrada (tabela de materiais 1) a 4 ° c até atingir um estado líquido uniformemente consistente. Precool pontas de pipeta e tubos antes de fazer alíquotas de matriz de 350 μL cada um no gelo, e armazenar as alíquotas em-20 ° c. Antes de revestir as chapas, diluir uma alíquota descongelada em 24 mL de meio DMEM/F12 frio-gelado (EMS); Mantenha o EMS em 4 ° c por até 2 semanas.
      Nota: Execute todas as etapas do revestimento no gelo para impedir a solidificação da matriz da membrana do porão.
   8. Para a solução de Tyrode, tome 90% do volume final exigido da água da classe da cultura do tecido, adicione a quantidade apropriada dos seguintes reagentes, e mexa até dissolver. Em seguida, use 1 N NaOH para ajustar o pH para 7,4. Adicione água extra a uma concentração final de 140 mmol/L de cloreto de sódio, 1 mmol/L de cloreto de magnésio, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L de cloreto de potássio, 10 mmol/L de glicose, e 1,8 mmol/L cloreto de cálcio. Esterilizar por filtração, usando uma membrana de 0,22 μm.
2. Revestimento da placa da cultura de pilha
   1. Para placas de cultura hiPSC, aplique 1 mL de EMS a cada poço de uma placa de 6 poços e incubar a placa por pelo menos 1 h a 37 ° c. Aspirar a solução DMEM/F12 antes de semear as células.
   2. Para o revestimento de gelatina, dissolva 0,2 g de pó de gelatina em água de grau de cultura de tecidos para fazer uma solução de 0,2% (w/v). Esterilizar por autoclavagem a 121 ° c, 15 psi por 30 min. Cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 2 mL da solução e incubar por 1 h a 37 ° c. Antes de de as pilhas, aspirar a solução e permitir que a placa seque por pelo menos 1 h na temperatura ambiente dentro da capa da cultura do tecido.

2. manutenção hiPSC e Ddiferenciação de cardiomiócitos

1. Cultura os hiPSCs no meio hiPSC (ver passo 1.1.1) com uma mudança média diária até que as células atinjam 80% – 90% de confluência por poço.
   Nota: Para fins de manutenção, os hiPSCs estão geralmente prontos para a passagem a cada 4 dias.
2. Para a passagem de hiPSCs, aspirar o meio e lavar o poço 1x com 1x fosfato-tampão salino (PBS). Adicionar 0,5 mL de solução de descolamento de células estaminais (tabela de materiais 1) a cada poço e incubar a 37 ° c durante 5 – 7 min.
   Nota: O tempo de incubação depende da densidade das células e da taxa de dissociação, que pode ser observada um microscópio.
3. Neutralize a solução de descolamento de células-tronco com 1 mL de meio hiPSC suplementado com 5 μM Y-27632. Colete a mistura em um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugue o tubo durante 5 min a 200 x g, Aspire o sobrenadante sem perturbar o pellet celular e, em seguida, ressuscitem as células em 1 ml de meio hipsc contendo 5 μm Y-27632.
4. Semente os hiPSCs em um novo EMS-revestido 6-placa bem em uma relação entre 1:6 a 1:18. Mude o meio ao meio do hiPSC sem Y27632 após 24 h.
5. Para congelar as células, Ressuspender os hiPSCs dissociados em meio de congelamento em uma concentração de 0,5 – 1 milhão/500 μL, colocar a suspensão em cryovials e armazená-los em um freezer de-80 ° c. Transferir os frascos congelados para nitrogênio líquido após 24 h.
6. Para diferenciar, substitua o meio hiPSC por 2 mL de RB-meio suplementado com 10 μM de inibidor GSK-3β CHIR99021 (CHIR) em 80% – 90% de confluência celular. Substitua o meio por 3 mL de RB-meio após 24 h e incubar por um adicional de 48 h (dia 3).
7. No dia 3, mude o meio para 3 mL de RB-meio com 10 μM de inibidor de WNT IWR1 para 48 h (dia 5) e, em seguida, substitua o meio com 3 mL de RB-médio e mantenha por 48 h (dia 7).
8. No dia 7, substitua o meio com 3 mL de meio RB e mude o meio a cada 3 dias daqui para frente. A batida espontânea de hiPSC-CMs deve ser observada entre os dias 7 – 10.

3. hiPSC-CMs purificação e pequena molécula pre-tratamento

Nota: Enzimas de dissociação de células recombinantes altamente purificadas (tabela de materiais 1) foram utilizadas para dissociar o hipsc-CMS.

1. No dia 21 após a diferenciação hiPSC-CM, aspirar o meio e lavar as células 1x com PBS estéril. Incubar as células com 0,5 mL de enzimas de dissociação celular por poço por 5 – 7 min a 37 ° c. Pipeta repetidamente a suspensão da pilha usando uma pipeta de 1 mL a fim dissociar completamente as pilhas.
2. Depois que as células são dissociadas, adicione 1 mL de solução de neutralização a cada poço, colete a mistura de células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 200 x g por 3 min. descarte o sobrenadante e resuma as células na solução neutralizadora.
3. Replantar as células em placas de 6 poços revestidas com gelatina a uma densidade de 2 milhões células por poço.
4. Após 24 – 48 h, substitua o meio de cultura por meio de purificação por 3 – 5 dias.
   Nota: A purificação está completa quando mais de 90% das células em cada campo de visão do microscópio estão batendo. Para evitar mais danos aos cardiomiócitos, não prolongue a duração da purificação além de 5 dias. Se a primeira rodada não produzir a pureza necessária, substitua o meio de purificação por meio de RB + por 1 dia e, em seguida, conclua uma segunda rodada de purificação.
5. Antes da transplantação, a cultura as pilhas no grupo do tratamento para 12 h no meio do RB + suplementou com 10 μM Y-27632. Da mesma forma, realizar o tratamento com Verapamil nas células do meio RB + com 1 μM de Verapamil para 12 h (hiPSC-CMs^{+ Ver}).
6. Após o tratamento, lave o hiPSC-CMs 1x com PBS e incubar as células com 0,5 mL de enzimas de dissociação de células por poço para um máximo de 2 min. Pipetar repetidamente a suspensão da célula, utilizando uma pipeta de 1 mL, para separar completamente as células. Neutralize as células com solução neutralizante, colete a mistura de células em um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugue a 200 x g durante 3 min. ressuscitem as células em PBS em uma concentração de 100.000 células/5 μL em preparação para injeção.

4. infarto do miocárdio e transplante de células

Nota: Todos os instrumentos cirúrgicos são saco com autoclave e são mantidos na condição asséptica durante cirurgias múltiplas através de um esterilizador quente do grânulo (tabela dos materiais 2).

1. Anestesiar camundongos NOD/scid (tabela de materiais 2) com isoflurano inalatório (1,5% – 2%). Monitore os níveis de anestesia pelas respostas dos camundongos a uma pitada de dedo do pé. Coloque o veterinário pomada óptica sobre os olhos para impedi-los de secar durante a cirurgia.
2. Forneça 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea para o manejo da dor antes da cirurgia.
3. Posicione e prenda o rato em uma posição supina em uma tabela de funcionamento aquecida, remova o cabelo da região ventral da garganta e do tórax esquerdo usando um creme depilatórios, exponha a pele, e desinfecte-o com álcool de 70%.
4. Corte uma incisão de 0,5 cm no centro do pescoço usando tesouras cirúrgicas, separe a gordura subcutânea com fórceps estéril e exponha a traquéia. Introduzir oralmente a cânula de intubação na traquéia, conectar a cânula a um pequeno ventilador animal e ajustar as configurações de ventilação (ajustar o volume corrente a 100 – 150 μL e a taxa de respiração a 100x – 150x por minuto).
5. Depois que o mouse se estabiliza, corte uma incisão de 0,5 cm no meio da pele do tórax esquerdo. Use fórceps para separar sem rodeios a camada muscular e fazer uma pequena incisão no quinto espaço intercostal para expor a cavidade torácica. Coloque o retractor na incisão para abrir a cavidade torácica e localize a artéria coronária descendente esquerda (LAD). um microscópio cirúrgico de dissecação, ligadura o Lad com um 8-0 sutura não absorvível.
6. Imediatamente após a indução da MI, injete 5 μL de hiPSC-CMs^-ri, hipsc-CMS^{+ ri}, hipsc-CMS^-Ver, hipsc-CMS^{+ Ver}, ou um volume igual de PBS no miocárdio do camundongo em cada local (3 x 10⁵ células/animal, 1 x 10⁵ células/local), um na área do enfarte e dois nas áreas em torno do enfarte.
   Nota: Desde que 5 μL é volume muito pequeno, não é fácil controlar exatamente o volume sugando-o diretamente com uma seringa. A tampa de um prato de Petri estéril pode ser girado sobre, e 5 μL das pilhas podem primeiramente ser depositados na tampa com uma pipeta. Devido à tensão de superfície, não se espalhará mas condensar-se-á em uma massa líquida pequena. Isso pode ser facilmente absorvido e injetado no miocárdio do mouse.
7. Elimine o ar residual na cavidade torácica enchendo-o acima com a solução salina isotônica morna. Costurar as costelas, os músculos e a pele em sequência com uma sutura 6-0 absorvível. Desligue a injeção da anestesia do isoflurano. Mantenha os animais da cirurgia na almofada de aquecimento e observá-los pròxima Quando recuperarem a consciência cheia. Em seguida, coloque os animais em uma gaiola limpa. Não devolva os animais à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.
8. Após a cirurgia, injete os camundongos intraperitonealmente com buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 12 h durante 3 dias consecutivos e injete-os com ibuprofeno (5 mg/kg) a cada 12 h por um dia. Realize estudos de análise subsequentes em pontos de tempo especificados.
   Nota: Siga as diretrizes do Comitê de cuidados com animais locais para analgesia.

5. registro transiente do cálcio e da contractilidade

1. Autoclave de 15 mm de diâmetro (tabela de materiais 2) e pinças em uma taça de vidro pequeno a 121 ° c, 15 psi por 15 min. precool as lamínulas e pinças a 4 ° c.
2. Usando a pinça, coloque a lamínula em uma placa de 12 poços e pipetar 300 μL de matriz extracelular para cada lamínula.
   Nota: Não deixe que a matriz exceda a borda da lamínula para evitar a redução da quantidade de revestimento da matriz. Incubar a placa de 12 poços em uma incubadora da cultura de célula de 37 ° c por 1 h.
3. Aspirar o meio na placa gelatina-revestida de 6 poços com hiPSC-CMs purificado, lave-a 1x com PBS e, em seguida, digerir com 0,5 mL de enzimas de dissociação de células por 1,5 min. Adicione 1 mL de solução de neutralização, pipetar repetidamente para não mais do que 5x – 10x com uma pipeta de 1 mL e centrifugue a mistura a 200 x g durante 3 min.
4. Aspirar a matriz extracelular revestida dos lamínulas. Conte o número da célula e ressuscitem as células na solução de neutralização para uma concentração de 40000/300 μL e, em seguida, adicione 300 μL da suspensão da célula em cada lamínula. Cultura da placa em uma incubadora de 37 ° c.
5. Após 24 h, aspire suavemente a solução neutralizada, adicione 500 μL de meio RB + a cada poço da placa e continue a cultura por 2 dias.
6. Adicionar Y-27632 (10 μM), ativador Rho quinase (RA, 100 nM), verapamil (1 μM), ou um volume igual de PBS no meio de cultura de hiPSC-CMs, 12 h antes de detecção de transiente e contratilidade de cálcio.
   Nota: Além da detecção de transientes e contratilidade de cálcio das células após 12 h de tratamento químico, a detecção desses parâmetros também foi testada em 12, 24, 48 e 72 h após a retirada química.
7. Retire a placa, descarte o meio, e lave a placa 1x com PBS. Mude o meio a um DMEM fenol-vermelho-livre que contem 0, 2% (w/v) do poliol do surfactante (tabela dos materiais 1), do indicador do cálcio de 5 μm (tabela dos materiais 1), e do Y-27632 correspondente (10 μm), ra (100 nanômetro), verapamil (1 μm), ou um volume igual de PBS, e incubar a placa por 30 min a 37 ° c.
8. Descarte o sobrenadante, lave as células 3x com meio DMEM livre de corante e deixe o meio descansar por 30 min para desesterificar o corante de mapeamento.
9. Coloc o lamela pilha-semeado em uma câmara aberta do banho e insira a câmara em um sistema da microincubação equilibrado a 37 ° c com um controlador de temperatura automático (tabela dos materiais 2), perfuse-o com a solução de Tyrode, e adicione continuamente Inibidor da Rho-quinase (RI), ar ou PBS à solução de perfusão.
10. Use um microscópio de fluorescência invertido (tabela de materiais 2) e uma cabeça da exploraçãodo laser (tabela dos materiais 2) para gravar o transiente espontâneo do cálcio empregando uma varredura da linha de x-t, usando um laser do argão de 488 nanômetro para a excitação da tintura e um 515 ± 10 nanômetro filtro de barreira para coletar luz de emissão. Registre a contração espontânea de hiPSC-CMs usando a funcionalidade de contraste de interferência diferencial do microscópio confocal (tabela de materiais 2).
    Nota: As gravações transientes de cálcio foram processadas e analisadas com o uso do software MATLAB R2016A (tabela de materiais 4). Os ensaios de mudança de contração celular foram realizados utilizando-se o software ImageJ (tabela de materiais 4).

Resultados

O hiPSC-CMs usado neste estudo foi derivado da origem humana com o gene do repórter do luciferase; Conseqüentemente, a taxa de sobrevivência das pilhas transplantadas in vivo foi detectada pela imagem latente do bioluminescência (bli)¹⁷ (Figura 1a, B). Para as seções histológicas do coração, a troponina cardíaca humana-específica T (hctnt) e o antígeno nuclear humano (HNA) pilhas dobro-positivas foram class...

Discussão

Os principais passos deste estudo incluem a obtenção de Hisc-CMs puro, melhorando a atividade do hiPSC-CMs através do pré-tratamento Y-27632 e, finalmente, transplantar uma quantidade exata de hiPSC-CMs em um modelo de MI do mouse.

As principais questões abordadas aqui foram que, primeiro, otimizamos os métodos de purificação sem glicose¹⁹ e estabelecemos um novo sistema de purificação eficiente. O procedimento de sistema incluiu a aplicação de enzimas de di...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Accutase (stem cell detachment solution)	STEMCELL Technologies	#07920
B27 minus insulin	Fisher Scientific	A1895601
B27 Supplement	Fisher Scientific	17-504-044
CHIR99021	Stem Cell Technologies	72054
DMEM (1x), high glucose, HEPES, no phenol red	Thermofisher	20163029
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S11150
Fluo-4 AM (calcium indicator)	Invitrogen/Thermofisher	F14201
Glucose-free RPMI 1640	Fisher Scientific	11879020
IWR1	Stem Cell Technologies	72562
Matrigel (extracellular matrix )	Fisher Scientific	CB-40230C
mTeSR (human pluripotent stem cells medium)	STEMCELL Technologies	85850
Pen-strep antibiotic	Fisher Scientific	15-140-122
Pluronic F-127 (surfactant polyol)	Sigma-Aldrich	P2443
Rho activator II	Cytoskeleton	CN03
RPMI1640	Fisher Scientific	11875119
Sodium DL-lactate	Sigma-Aldrich	L4263
TrypLE (cell-dissociation enzymes)	Fisher Scientific	12-605-010
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Y-27632	STEMCELL Technologies	72304
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Supplies
IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments	PerkinElmer	CLS136334
15 mm Coverslips	Warner	CS-15R15
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Confocal Microscope	Olympus	IX81
Cryostat	Thermo Scientific	NX50
Dual Automatic Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344B
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	1645050
Fluoresence Microscope	Olympus	IX83
High Speed Camera	pco	1200 s
Laser Scan Head	Olympus	FV-1000
Low Profile Open Bath Chamber (mounts into above microincubation system)	Warner Instruments	RC-42LP
Microincubation System	Warner Instruments	DH-40iL
Minivent Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	845
NOD/SCID mice	Jackson Laboratory	001303
Precast Protein Gels	BIO-RAD	4561033
PVDF Transfer Packs	BIO-RAD	1704156
Trans-Blot System	BIO-RAD	Trans-Blot Turbo
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab198580
Cardiac Troponin T	R&D Systems	MAB1874
Cardiac Troponin C	Abcam	ab137130
Cardiac Troponin I	Abcam	ab47003
Cy5-donkey anti-mouse	Jackson ImmunoResearch Laboratory	715-175-150
Cy3-donkey anti-rabbit	Jackson ImmunoResearch Laboratory	711-165-152
Fitc-donkey anti-mouse	Jackson ImmunoResearch Laboratory	715-095-150
GAPDH	Abcam	ab22555
Human Cardiac Troponin T	Abcam	ab91605
Integrin β1	Abcam	ab24693
Ki67	EMD Millipore	ab9260
N-cadherin	Abcam	ab18203
Phospho-Myosin Light Chain 2	Cell Signaling Technology	3671s
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Matlab	MathWorks	R2016A
ImageJ	NIH	1.52g